一种苦豆子SaENO2基因的克隆及应用的制作方法

本发明属基因工程技术领域，具体涉及一种苦豆子烯醇化酶2基因的获取、构建含有编码基因的重组载体在酵母菌by4743中进行耐逆性功能验证、构建植物过表达重组载体在拟南芥中进行耐逆性功能验证、同时利用实时荧光定量pcr(实时pcr，real-time-pcr，)的方法来研究该基因在非生物胁迫nacl、nahco3和peg处理条件下的功能。

背景技术：

植物在自然界中不断受到多重压力的挑战。在各种逆境压力中，盐碱胁迫是严重制约植物生长发育的非生物胁迫之一，也是制约农作物生产和生态环境建设的因素之一。目前，随着土壤盐碱化的加剧以及耕地面积的日益减少，这对于农作物的产量和质量具有严重的影响。盐碱度极大地限制了半干旱和干旱地区的作物产量。世界上有8.31亿公顷的土壤受到过高盐碱度的影响。其中，碱土(碱性)为4.34亿公顷，盐碱土为3.97亿公顷。土壤盐分主要归因于nacl的积累，而碱土则主要归因于nahco3和na2co3的积累。预计到2050年，50％以上的耕地会发生盐碱化，严重威胁着土地利用率和作物产量。中国盐碱地尤其是内陆盐碱地多是盐化和碱化混合，成分复杂且程度各异。盐化和碱化常常同时发生，这种现象在很多地区普遍存在。

随着科学技术的进步，盐碱地在技术改良方面已经取得了很多成果。但是，受地域、资源、成本等限制，盐碱地的改良工作尚不完善。因而，培育耐盐碱品种的植物，提高植物的耐盐碱能力是缓解盐碱地对植物影响的一个有效生物措施，同时还可以产生较好的生态和经济效益，促进农业的可持续发展。因此，关于植物适应盐碱逆境的研究已成为国内外专家学者们当前研究中的一个热点

苦豆子(sophoraalopecuroides.l)为豆科槐属植物，别名、苦豆草、苦甘草等，为多年生草本、根茎地下芽旱生耐盐植物。其耐旱、耐盐碱性显著，是一个抗性基因丰富的基因资源库。因此，从苦豆子中筛选克隆盐胁迫相关基因，分析其耐盐性，阐明其相关功能，有助于对抗盐基因的进一步利用。

烯醇化酶2(enolase2,简称eno2)是双功能酶，除了作为糖酵解酶，参与糖的分解代谢外，还具有转录因子的功能。烯醇化酶(enolase,eno,2-phospho-d-glyceratehydrolyase)又称为2-磷酸-d-甘油酸盐水解酶，能够催化2-磷酸-d-甘油酸(2-pga)向磷酸-烯醇式丙酮酸(pep)的转化，是糖酵解途径中唯一的脱水步骤，又可在糖质异生过程中催化逆向反应，即可作为磷酸丙酮酸盐水合酶催化pep向pga的转化过程。烯醇化酶不仅在生物体内普遍存在，而且还是许多生物体中表达最为丰富的细胞质蛋白之一。

植物eno也包含三种同工酶，分别是eno1、eno2及eno3，其氨基酸序列是高度保守的，都包含一个典型的烯醇化酶n端区域和一个高度保守的dna结合区域。植物eno2与动物的α-eno同源性最高，而在植物中，拟南芥和水稻中的eno2同源性较高。eno2是在细胞质中发挥主要功能作用的烯醇化酶，在植物生长发育过程中高表达，其表达量是eno1和eno3的十倍左右。

在拟南芥，水稻等植物中，已观察到烯醇化酶在转录、转录后和翻译后水平上应答高盐、低温、缺氧等非生物胁迫，推测烯醇化酶可能在植物非生物胁迫应答中发挥重要作用。

我们利用苦豆子苗期处理cdna酵母表达文库对苦豆子抗逆相关基因进行筛选，得到了一个盐碱和干旱胁迫相关基因，烯醇化酶2基因，命名为saeno2。

在苦豆子中，到目前为止，关于saeno2基因的作用未见报道。

技术实现要素：

本发明通过构建苦豆子(sophoraalopecuroidesl)盐胁迫(200mmnacl)、碱胁迫(200mmnahco3)和干旱胁迫(8％peg)全长cdna文库，并成功重组到酵母表达载体(pyes-dest52)中，混合质粒载体经转化到酵母菌株invsc1中成功构建苦豆子酿酒酵母表达文库，然后对酵母文库通过模拟逆境胁迫(na2co3和nahco3)，筛选出与逆境胁迫相关的苦豆子基因，通过测序获得基因核酸序列，对该基因进行生物信息学分析，发现该基因可能属于烯醇化酶2家族基因，并命名为saeno2,

