一种农杆菌介导的玉米骨干自交系的遗传转化方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种玉米骨干自交系的遗传转化方法，特别涉及一种农杆菌介导的玉米骨干自交系京724的遗传转化方法。
背景技术：
：玉米是粮食、饲料、工业原材料供给的重要作物，在人口增长、畜牧业、工业高速的发展的现代具有重要地位。据农业部统计，2017/2018年度我国玉米供需缺口430万吨，根据玉米行业发展趋势报告分析，在2016-2030年期间中国玉米产量的增长速度会有所下降，而玉米总消费量的增长速度将会明显超出产量的增长速度，国内供需缺口将会进一步扩大。若在不扩大种植面积的情况下，应对玉米的需求趋势而言，玉米生产方式方法则需不断优化升级。随分子育种技术的发展，借助分子辅助育种、转基因技术、基因编辑技术等现代育种技术与传统育种技术的综合应用，可对抗除草剂、抗虫、抗病、品质、产量等农艺性状的改良提供有力的助推。自上世纪90年代以来，针对玉米的遗传转化研究快速发展，虽转化受体材料从原生质体、悬浮细胞系、花药、幼穗、幼胚、组织生长点到成熟胚均有涉猎，转化方式亦从peg转化、基因枪介导、农杆菌介导、花粉管导入到纳米介导各有千秋，但借助上述路径并能稳定获得转化阳性植株，且具优良农艺性状及应用价值的玉米自交系仍待拓展。玉米骨干自交系京724作为京科968的亲本之一，具有籽粒产量高、抗病性好、配合力高的优良特性。但对于玉米骨干自交系京724而言，目前还没有关于其高效组培及遗传转化方法的报道。技术实现要素：本发明的目的是提供一种农杆菌介导的玉米骨干自交系京724的高效遗传转化方法。本发明提供的农杆菌介导的玉米骨干自交系京724的高效遗传转化方法包括如下步骤：1)用含有目的基因的载体的农杆菌侵染玉米自交系京724幼胚，得到侵染后幼胚；2)将所述侵染后幼胚接种至共培养培养基中进行培养，得到共培养后幼胚；3)将所述共培养后幼胚接种至恢复培养基中进行培养，得到恢复培养后幼胚；4)将所述恢复培养后幼胚接种至筛选培养基中进行培养，得到抗性愈伤；5)将所述抗性愈伤接种至再生培养基中进行培养，得到幼苗；6)将所述幼苗在生根培养基中培养，得到玉米自交系京724转基因植株。上述方法中，所述1)中，所述侵染的方法包括如下步骤：1-1)将含有目的基因的载体的农杆菌在农杆菌活化培养基上进行活化培养，得到活化后的农杆菌；1-2)将所述活化后的农杆菌在侵染液中震荡混匀，得到农杆菌重悬液；每升所述侵染液包括1000xn6基础盐0.35-0.8ml(例如0.35-0.5ml或0.5-0.8ml或0.35ml或0.5ml或0.8ml)、ms基础盐1-2.3g(例如1-2g或2-2.3g或1g或2g或2.3g)、1000xn6有机1-1.5ml(例如1ml或1.5ml)、二水氯化钙0.2-0.7g(例如0.2-0.3g或0.3-0.7g或0.2g或0.3g或0.7g)、蔗糖60.5-76.5g(例如60.5-68.5g或68.5-76.5g或60.5g或68.5g或76.5g)、脯氨酸0.5-1.4g(例如0.5g或1.4g)、水解酪蛋白0.5-0.7g(例如0.5g或0.7g)、2,4-d0.5-2.5mg(例如0.5-1mg或1-2.5mg或0.5mg或1mg或2.5mg)、麦草畏0.5-2.5mg(例如0.5-2mg或2-2.5mg或0.5mg或2mg或2.5mg)、6-苄氨基嘌呤0.12-0.4mg(例如0.12-0.2mg或0.2-0.4mg或0.12mg或0.2mg或0.4mg)、葡萄糖30-42g(例如30-36g或36-42g或30g或36g或42g)；1-3)将玉米自交系京724幼胚浸泡在所述农杆菌重悬液，得到侵染后幼胚。进一步的，所述1-1)中，所述含有目的基因的载体的农杆菌为含有py105载体的eha105。所述1-2)中，所述农杆菌重悬液的od660可为0.4-0.5。在本发明的一个实施例中，所述侵染液由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.5ml/l1000xn6基础盐，2g/lms基础盐，1ml/l1000xn6有机，0.2g/l二水氯化钙，68.5g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.5mg/l2,4-d，2.5mg/l麦草畏，0.2mg/l6-苄氨基嘌呤，36g/l葡萄糖。在本发明的另一个实施例中，所述侵染液由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.35ml/l1000xn6基础盐，2.3g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.7g/l二水氯化钙，68.5g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，2.5mg/l2,4-d，2mg/l麦草畏，0.4mg/l6-苄氨基嘌呤，36g/l葡萄糖。