一种检测新型冠状病毒的LAMP引物组合和试剂盒的制作方法

本发明涉及病毒检测领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒。

背景技术：

2019年12月，武汉出现不明原因的重症肺炎，病例临床表现主要为发热，少数病例呼吸困难，胸片呈双肺浸润性病灶。引发该疾病的病原既不是流感、禽流感、腺病毒、严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)，也不是中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)等呼吸道病原体，而是一种新型冠状病毒2019-ncov。目前武汉确诊多例不明原因病毒性肺炎患者，患者主要是武汉市华南海鲜批发市场的经营及采购人员，虽然目前的没有明确证据表明：这种病毒易于在人与人之间传播，但一旦被感染，患者的死亡风险极高，因此早期、快速明确诊断，及时采取相应的干预和治疗，对于患者病情的有效控制具有重要意义，此外，及时的明确诊断可以避免不必要的社会恐慌，有利于社会的稳定。

此新型冠状病毒基因序列信息已经公布(genbank，mn908947)，如seqidno:1所示，为其诊断工具的的开发奠定了前期基础。

环介导恒温扩增(lamp)根据链置换dna聚合酶的扩增特性以及特异性引物(针对靶序列6个区域设计的4条特异性引物)，利用链置换dna聚合酶保证引物在等温条件下顺利与模板结合并进行扩增反应，与聚合酶链式反应有等同的特异性和灵敏度，可实现在恒温条件下的连续快速扩增，同时还可添加环引物，提高扩增效率。

因此，将lamp技术应用于此新型冠状病毒的检测，可准确高效地对相关疾病进行诊断，也便于对该新型冠状病毒的研究。

技术实现要素：

本发明为解决现有技术中的上述问题提出的一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明的第一个方面是提供一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合，选自如seqidno:3～seqidno:6所示的引物组1、如seqidno:7～seqidno:10所示的引物组2、如seqidno:11～seqidno:14所示的引物组3、如seqidno:15～seqidno:18所示的引物组4、如seqidno:19～seqidno:22所示的引物组5、如seqidno:24～seqidno:27所示的引物组6、如seqidno:28～seqidno:31所示的引物组7、如seqidno:32～seqidno:35所示的引物组8中的任一种或几种。

本发明的第二方面是一种检测新型冠状病毒的lamp试剂盒，包括上述lamp引物组合。

进一步地，引物的浓度为80-110μm。

进一步地，引物的浓度为100μm。

进一步地，上述lamp试剂盒还包括反应缓冲液、bsstdna聚合酶、sybr/中性红染料、dna模板和双蒸水。

进一步地，反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20。

本发明的第三方面提供了利用上述试剂盒检测该新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：

步骤1，提取纯化待测样品的dna；

步骤2，配制lamp反应体系，进行环介导等温扩增反应；

步骤3，结果判断。

进一步地，步骤2中的反应体系的体积为30μl，包括如下体积的试剂：反应缓冲液20μl、引物各0.05μl、bsstdna聚合酶1μl、sybr/中性红染料1μl、dna模板4μl、余量为双蒸水。

进一步地，环介导等温扩增反应的条件为55～70℃，30～60min。

进一步优选地，环介导等温扩增反应的条件为63～68℃，60min。

进一步更优选地，环介导等温扩增反应的条件为65℃，60min。

进一步地，环介导等温扩增反应所采用的设备为普通pcr仪、实时pcr仪或恒温金属浴。

本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：

本发明提供的一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合是针对该新型冠状病毒2019-ncov的两段靶片段而设计的，特异性强。本发明还提供的一种检测新型冠状病毒的lamp试剂盒将上述引物组合与lamp技术结合，不但可以通过肉眼观察到检测结果，无需复杂的辅助设备，简单易用，而且可通过荧光染料法实现检测结果半定量，检测灵敏度高，为该新型冠状病毒相关疾病的诊断以及治疗药物的研究提供了便利而快速的手段。

附图说明

图1为本发明一实施例中的目视染料法检测新型冠状病毒2019-ncov的结果；

图2为本发明一实施例中的荧光染料法检测新型冠状病毒2019-ncov的扩增曲线(从左到右依次为a、b、c、d、e样品的扩增曲线)。

具体实施方式

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒。

下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。

实施例1

一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合，选自如seqidno:3～seqidno:6所示的引物组1、如seqidno:7～seqidno:10所示的引物组2、如seqidno:11～seqidno:14所示的引物组3、如seqidno:15～seqidno:18所示的引物组4、如seqidno:19～seqidno:22所示的引物组5、如seqidno:24～seqidno:27所示的引物组6、如seqidno:28～seqidno:31所示的引物组7、如seqidno:32～seqidno:35所示的引物组8中的任一种或几种。