一种与植物抗逆性相关的苦豆子烯醇化酶2基因saeno2的核苷酸序列如seqidno:1所示。

一种权利要求1所述苦豆子烯醇化酶2基因saeno2的表达产物苦豆子烯醇化酶2saeno2的氨基酸序列如seqidno:2所示。

根据测序获得的序列设计克隆引物和定量引物，利用rt-pcr技术检测该基因在逆境胁迫(nahco3、nacl和peg)条件下苦豆子不同组织中的表达量变化，以初步研究该基因在苦豆子逆境胁迫中的相应作用，同时对该基因构建酵母表达载体和植物过表达载体并成功转入酵母by4743和野生型拟南芥中进行功能初步验证，结果表明该基因在酵母和拟南芥中过表达后能够显著提高酵母和拟南芥的耐盐碱性和耐旱性，这为我们通过基因工程技术提高作物的抗逆性提供了新的资源。本发明中，转pyes-saeno2的重组酵母转化子和转pchf3300-saeno2的转基因拟南芥相对于转空载和野生型都表现出了明显的抗盐碱胁迫的能力。同时在本源植物苦豆子中，saeno2基因的表达也对盐碱胁迫和旱胁迫表现出了明显的响应，说明saeno2基因过量表达可以提高植物的抗逆性，特别是植物的抗盐碱和干旱胁迫的能力。

附图说明

图1为酵母耐碱筛选浓度确定(naco3:nahco3＝1:1)

图2为sd/-ura(含naco3和nahco30.026mol/l)筛选培养基菌落图

图3为酵母阳性克隆pcr检测

其中：第3个为saeno2基因

图4为saeno2基因克隆回收电泳图

图5为苦豆子saeno2基因在对照和1.2％nacl处理条件下不同组织中的相对表达量

图6为苦豆子saeno2基因在对照和1.2％nahco3处理条件下不同组织中的相对表达量

图7为苦豆子saeno2基因在对照和8％peg处理条件下不同组织中的相对表达量

图8为saeno2基因转入酵母菌液pcr结果

其中：m：2000bpmarker；1-3：saeno2:2000bpmarker；

图9为重组酵母pyes-saeno2和pyes-dest52在对照条件下的结果

图10为重组酵母pyes-saeno2和pyes-dest52在盐处理条件下的结果

图11为重组酵母pyes-saeno2和pyes-dest52在对照和碱处理条件下的结果

图12为pmd18t-saeno2载体酶切验证电泳图

图13为构建pchf3300-saeno2载体在大肠杆菌中pcr结果

其中：m：2000bpmarker；1-11：saeno2；

图14为pchf3300-saeno2载体转化农杆菌eha105菌液pcr检测

其中：m：2000bpmarker；1-6：saeno2；

图15为转saeno2基因拟南芥t1代检测结果

其中：m：2000bpmarker；1-18：转saeno2拟南芥株系；

图16为转saeno2基因拟南芥t2代检测结果

图17为转saeno2基因拟南芥各株系相对定量分析

图18为野生型拟南芥和转saeno2基因拟南芥在1/2ms固体培养基中发芽及生长情况

图19为野生型拟南芥和转saeno2基因拟南芥在1/2ms固体培养基(含20mmnahco3)中处理发芽及生长情况

图20为野生型拟南芥和转saeno2基因拟南芥在1/2ms固体培养基(含100mmnacl)中处理发芽及生长情况

图21为野生型拟南芥和转saeno2基因拟南芥在土壤中利用hoagland营养液(100mmnahco3)浇灌处理条件下生长表型

图22为野生型拟南芥和转saeno2基因拟南芥在1/2ms固体培养基(含6％peg)中处理表型差异

具体实施方式

实施例1：苦豆子saeno2基因的筛选与克隆

选取籽粒饱满的苦豆子种子10g，加入5ml浓度98％的浓硫酸浸泡处理20min。洗净种子后播种于花土中盆栽。培养条件为：16h光照，温度26℃，湿度65％，光强30000勒克斯。萌发四周后，分别将幼苗转移至nacl浓度为200mmol、nahco3浓度为200mmol和peg6000浓度为8％的hoagland营养液中分别处理3h，12h，24h，72h。取各处理下的苦豆子根部，分别提取不同处理条件下苦豆子根的totalrna。取上述提取的4个处理的苦豆子根部rna，等质量混合各组样品用于cdna文库构建。提取构建完成的cdna文库质粒，将文库质粒大规模转化酿酒酵母invsc1感受态细胞构建苦豆子苗期酵母表达cdna文库。利用酵母植物抗逆基因筛选体系筛选苦豆子抗盐碱相关基因，筛选方法如下：