在本发明的另一个实施例中，所述侵染液由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.8ml/l1000xn6基础盐，1g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.3g/l二水氯化钙，68.5g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.7g/l水解酪蛋白，1mg/l2,4-d，0.5mg/l麦草畏，0.12mg/l6-苄氨基嘌呤，36g/l葡萄糖。所述1-3)中，所述幼胚为从幼穗上剥离获得的幼胚；所述幼穗为待玉米籽粒最大直径为4-4.5mm时采摘的幼穗。所述浸泡的时间可为5-10min。上述方法中，所述2)中，每升所述共培养培养基包括1000xn6基础盐0.35-0.8ml(例如0.35-0.5ml或0.5-0.8ml或0.35ml或0.5ml或0.8ml)、ms基础盐1-2.3g(例如1-2g或2-2.3g或1g或2g或2.3g)、1000xn6有机1-1.5ml(例如1ml或1.5ml)、二水氯化钙0.2-0.7g(例如0.2-0.3g或0.3-0.7g或0.2g或0.3g或0.7g)、蔗糖15-25g(例如15-20g或20-25g或15g或20g或25g)、脯氨酸0.3-1g(例如0.3-0.6g或0.6-1g或0.3g或0.6g或1g)、水解酪蛋白0.3-0.8g(例如0.3g或0.8g)、肌醇0.05-0.1g(例如0.05g或0.1g)、2,4-d0.5-2.5mg(例如0.5-1mg或1-2.5mg或0.5mg或1mg或2.5mg)、麦草畏0.5-2.5mg(例如0.5-1mg或1-2.5mg或0.5mg或1mg或2.5mg)、6-苄氨基嘌呤0.12-0.4mg(例如0.12-0.2mg或0.2-0.4mg或0.12mg或0.2mg或0.4mg)、植物凝胶3-4g(例如3g或4g)、山梨醇20-30g(例如20g或30g)、半胱氨酸100-300mg(例如100-200g或200-300g或100g或200g或300g)、乙酰丁香酮100-200umol(例如100umol或200umol)、硝酸银0.85-2mg(例如0.85mg或2mg)。在本发明的一个实施例中，所述共培养培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.5ml/l1000xn6基础盐，2g/lms基础盐，1ml/l1000xn6有机，0.2g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，0.6g/l脯氨酸，0.3g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，0.5mg/l2,4-d，2.5mg/l麦草畏，0.2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，30g/l山梨醇，200mg/l半胱氨酸，200um乙酰丁香酮，2mg/l硝酸银。在本发明的另一个实施例中，所述共培养培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.35ml/l1000xn6基础盐，2.3g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.7g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，0.6g/l脯氨酸，0.3g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，2.5mg/l2,4-d，2mg/l麦草畏，0.4mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，30g/l山梨醇，200mg/l半胱氨酸，200um乙酰丁香酮，2mg/l硝酸银。在本发明的另一个实施例中，所述共培养培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.8ml/l1000xn6基础盐，1g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.3g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，0.6g/l脯氨酸，0.3g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，1mg/l2,4-d，0.5mg/l麦草畏，0.12mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，30g/l山梨醇，200mg/l半胱氨酸，200um乙酰丁香酮，2mg/l硝酸银。更进一步的，所述2)中，所述培养条件如下：19-21℃暗培养1-2天。