上述引物组1-5是针对该新型冠状病毒2019-ncov靶序列片段[22713-22361]而设计的，其片段序列信息如seqidno:2所示。

上述引物组6-8是针对该新型冠状病毒2019-ncov靶序列片段[30001-30473]而设计的，其片段序列信息如seqidno:23所示。

实施例2

一种检测新型冠状病毒的lamp试剂盒，包括如实施例1所述的lamp引物组合，引物的浓度为100μm。

该检测新型冠状病毒的lamp试剂盒还包括反应缓冲液、bsstdna聚合酶、sybr/中性红染料、dna模板和双蒸水；其中，反应缓冲液包括tris-hcl、kcl、(nh4)2so4、mgso4和tween-20。

实施例3

利用实施例2的lamp试剂盒诊断该新型冠状病毒的方法，包括如下步骤：

步骤1，提取纯化待测样品的dna；

步骤2，配制lamp反应体系(如表1所示)，在65℃的恒温金属浴进行环介导等温扩增反应60min；

步骤3，结果判断：根据颜色或者扩增曲线。

表130μllamp反应体系的配制

验证实施例

本验证实施例验证采用实施例1中的引物组或实施例2中的试剂盒检测该新型冠状病毒的效果，包括如下内容：

1.扩增样本的情况

1)梯度浓度的新型冠状病毒质粒模拟样本，具体浓度为a：10⁷copies/ml的模拟样本，b：10⁶copies/ml的模拟样本，c：10⁵copies/ml的模拟样本，d：10⁴copies/ml的模拟样本，e：10³copies/ml的模拟样本。

2)其他类型的样本：f：人的基因组dna样本，g：sars质粒模拟样本，h：阴性对照样本。

2.按照实施例3的方法的步骤对该新型冠状病毒进行检测，结果如图1和图2所示；其中，当采用实时荧光曲线法时，反应体系选用sybr；当采用目视法时，反应体系选用的是中性红染料。

由图1和图2可知，目视然染料法与荧光曲线法的结果一致，a、b、c、d、e为阳性，检测灵敏度可达到10³copies/ml。

综上所述，本发明提供一种检测新型冠状病毒的lamp引物组合和试剂盒检测灵敏，特异性强。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110>复旦大学附属华山医院

<120>一种用于新型冠状病毒快速检测的lamp试剂盒

<160>35

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>30473

<212>dna

<213>2019-ncov的基因序列

<400>1

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catctacaataaaattgttgatgagcctgaagaacatgtccaaattcacacaatcgacgg26160

ttcatccggagttgttaatccagtaatggaaccaatttatgatgaaccgacgacgactac26220

tagcgtgcctttgtaagcacaagctgatgagtacgaacttatgtactcattcgtttcgga26280

agagacaggtacgttaatagttaatagcgtacttctttttcttgctttcgtggtattctt26340

gctagttacactagccatccttactgcgcttcgattgtgtgcgtactgctgcaatattgt26400

taacgtgagtcttgtaaaaccttctttttacgtttactctcgtgttaaaaatctgaattc26460

ttctagagttcctgatcttctggtctaaacgaactaaatattatattagtttttctgttt26520

ggaactttaattttagccatggcagattccaacggtactattaccgttgaagagcttaaa26580

aagctccttgaacaatggaacctagtaataggtttcctattccttacatggatttgtctt26640

ctacaatttgcctatgccaacaggaataggtttttgtatataattaagttaattttcctc26700

tggctgttatggccagtaactttagcttgttttgtgcttgctgctgtttacagaataaat26760

tggatcaccggtggaattgctatcgcaatggcttgtcttgtaggcttgatgtggctcagc26820

tacttcattgcttctttcagactgtttgcgcgtacgcgttccatgtggtcattcaatcca26880

gaaactaacattcttctcaacgtgccactccatggcactattctgaccagaccgcttcta26940

gaaagtgaactcgtaatcggagctgtgatccttcgtggacatcttcgtattgctggacac27000

catctaggacgctgtgacatcaaggacctgcctaaagaaatcactgttgctacatcacga27060

acgctttcttattacaaattgggagcttcgcagcgtgtagcaggtgactcaggttttgct27120

gcatacagtcgctacaggattggcaactataaattaaacacagaccattccagtagcagt27180

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ggttactatagcagagatattactaattattatgaggacttttaaagtttccatttggaa27300