取适量文库菌液(使克隆总数达文库滴度的5-10倍)，涂布sd/-ura(含nahco30.26mol/l)筛选平板，30℃倒置培养2-4天至菌落出现，如图1所示；保存筛选到的酵母菌株，根据酵母表达载体序列设计引物，引物为：

引物名称5’到3’序列

按照表1反应和表2程序进行pcr检测：

表1pcr反应体系

表2pcr程序

根据pcr结果，参照sangon酵母质粒提取试剂盒的方法分别提取上述酵母菌液的质粒，转化ecolidh5α，保存菌液并进行测序，将测序后的序列，利用ncbi数据库blast(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi？program＝blastn&page_type＝blastsearch&link_loc＝blasthome)进行序列比对分析，得到苦豆子烯醇化酶2基因。由1335个碱基对组成，读码框自5'端第1位到第1335碱基，编码一个由444个氨基酸残基组成的蛋白质，saeno2蛋白包含一个烯醇化酶2结构域，说明saeno2基因可能与烯醇化酶2家族基因具有相似的功能。

实施例2：苦豆子中saeno2基因的组织特异性表达

对苦豆子进行胁迫处理，处理方法同实施例1。处理4h后。同时取苦豆子的根、茎、叶。参照sangon公司的柱式植物总rna抽提纯化试剂盒提取处理材料的总rna，经1％琼脂糖电泳检测rna的完整性。cdna的合成按照reversetranscriptasem-mlv(rnaseh-)的说明书进行。利用实时荧光定量pcr对saeno2基因在苦豆子不同组织及不同盐处理时间根中的表达情况进行检测。实验操作按照sangong公司sgexcelfastsybrmixture(withrox)说明书在在实时荧光定量pcr仪abi7500中进行。以苦豆子lectin为内参基因，引物如下：

pcr反应体系及程序如表3：

表3pcr反应体系和反应程序

pcr反应程序

采采用2-δδct法分析数据，确定基因的相对表达量。试验共设3次技术重复，3次生物学重复。

结果表明saeno2基因在苦豆子的根、茎、叶片中均有表达，其中在茎中表达量最高，且在碱处理条件下，茎中表达量明显提高。

实施例3：重组酵母的转化及检测

酿酒酵母菌株by4743为尿氨酸营养缺陷型(ura-)的模式菌株，在缺乏尿氨酸的酵母基本培养基(sc-ura-)上,该酵母菌株几乎不能生长和繁殖。而酵母表达载体(pyes2-dest52)上含有ura3基因,且该基因的表达可以使酵母转化子在sc-ura-培养基上正常生长。因此，sc-ura-选择培养基可以进行阳性和非阳性酵母转化子的筛选。通过醋酸锂法将载体质粒pyes-saeno2和pyes-dest52分别转化到酵母感受态菌株by4743中，将转化酵母菌液涂在sc-ura-固体选择培养基上，以未转化的酵母做对照，进行培养，2d后除了空酵母完全不长外，转化两种质粒的酵母均可以生长并有菌落长出，说明酵母转化成功，挑取酵母单菌落，过夜培养后进行破除细胞壁，并通过菌液pcr方法进行阳性转化子的进一步鉴定。