上述方法中，所述3)中，每升所述恢复培养基包括1000xn6基础盐0.35-0.8ml(例如0.35-0.5ml或0.5-0.8ml或0.35ml或0.5ml或0.8ml)、ms基础盐1-2.3g(例如1-2g或2-2.3g或1g或2g或2.3g)、1000xn6有机1-1.5ml(例如1ml或1.5ml)、二水氯化钙0.2-0.7g(例如0.2-0.3g或0.3-0.7g或0.2g或0.3g或0.7g)、蔗糖20-30g(例如20g或30g)、脯氨酸0.5-1.4g(例如0.5g或1.4g)、水解酪蛋白0.5-0.7g(例如0.5g或0.7g)、肌醇0.05-0.1g(例如0.05g或0.1g)、2,4-d0.5-2.5mg(例如0.5-1mg或1-2.5mg或0.5mg或1mg或2.5mg)、麦草畏0.5-2.5mg(例如0.5-2mg或2-2.5mg或0.5mg或2mg或2.5mg)、6-苄氨基嘌呤0.12-0.4mg(例如0.12-0.2mg或0.2-0.4mg或0.12mg或0.2mg或0.4mg)、植物凝胶3-4g(例如3g或4g)、特美汀150-300mg(例如150mg或300mg)。在本发明的一个实施例中，所述恢复培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.5ml/l1000xn6基础盐，2g/lms基础盐，1ml/l1000xn6有机，0.2g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，0.5mg/l2,4-d，2.5mg/l麦草畏，0.2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，300mg/l特美汀。在本发明的另一个实施例中，所述恢复培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.35ml/l1000xn6基础盐，2.3g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.7g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，2.5mg/l2,4-d，2mg/l麦草畏，0.4mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，300mg/l特美汀。在本发明的另一个实施例中，所述恢复培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.8ml/l1000xn6基础盐，1g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.3g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.7g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，1mg/l2,4-d，0.5mg/l麦草畏，0.12mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，300mg/l特美汀。更进一步的，所述3)中，所述培养条件如下：26-28℃暗培养7-10天。上述方法中，所述4)中，每升所述筛选培养基包括1000xn6基础盐0.35-0.8ml(例如0.35-0.5ml或0.5-0.8ml或0.35ml或0.5ml或0.8ml)、ms基础盐1-2.3g(例如1-2g或2-2.3g或1g或2g或2.3g)、1000xn6有机1-1.5ml(例如1ml或1.5ml)、二水氯化钙0.2-0.7g(例如0.2-0.3g或0.3-0.7g或0.2g或0.3g或0.7g)、蔗糖20-30g(例如20g或30g)、脯氨酸0.5-1.4g(例如0.5g或1.4g)、水解酪蛋白0.5-0.7g(例如0.5g或0.7g)、肌醇0.05-0.1g(例如0.05g或0.1g)、2,4-d0.5-2.5mg(例如0.5-1mg或1-2.5mg或0.5mg或1mg或2.5mg)、麦草畏0.5-2.5mg(例如0.5-2mg或2-2.5mg或0.5mg或2mg或2.5mg)、6-苄氨基嘌呤0.12-0.4mg(例如0.12-0.2mg或0.2-0.4mg或0.12mg或0.2mg或0.4mg)、植物凝胶3-4g(例如3g或4g)、筛选剂5-10mg(例如5mg或10mg)、硝酸银0.85-2mg(例如0.85mg或2mg)、特美汀150-300mg(例如150mg或300mg)。进一步的，所述筛选剂可为潮霉素。