tcttgattacatcataaacctcataattaaaaatttatctaagtcactaactgagaataa27360

atattctcaattagatgaagagcaaccaatggagattgattaaacgaacatgaaaattat27420

tcttttcttggcactgataacactcgctacttgtgagctttatcactaccaagagtgtgt27480

tagaggtacaacagtacttttaaaagaaccttgctcttctggaacatacgagggcaattc27540

accatttcatcctctagctgataacaaatttgcactgacttgctttagcactcaatttgc27600

ttttgcttgtcctgacggcgtaaaacacgtctatcagttacgtgccagatcagtttcacc27660

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caagaatgtagtttacagtcatgtactcaacatcaaccatatgtagttgatgacccgtgt28020

cctattcacttctattctaaatggtatattagagtaggagctagaaaatcagcaccttta28080

attgaattgtgcgtggatgaggctggttctaaatcacccattcagtacatcgatatcggt28140

aattatacagtttcctgtttaccttttacaattaattgccaggaacctaaattgggtagt28200

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ttagatttcatctaaacgaacaaactaaaatgtctgataatggaccccaaaatcagcgaa28320

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aacgcagtggggcgcgatcaaaacaacgtcggccccaaggtttacccaataatactgcgt28440

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ctgctaacaatgctgcaatcgtgctacaacttcctcaaggaacaacattgccaaaaggct28800

tctacgcagaagggagcagaggcggcagtcaagcctcttctcgttcctcatcacgtagtc28860

gcaacagttcaagaaattcaactccaggcagcagtaggggaacttctcctgctagaatgg28920

ctggcaatggcggtgatgctgctcttgctttgctgctgcttgacagattgaaccagcttg28980

agagcaaaatgtctggtaaaggccaacaacaacaaggccaaactgtcactaagaaatctg29040

ctgctgaggcttctaagaagcctcggcaaaaacgtactgccactaaagcatacaatgtaa29100

cacaagctttcggcagacgtggtccagaacaaacccaaggaaattttggggaccaggaac29160

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ttttgctgaataagcatattgacgcatacaaaacattcccaccaacagagcctaaaaagg29400

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ctcgtaactacatagcacaagtagatgtagttaactttaatctcacatagcaatctttaa29700

tcagtgtgtaacattagggaggacttgaaagagccaccacattttcaccgaggccacgcg29760

gagtacgatcgagtgtacagtgaacaatgctagggagagctgcctatatggaagagccct29820

aatgtgtaaaattaattttagtagtgctatccccatgtgattttaatagcttcttcctgg29880

gatcttgatttcaacagcctcttcctcatactattctcaacactactgtcagtgaacttc29940

taaaaatggattctgtgtttgaccgtaggaaacatttcagtattccttatctttagaaac30000

ctctgcaactcaagtgtctctgccaaagagtcttcaaggtaatgtcaaataccataacat30060

attttttaagtttttgtatacttcctaggaatatatgtcatagtatgtaaagaagatctg30120

attcatgtgatctgtactgttaagaaacacttcaaaggaaaacaacctctcatagatctt30180

caaatcctgttgttcttgagttggaatgtacaatattcaggtagagatgctggtacaaaa30240

aaagactgaatcatcaggctattagaaagataaactaggcctctaacatagtaactttaa30300

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agggctatggcatctttttgtaaaaataaggaaagcaaggttttttgataatc30473

<210>2

<211>577

<212>dna

<213>靶序列片段【22713-22361】

<400>2

ctcagttttacattcaactcaggacttgttcttacctttcttttccaatgttacttggtt60

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atttaatgatggtgtttattttgcttccactgagaagtctaacataataagaggctggat180

ttttggtactactttagattcgaagacccagtccctacttattgttaataacgctactaa240

tgttgttattaaagtctgtgaatttcaattttgtaatgatccatttttgggtgtttatta300

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ttgcacttttgaatatgtctctcagccttttcttatggaccttgaaggaaaacagggtaa420