1.运用醋酸锂化学转化法转化酿酒酵母by4743，其具体转化步骤：

1.1将一个酵母菌株单克隆(by4743)加入到10mlypda液体培养基中，30℃过夜摇培。

1.2检测酵母菌液的od600值，利用50mlypd液体培养基将过夜培养的酵母菌液稀释至od600为0.4，30℃继续摇培2-4h。

1.3低温离心(4℃，2500rpm)5min后，去除上清收集菌体，用40ml1xte缓冲液重悬菌体。

1.4再次低温离心(4℃，2500rpm)5min后，收集菌体，用2ml1xliac/0.5xte缓冲液重悬菌体。

1.5将获得的重悬菌体按照每管100μl的体系分装到1.5ml离心管。

1.6将分装的酵母细胞置于室温孵育10min。

1.7在每个转化体系(100μl)中，加入1μg质粒dna，100μg变性鲑鱼精dna，混匀。

1.8每个体系中加入600μl1xliac/40％peg-3350/1xte，混匀。

1.930℃,200rpm摇床中孵育步骤1.8中的混合液30min。

1.10在每个体系中再加入70μl的dmso，混匀后，42℃条件下水浴热击15min。

1.115000rpm低温离心1min，去除上清。

1.12用备好的1ml1xte的缓冲液重悬菌体，5000rpm低温离心1min，进一步去除上清。

1.13用100μl1xte的缓冲液将菌体重悬，并涂于酵母选择培养基上，30℃培养24h。

2.阳性转化子的鉴定

从酵母选择培养基上随机挑取5个酵母转化子(pyes2-saeno2)的单菌落，30℃振荡培养过夜(200rpm)，收集过夜培养菌体，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎细胞，重复几次，以细胞破碎液离心浓缩样品作为模板进行菌液pcr，以引物t7和r进行pcr扩增，pcr反应体系为(25μl)：buffer2.5μl、上下游引物(t7、r)各0.5μl、tag酶0.5μl、dntp0.5μl、模板5μl、ddh2o15.5μl。

pcr产物在1％的琼脂糖凝胶上电泳检测，扩增片段大小与目标长度吻合。证明重组质粒pyes2-saeno2已经转化到酵母菌株中。

实施例4：阳性转化酵母逆境胁迫处理

1.逆境胁迫处理前准备

取适量阳性酵母转化子(pyes-dest52，pyes2-saeno2)菌液，接种到含2％葡萄糖的sd-u液体培养基中，30℃条件下200rpm振荡培养24h，测od600值，并用sd-u液体培养基(2％葡萄糖)将菌液od600统一调整为0.4，总体积5ml，8000rpm离心1min，吸取上清液，加2ml含2％半乳糖的酵母诱导培养基重悬菌体，以1:50的比例接到5ml的诱导培养基中扩大培养，30℃振荡培养24h，检测酵母by4743(pyes-dest52)和by4743(pyes2-saeno2)的od600值,并统一调整到od600值为0.2，备用。对这两种酵母转化子进行不同的非生物胁迫处理，比较两种酵母转化子抗盐碱胁迫能力,实验重复3次。

2.模拟逆境胁迫处理

存在于自然界中的植物面对各种生物和非生物逆境，非生物胁迫中最主要的是盐碱胁迫(nacl、nahco3、kcl等)和干旱胁迫。

在实验室条件下进行盐碱模拟，用0.68mnacl模拟盐胁迫，0.3mnahco3模拟碱胁迫。运用以上两种模拟条件处理酵母转化子，通过酵母的生长情况对比，从而评价该基因在酵母中诱导表达后对酵母抗逆性的影响，以对该基因在酵母中的抗逆功能进行初探。

2.1nacl处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、10000倍的菌体，吸取2μl菌液接种到含2％半乳糖的sc-u固体培养基上，30℃培养两天后，比较两种酵母转化菌的菌落生长状态。

2.2nahco3处理：将上述备用菌体分别以不稀释和稀释10、100、1000、10000倍的菌体，吸取2μl菌液接种到含2％半乳糖的sc-u固体培养基上，30℃培养两天后，比较两种酵母转化菌的菌落生长状态。

实施例5：saeno2在拟南芥中的表达及对耐盐碱性的分析

构建植物表达载体pchf3300-saeno2。采用农杆菌介导法转化将植物表达载体pchf3300-saeno2转化野生型拟南芥，并对转基因拟南芥进行basta筛选，同时检测阳性植株中目的基因表达量，并对转基因拟南芥的耐盐性进行分析。具体方法如下：

将t3代转基因拟南芥种子和野生型wt(哥伦比亚野生型)种子用10％次氯酸钠消毒3min，利用灭菌水洗5次，播种在含0.8％琼脂的1/2ms固体培养基中，发芽处理和成苗处理是在含0.8％琼脂的1/2ms固体培养基中加入相应比例的nahco3(终浓度20mm)(，nacl(终浓度100mm)和peg(终浓度6％)，同时将野生型和t3代转基因拟南芥种子播种子穴盘中(土壤，草炭土：蛭石＝1:1)，待出苗后进行浇灌hoagland营养液，在营养液中加入nahco3(终浓度100mm)，在处理过程中拍照记录，根据野生型拟南芥和转基因拟南芥生长表型情况来初步探究目的基因的功能。