在本发明的一个实施例中，所述筛选培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.5ml/l1000xn6基础盐，2g/lms基础盐，1ml/l1000xn6有机，0.2g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，0.5mg/l2,4-d，2.5mg/l麦草畏，0.2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，10mg/l潮霉素，2mg/l硝酸银，300mg/l特美汀。在本发明的另一个实施例中，所述筛选培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.35ml/l1000xn6基础盐，2.3g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.7g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，2.5mg/l2,4-d，2mg/l麦草畏，0.4mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，10mg/l潮霉素，2mg/l硝酸银，300mg/l特美汀。在本发明的另一个实施例中，所述筛选培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.8ml/l1000xn6基础盐，1g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.3g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.7g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，1mg/l2,4-d，0.5mg/l麦草畏，0.12mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，10mg/l潮霉素，2mg/l硝酸银，300mg/l特美汀。更进一步的，所述4)中，所述培养条件如下：26-28℃暗培养25～30天。上述方法中，所述5)中，所述再生培养基为再生培养基ⅰ或再生培养基ⅱ。每升所述再生培养基ⅰ包括ms基础盐3.8-4.33g(例如3.8g或4.33g)、1000xms有机0.8-1.2ml(例如0.8-1ml或1-1.2ml或0.8ml或1ml或1.2ml)、甘氨酸1-2mg(例如1mg或2mg)、蔗糖25-40g(例如25-30g或30-40g或25g或30g或40g)、甘露醇10-20g(例如10g或20g)、水解酪蛋白0.3-0.8g(例如0.3-0.6g或0.6-0.8g或0.3g或0.6g或0.8g)、谷氨酰胺0.3-0.8g(例如0.3g或0.8g)、6-苄氨基嘌呤1-3.5mg(例如1-2mg或2-3.5mg或1mg或2mg或3.5mg)、植物凝胶3-4g(例如3g或4g)、特美汀150-200mg(例如150mg或200mg)；每升所述再生培养基ⅱ包括20xn6大量无机盐40-60ml(例如40-50ml或50-60ml或40ml或50ml或60ml)、1000xms微量无机盐0.8-1.2ml(例如0.8-1ml或1-1.2ml或0.8ml或1ml或1.2ml)、1000xn6有机0.8-1.2ml(例如0.8-1ml或1-1.2ml或0.8ml或1ml或1.2ml)、甘氨酸1-2mg(例如1mg或2mg)、蔗糖25-40g(例如25-30g或30-40g或25g或30g或40g)、甘露醇10-20g(例如10g或20g)、水解酪蛋白0.3-0.8g(例如0.3g或0.8g)、谷氨酰胺0.3-0.8g(例如0.3-0.4g或0.4-0.8g或0.3g或0.4g或0.8g)、6-苄氨基嘌呤1-3.5mg(例如1-2mg或2-3.5mg或1mg或2mg或3.5mg)、萘乙酸0.05-0.3mg(例如0.05-0.2mg或0.2-0.3mg或0.2mg或0.3mg)、植物凝胶3-4g(例如3g或4g)、特美汀150-200mg(例如150mg或200mg)。在本发明的一个实施例中，所述再生培养基ⅰ由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：4.33g/lms基础盐，1ml/l1000xms有机，2mg/l甘氨酸，30g/l蔗糖，10g/l甘露醇，0.6g/l水解酪蛋白，0.8g/l谷氨酰胺，2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，150mg/l特美汀。在本发明的另一个实施例中，所述再生培养基ⅱ由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：50ml/l20xn6大量无机盐，1ml/l1000xms微量无机盐，1ml/l1000xn6有机，2mg/l甘氨酸，30g/l蔗糖，20g/l甘露醇，0.3g/l水解酪蛋白，0.4g/l谷氨酰胺，3mg/l6-苄氨基嘌呤，0.2mg/l萘乙酸，3g/l植物凝胶，150mg/l特美汀。