tttcaaaaatcttagggaatttgtgtttaagaatattgatggttattttaaaatatattc480

taagcacacgcctattaatttagtgcgtgatctccctcagggtttttcggctttagaacc540

attggtagatttgccaataggtattaacatcactagg577

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>组合1f3序列

<400>3

tcaactcaggacttgttctt20

<210>4

<211>18

<212>dna

<213>组合1b3序列

<400>4

ggactgggtcttcgaatc18

<210>5

<211>46

<212>dna

<213>组合1fip序列

<400>5

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<210>6

<211>42

<212>dna

<213>组合1bip序列

<400>6

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<210>7

<211>21

<212>dna

<213>组合2f3序列

<400>7

caggacttgttcttacctttc21

<210>8

<211>24

<212>dna

<213>组合2b3序列

<400>8

ttattaacaataagtagggactgg24

<210>9

<211>46

<212>dna

<213>组合2fip序列

<400>9

aggacagggttatcaaacctcttagcaatgttacttggttccatgc46

<210>10

<211>46

<212>dna

<213>组合2bip序列

<400>10

atgatggtgtttattttgcttccacaagtagtaccaaaaatccagc46

<210>11

<211>23

<212>dna

<213>组合3f3序列

<400>11

ctttcttttccaatgttacttgg23

<210>12

<211>25

<212>dna

<213>组合3b3序列

<400>12

gactttaataacaacattagtagcg25

<210>13

<211>47

<212>dna

<213>组合3fip序列

<400>13

catcattaaatggtaggacagggttttccatgctatacatgtctctg47

<210>14

<211>41

<212>dna

<213>组合3bip序列

<400>14

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<210>15

<211>21

<212>dna

<213>组合4f3序列

<400>15

ccatgctatacatgtctctgg21

<210>16

<211>20

<212>dna

<213>组合4b3序列

<400>16

aaacacccaaaaatggatca20

<210>17

<211>45

<212>dna

<213>组合4fip序列

<400>17

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<210>18

<211>50

<212>dna

<213>组合4bip序列

<400>18

actactttagattcgaagacccagtgactttaataacaacattagtagcg50

<210>19

<211>18

<212>dna

<213>组合5f3序列

<400>19

gtctctgggaccaatggt18

<210>20

<211>20

<212>dna

<213>组合5b3序列

<400>20

aaacacccaaaaatggatca20

<210>21

<211>48

<212>dna

<213>组合5fip序列

<400>21

ttagacttctcagtggaagcaaaatctaagaggtttgataaccctgtc48

<210>22

<211>50

<212>dna

<213>组合5bip序列

<400>22

actactttagattcgaagacccagtgactttaataacaacattagtagcg50

<210>23

<211>473

<212>dna

<213>靶片段【30001-30473】

<400>23

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attttttaagtttttgtatacttcctaggaatatatgtcatagtatgtaaagaagatctg120

attcatgtgatctgtactgttaagaaacacttcaaaggaaaacaacctctcatagatctt180

caaatcctgttgttcttgagttggaatgtacaatattcaggtagagatgctggtacaaaa240

aaagactgaatcatcaggctattagaaagataaactaggcctctaacatagtaactttaa300

cagtttgtacttatacatattttcacattgaaatatagttttattcatgactttttttgt360

tttagcttctctgtcttccattatttcaagctgctaaaaattaaaaatatcctatagcaa420

agggctatggcatctttttgtaaaaataaggaaagcaaggttttttgataatc473

<210>24

<211>25

<212>dna

<213>组合6f3序列

<400>24

gtcatagtatgtaaagaagatctga25

<210>25

<211>25

<212>dna

<213>组合6b3序列

<400>25

actgttaaagttactatgttagagg25

<210>26

<211>49

<212>dna

<213>组合6fip序列

<400>26

ccaactcaagaacaacaggatttgatgtgatctgtactgttaagaaaca49

<210>27

<211>50

<212>dna

<213>组合6bip序列

<400>27

acaatattcaggtagagatgctggtagtttatctttctaatagcctgatg50

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>组合7f3序列

<400>28

agatctgattcatgtgatctgt22

<210>29

<211>25

<212>dna

<213>组合7b3序列

<400>29

actgttaaagttactatgttagagg25

<210>30

<211>48

<212>dna

<213>组合7fip序列

<400>30

ccaactcaagaacaacaggatttgactgttaagaaacacttcaaagga48

<210>31

<211>50

<212>dna

<213>组合7bip序列

<400>31

acaatattcaggtagagatgctggtgtttatctttctaatagcctgatga50

<210>32

<211>22

<212>dna

<213>组合8f3序列

<400>32

tgattcatgtgatctgtactgt22

<210>33

<211>25

<212>dna

<213>组合8b3序列

<400>33

actgttaaagttactatgttagagg25

<210>34

<211>46

<212>dna

<213>组合8fip序列

<400>34

gtacattccaactcaagaacaacagacacttcaaaggaaaacaacc46

<210>35

<211>46

<212>dna

<213>组合8bip序列

<400>35

ttcaggtagagatgctggtacacctagtttatctttctaatagcct46