序列表：

seqidno.1的序列

(i)序列特征：(a)长度：1335bp；(b)类型：核苷酸；(c)链性：单链；

(ii)分子类型：核苷酸

(iii)序列描述：seqidno.1

seqidno.2的序列

(i)序列特征：(a)长度：444个氨基酸；(b)类型：氨基酸；(c)链性：单链。

(ii)分子类型：多肽

(iii)序列描述：seqidno.2

发明名称：一种苦豆子saeno2基因的克隆及应用

seqidno.1的序列

（i）序列特征：（a）长度：1335bp；（b）类型：核苷酸；（c）链性：单链；

　　　（ii）分子类型：核苷酸

　　　（iii）序列描述：seqidno.1

1atggccaccatcgttagcatcaaggcaagacagatcttcgatagccgtggcaatccaacg

61gtcgaggtggatttgacatgctcagatggtacttttgctagagctgctgttccaagtggt

121gcatccactggtatttatgaggctcttgaattaagagacggaggatctgactaccttgga

181aaaggcgtttcaaaggctgttggcaatgtaaattcaattattgcccctgcattgatcggc

241aaggatccaactaagcagacagaaattgacaacttgatggttcaacagctcgatggaact

301gttaacgaatggggttggtgcaagcaaaagcttggggcaaatgccatattggctgtgtct

361ctggcagtctgcaaagctggtgctagtgtcctgaaaattcctctttacaagcatatcgca

421aaccttgcgggtaacaaaaagttggttttgcctgttccttctttcaacgtcattaatggt

481ggatcacatgcgggaaacaaacttgctatgcaggagtttatgattcttcctgtgggagct

541tcctctttcaaggaagccatgaagatgggtgtggaagtatatcaccatttgaaggctgtg

601attaagaagaaatacggtcaagatgcagtaaatgttggtgatgaaggtggctttgctcct

661aacattcaggaaaacaaggagggtttggaattgctgaaagttgccattgccaaagctggc

721tacacagacaaagttgtcattggaatggatgttgccgcttctgaattctacaaaccagac

781aaaacctatgatctgaacttcaaggaagataacaacgatggctcacaaaagatctctggg

841gatgctttgaaagatctctacaaatcatttgtgtcagagtacccaattgtttcaattgaa

901gatccttttgaccaagatgattgggagcactatgctaagctaactggtgaggttggaacc

961aatgtacaaattgttggtgatgatctcttggttaccaaccccaagagggttcagaaggca

1021attgattcaaaagcatgcaatgctcttctgctcaaggtcaatcaaattggatctgtgact

1081gaaagtattgaagctgtcaggatgtccaaaagagctggatggggtgtaatggccagtcac

1141cgaagcggagagaccgaggatacctttattgccgatctttctgttggtttggccacgggt

1201caaattaagactggagctccatgcaggtcagagcgtcttgctaaatataaccagctgttg

1261agaattgaggaggagcttggtgctgaagcagtgtacgctggagcaaacttccgtacccct

1321gttgaaccctactaa

seqidno.2的序列

　　　（i）序列特征：（a）长度：444个氨基酸；(b)类型：氨基酸；（c）链性：单链。

　　　（ii）分子类型：多肽

　　　（iii）序列描述：seqidno.2

1mativsikarqifdsrgnptvevdltcsdgtfaraavpsgastgiyealelrdggsdylg

61kgvskavgnvnsiiapaligkdptkqteidnlmvqqldgtvnewgwckqklganailavs

121lavckagasvlkiplykhianlagnkklvlpvpsfnvinggshagnklamqefmilpvga

181ssfkeamkmgvevyhhlkavikkkygqdavnvgdeggfapniqenkeglellkvaiakag

241ytdkvvigmdvaasefykpdktydlnfkednndgsqkisgdalkdlyksfvseypivsie

301dpfdqddwehyakltgevgtnvqivgddllvtnpkrvqkaidskacnalllkvnqigsvt

361esieavrmskragwgvmashrsgetedtfiadlsvglatgqiktgapcrserlakynqll

421rieeelgaeavyaganfrtpvepy