所述5)中，所述培养条件如下：25-26℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养25-30天。上述方法中，所述6)中，每升生根培养基包括ms基础盐1.8-2.2g(例如1.8-2g或2-2.2g或1.8g或2g或2.2g)、1000xms有机0.5-1ml(例如0.5ml或1ml)、蔗糖12-15g(例如12g或15g)、萘乙酸0.05-0.3mg(例如0.05-0.25g或0.25-0.3g或0.05g或0.25g或0.3g)、植物凝胶2.5-3g(例如2.5g或3g)。在本发明的一个实施例中，所述生根培养基由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：2g/lms基础盐，0.5ml/l1000xms有机，15g/l蔗糖，0.25mg/l萘乙酸，3g/l植物凝胶。所述6)中，所述培养条件如下：25-26℃，光照周期为白光16h/黑暗8h条件下培养10-15天。上述方法中，所述侵染液和所述共培养培养基的ph值为5.2。所述恢复培养基、所述筛选培养基、所述再生培养基和所述生根培养基的ph值均为5.8。本发明还提供了用于玉米自交系京724遗传转化的试剂盒，所述试剂盒包括上述共培养培养基和/或恢复培养基和/或上述筛选培养基和/或上述再生培养基和/或上述生根培养基和/或上述侵染液。上述试剂盒在如下a1)-a4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：a1)玉米自交系京724遗传转化；a2)制备玉米自交系京724遗传转化的产品；a3)玉米自交系京724组织培养；a4)制备玉米自交系京724组织培养的产品。本发明通过大量元素、微量元素、有机物及激素的优化组合，开发出一套适用于玉米骨干自交系京724遗传转化的培养基，并通过农杆菌介导的方式实现该品种的稳定转化。抗愈阳性率最高可达66％，转化再生诱导率最高可达9.6％。附图说明图1是京724幼胚经农杆菌介导的遗传转化后抗性愈伤表型、抗愈荧光表型及抗愈再生出苗表型。图2是京724经潮霉素筛选抗愈hpt元件检测。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。下述实施例中的玉米骨干自交系京724记载于文献：玉米自交系京724和郑58的产量配合力及杂种优势研究中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中所涉及的试剂及来源如下：ms基础盐(sigma，m5524)、硝酸钾(sigma-p8291)、硫酸铵(simga-a3920)、磷酸二氢钾(amresco-0781)、七水硫酸镁(sigma-m7506)、二水氯化钙(sigma，c7902)、硫酸锰(simga-m7899)、七水硫酸锌(simga-z0251)、碘化钾(simga-p8166)、五水硫酸铜(国产)、二水钼酸钠(国产)、六水氯化钴(国产)、七水硫酸亚铁(simga-f8633)、乙二胺四乙酸二钠(na2edta，sigma-e6635)、蔗糖(sigma，v900116)、山梨醇(sigma，s3889)、水解酪蛋白(sigma，c7290)、谷氨酰胺(sigma，g8540)、脯氨酸(sigma，p0380)、2,4-d(sigma，d7299)、麦草畏(dicamba，sigma-d5417)、植物凝胶(phytagel，simga，p8169)、潮霉素(phytotech，h385)、激动素(goldbio，com-k-100-25)、6-苄氨基嘌呤(sigma，b3408)、萘乙酸(sigma，n0640)、吲哚乙酸(goldbio，com-i-110-25)、乙酰丁香酮(sigma-d134406)、特美汀(goldbiocom-t-104)、硝酸银(sigma-s7276)、蛋白胨(sigma-p5905)、酵母提取物(sigma-y1625)、氯化钠(sigma-s7658)、卡那霉素(goldbiocom-k-120-25)、琼脂(sigma-a1296)。下述实施例中的n6培养基(用途：基础盐)记载于文献“heweidu,etal；2010,effectsofbasalmedia,saltconcentrations,antioxidantsupplementsandco-effectsontheagrobacteriummediatedtransformationefficiencyinmaize,africanjournalofbiotechnologyvol.9(8),pp.1135-1143.”中。下述实施例中的ms培养基(用途：基础盐)记载于文献“jennifera.raji,etal；2018,agrobacterium-andbiolistic-mediatedtransformationofmaizeb104inbred,maize:methodsandprotocols,methodsinmolecularbiology,vol.1676.”中。下述实施例中的pibc3(sg)-ag培养基(用途：愈伤诱导)记载于文献“myeong-jecho,etal；2015,improvementofagrobacterium-mediatedtransformationfrequencyinmultiplemodernelitecommercialmaize(zeamaysl.)inbredsbymediamodifications,plantcelltissorgancult(2015)121:519–529.”中。下述实施例中的605培养基(用途：愈伤诱导)记载于文献“keithlowe,emilywu,ningwang,etal；2016,morphogenicregulatorsbabyboomandwuschelimprovemonocottransformation,theplantcell,vol.28:1998–2015.”中。下述实施例中的高渗培养基(用途：预处理)记载于文献“jennifera.raji,etal；2018,agrobacterium-andbiolistic-mediatedtransformationofmaizeb104inbred,maize:methodsandprotocols,methodsinmolecularbiology,vol.1676.”中。下述实施例中所涉及1000xn6基础盐由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶剂及其浓度如表1所示。表1成分使用浓度(g/l)硝酸钾kno32830硫酸铵(nh4)2so4463磷酸二氢钾kh2po4400无水硫酸镁mgso490.37无水氯化钙cacl2125.33一水硫酸锰mnso4·h2o3.33碘化钾ki0.8硼酸h3bo31.6七水硫酸锌znso4·7h2o1.5乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3硫酸亚铁feso4·7h2o27.8下述实施例中所涉及1000xn6有机由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶剂及其浓度如表2所示。表2成分使用浓度(mg/ml)甘氨酸2.0烟酸0.5盐酸吡哆醇0.5盐酸硫胺素1下述实施例中所涉及1000xms有机由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶剂及其浓度如表3所示。表3下述实施例中所涉及20xn6大量无机盐由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶剂及其浓度如表4所示。表4成分使用浓度(g/l)硝酸钾kno356.6硫酸铵(nh4)2so49.26磷酸二氢钾kh2po48无水硫酸镁mgso41.8无水氯化钙cacl22.5下述实施例中所涉及1000xms微量无机盐由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶剂及其浓度如表5所示。表5成分使用浓度(g/l)碘化钾ki0.83硼酸h3bo36.2硫酸锰mnso4·h2o16.9硫酸锌znso4·7h2o8.6钼酸钠na2moo4·2h2o0.25硫酸铜cuso4·5h2o0.025氯化钴cocl20.025乙二胺四乙酸二钠na2·edta37.3硫酸亚铁feso4·7h2o27.8实施例1、玉米骨干自交系京724组织培养及遗传转化所涉培养基一、愈伤诱导培养基本发明设计的用于玉米骨干自交系京724愈伤组织诱导的培养基为愈伤诱导培养基mc-1、愈伤诱导培养基mc-2和愈伤诱导培养基mc-3。愈伤诱导培养基mc-1由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.5ml/l1000xn6基础盐，2g/lms基础盐，1ml/l1000xn6有机，0.2g/l二水氯化钙，20g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，0.5mg/l2,4-d，2.5mg/l麦草畏，0.2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶。愈伤诱导培养基mc-1的ph值为5.8。愈伤诱导培养基mc-2由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.35ml/l1000xn6基础盐，2.3g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.7g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.5g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，2.5mg/l2,4-d，2mg/l麦草畏，0.4mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶。愈伤诱导培养基mc-2的ph值为5.8。愈伤诱导培养基mc-3由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：0.8ml/l1000xn6基础盐，1g/lms基础盐，1.5ml/l1000xn6有机，0.3g/l二水氯化钙，30g/l蔗糖，1.4g/l脯氨酸，0.7g/l水解酪蛋白，0.1g/l肌醇，1mg/l2,4-d，0.5mg/l麦草畏，0.12mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶。愈伤诱导培养基mc-3的ph值为5.8。二、农杆菌活化培养基农杆菌活化培养基为yet培养基，其由溶剂和溶质组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别为：5g/l酵母提取物、10g/l蛋白胨、5g/l氯化钠、15g/l琼脂，121℃灭菌15分钟，当培养基冷却至50℃时添加利福平和卡那霉素，使其浓度分别为：25mg/l利福平、50mg/l卡那霉素。yet培养基的ph值为7。三、侵染、共培养及恢复培养基本发明设计的侵染液min的制备方法如下：将步骤一中的愈伤诱导培养基中的植物凝胶和肌醇去除，且将愈伤诱导培养基中的蔗糖浓度调整为68.5g/l，且在愈伤诱导培养基中添加葡萄糖，使其浓度为36g/l后，得到侵染液min。侵染液min的ph值为5.2。本发明设计的共培养培养基mcoc的制备方法如下：将步骤一中的愈伤诱导培养基(愈伤诱导培养基mc-1、愈伤诱导培养基mc-2和愈伤诱导培养基mc-3)中的蔗糖浓度调整为20g/l，脯氨酸浓度调整为0.6g/l，水解酪蛋白浓度调整为0.3g/l，且在愈伤诱导培养基中添加山梨醇，使其浓度为30g/l，调整愈伤诱导培养基ph值为5.2，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃时添加半胱氨酸、乙酰丁香酮和硝酸银，使半胱氨酸、乙酰丁香酮和硝酸银浓度分别为半胱氨酸200mg/l、乙酰丁香酮200um、硝酸银2mg/l，得到共培养培养基mcoc。本发明设计的恢复培养基mrec的制备方法如下：将步骤一中的愈伤诱导培养基121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为300mg/l，得到恢复培养基mrec。恢复培养基mrec的ph值为5.8。四、筛选培养基本发明设计的用于玉米骨干自交系京724愈伤组织筛选的培养基为筛选培养基msh。筛选培养基msh的制备方法如下：将步骤一中的愈伤诱导培养基121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃时添加潮霉素、硝酸银及特美汀，使其浓度为潮霉素10mg/l、硝酸银2mg/l、特美汀300mg/l，得到筛选培养基msh。筛选培养基msh的ph值为5.8。五、再生培养基本发明设计的用于玉米骨干自交系京724再生出苗的培养基为再生培养基mr-1和再生培养基mr-2。再生培养基mr-1由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：4.33g/lms基础盐，1ml/l1000xms有机，2mg/l甘氨酸，30g/l蔗糖，10g/l甘露醇，0.6g/l水解酪蛋白，0.8g/l谷氨酰胺，2mg/l6-苄氨基嘌呤，3g/l植物凝胶，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为150mg/l。再生培养基mr-1的ph值为5.8。再生培养基mr-2由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：50ml/l20xn6大量无机盐，1ml/l1000xms微量无机盐，1ml/l1000xn6有机，2mg/l甘氨酸，30g/l蔗糖，20g/l甘露醇，0.3g/l水解酪蛋白，0.4g/l谷氨酰胺，3mg/l6-苄氨基嘌呤，0.2mg/l萘乙酸，3g/l植物凝胶，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃时添加特美汀，使其浓度为150mg/l。再生培养基mr-2的ph值为5.8。六、生根培养基本发明设计的用于玉米骨干自交系京724生根的培养基为生根培养基mro。生根培养基mro由溶质和溶剂组成，溶剂为双蒸水，溶质及其浓度分别如下：2g/lms基础盐，0.5ml/l1000xms有机，15g/l蔗糖，0.25mg/l萘乙酸，3g/l植物凝胶。生根培养基mro的ph值为5.8。实施例2、农杆菌介导的玉米骨干自交系京724幼胚遗传转化方法一、载体构建将序列1第131-5144位所示的pr2x35s::gfp::t35s//przmubi-01::hpt::tnos片段插入改造后的pcambia3301载体的t-dna区，得到py105重组载体。py105重组载体的核苷酸序列如序列表中的序列1所示。二、农杆菌的制备将步骤一中制备的py105载体导入eha105(eha105是上海唯地生物技术有限公司的产品，cat#:ac1010)农杆菌中，经鉴定，得到含有py105载体的eha105农杆菌。将含有py105载体的eha105农杆菌菌液划线涂布在农杆菌活化培养基(实施例1步骤二中的培养基)上，28℃暗培养36-48小时。三、农杆菌重悬液制备将步骤二中农杆菌平板上的农杆菌刮到侵染液min(实施例1步骤三中的侵染液)中，震荡混匀，得到od660为0.4-0.5的农杆菌重悬液。四、侵染将玉米京724的幼胚收集转移至含有农杆菌重悬液的灭菌管中，室温浸泡5-10min。玉米京724的幼胚的获得方法如下：1、幼穗的获取及采摘按照文献“jonest,lowek,hoersterg,etal.maizetransformationusingthemorphogenicgenesbabyboomandwuschel2[m]//transgenicplants.humanapress,newyork,ny,2019:81-93.”中报道的方法分别在田间播种玉米骨干自交系京724，播种50-55天后进行人工授粉。人工授粉后9-12天，待玉米籽粒最大直径为4-4.5mm时采摘幼穗。2、剥离幼胚按照文献“jonest,lowek,hoersterg,etal.maizetransformationusingthemorphogenicgenesbabyboomandwuschel2[m]//transgenicplants.humanapress,newyork,ny,2019:81-93.”中报道的方法从步骤1获得的幼穗上剥离幼胚。五、共培养及恢复将步骤四中沉浸在农杆菌悬浮液中的幼胚收集至共培养平板上，并用灭菌滤纸将幼胚表面的农杆菌残液吸干净，然后用灭菌手术刀将幼胚以盾片朝上的方式彼此分散平铺在共培养培养基(实施例1步骤三中的培养基)上，放置在19-21℃暗室内培养1-2天。暗培养结束后，利用灭菌手术刀将幼胚转移至恢复培养基(实施例1步骤三中的培养基)中，其幼胚平铺方式同共培养阶段，然后在26-28℃暗室内培养7-10天。六、筛选培养1、抗性愈伤的获得经恢复培养后，幼胚表面有愈伤突起时转移至筛选培养基(实施例1步骤四中的培养基)中继续在26-28℃条件下暗培养20天，获得抗性愈伤，抗性愈伤表型见图1。2、抗性愈伤的鉴定对获得的抗性愈伤进行分子检测。分子检测的具体步骤如下：将所得抗性愈伤取样抽提dna，采用引物f：gaatactgtttcaaactacctggtg和引物r：cgtccatcacagtttgccag进行pcr扩增，扩增得到大小为883bp的抗性愈伤为阳性抗性愈伤。pcr检测部分结果见图2。分别计算抗愈率和抗愈阳性率。抗愈率＝经筛选后所存活的愈伤总数/转化起始幼胚总数。抗愈阳性率＝分子鉴定阳性的愈伤总数/经筛选后所存活的愈伤总数。抗愈率和抗愈阳性率的统计结果见表6。表6注：此处抗愈率和抗愈阳性率是在mc-2愈伤诱导培养基中得到的结果。京724-1、京724-2、京724-3、京724-4、京724-5为五次重复。七、再生苗诱导将步骤六获得的分子鉴定阳性的愈伤接种至再生培养基(实施例1步骤五中的培养基)，每皿4-7块，置于25-26℃，光照周期为白光16h/黑暗8h的光照培养间培养25-30天，得到幼苗并统计再生诱导率。转化再生诱导率＝可诱导出幼苗的抗性愈伤总数/再生测试所接种的抗性愈伤总数。抗性愈伤经再生诱导后出苗率见表7和图1。表7组别起始抗愈总数(块)抗愈经再生诱导出苗数转化再生诱导率13139.6％22613.8％注：此处转化再生诱导率是在再生培养基mr-2中的得到的结果。组别1和组别2为两次重复。八、生根诱导将步骤七获得的幼苗用镊子转移至含生根培养基(实施例1步骤六中的培养基)的生根罐中，置于25-26℃，光照周期为白光16h/黑暗8h的光照培养间培养10-15天，得到玉米骨干自交系京724转基因植株。按照如下公式计算生根诱导率：可诱导出根的幼苗总数/生根测试所接种的幼苗总数。生根诱导率结果见表8。表8以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。序列表<110>北京市农林科学院<120>一种农杆菌介导的玉米骨干自交系的遗传转化方法<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>11550<212>dna<213>artificialsequence<400>1ggtggcaggatatattgtggtgtaaacatggcactagcctcaccgtcttcgcagacgagg60ccgctaagtcgcagctacgc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