重组CD6基因、及利用其修饰的T细胞、制备方法和应用与流程

文档序号：20753357发布日期：2020-05-15 17:14阅读：625来源：国知局

本发明涉及基因技术领域，具体涉及重组cd6基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用。

背景技术：

脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，占颅脑肿瘤的40％～50％，其发病原因复杂，在十大常见肿瘤中致死率高居第二位，致残率高居第四位。目前，胶质瘤的治疗手段主要包括手术、放疗和(或)化疗的综合治疗方式。外科手术是胶质瘤首选治疗策略，由于胶质瘤呈侵袭性生长，很难做到全切，且术后易复发；化疗治疗中最常见的是x-刀、γ-刀治疗，但是因肿瘤的部位、瘤体大小(一般限于3厘米以下)及瘤体对射线的敏感程度，治疗范畴局限；化疗药物限于血脑屏障及药物的毒副作用，疗效尚不肯定，常用化疗药物bcnu、ccnu、vm-26的有效率仅在30％以下。以上治疗方法都给胶质瘤的治疗带来了极大的挑战，胶质瘤易复发、病死率高、治疗效果并不乐观。

近年来随着肿瘤免疫治疗的兴起，为脑胶质瘤的治疗提供了新的思路。其中，过继性免疫疗法作为一个新兴的领域，在癌症、感染和自身免疫疾病的临床试验中展现出巨大的潜力。然而，有效地将治疗性t细胞归巢到靶位点仍然是一个主要的限制因素，尤其是对于脑肿瘤。由于肿瘤内皮细胞表达白细胞细胞粘附分子(alcam)的水平较高，但其同源配体cd6(在t细胞上自然表达)不能介导足够的肿瘤细胞的跨内皮迁移(tem)，因而，t细胞免疫疗法治疗脑胶质瘤时面临着一个重大的挑战-血脑屏障，阻挡t细胞进入大脑。血脑屏障在正常情况下对大脑是有益的，但是它会阻止t细胞到达脑胶质瘤处，从而让免疫疗法失去疗效。

alcam(又称cd166)，是i类跨膜蛋白和免疫球蛋白超家族成员，在触发t细胞浸润方面起着重要作用。t细胞通过血脑屏障的过程依赖于t细胞表面的配体分子cd6和内皮细胞上的alcam、细胞间粘附分子1(icam1)和血管细胞粘附蛋白1(vcam1)等细胞黏附分子的结合，一旦t细胞通过与细胞黏附分子结合达到粘附阈值，t细胞就可以离开血管进入脑部。但是，现有的cd6分子无法直接导入或有效量导入t细胞，使得该方法对脑胶质瘤的治疗效果大大减弱。

因此，开发一种新的重组cd6基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

技术实现要素：

针对现有技术中的缺陷，本发明提供重组cd6基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用，以提高对脑胶质瘤的治疗效果。

第一方面，本发明提供了重组cd6基因，该重组cd6基因包括依序连接的signalpeptide核酸人工序列、srcr-d3核酸人工序列、stalk核酸人工序列、跨膜-共刺激结构域核酸人工序列、cytoplasmic核酸人工序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域选自cd6、cd8、cd27、cd28、cd137/4-1bb、cd134/ox40、icos分子的全部或部分片段。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-共刺激结构域核酸人工序列采用cd6tm核酸人工序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述

signalpeptide核酸人工序列为seqidno.4；

srcr-d3核酸人工序列为seqidno.5；

stalk核酸人工序列为seqidno.6；

cd6tm核酸人工序列为seqidno.7；

cytoplasmic核酸人工序列为seqidno.8。

第二方面，本发明提供了利用重组cd6基因修饰的t细胞，所述t细胞采用共同表达抗egfrviii-car和重组cd6基因的慢病毒感染得到。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述t细胞包括自体的或转基因的t细胞、nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞或调节t细胞、记忆性t细胞、双特异性t细胞、cik细胞。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述慢病毒采用重组质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞得到。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述重组质粒是将egfrviii-car核酸人工序列、自裂解多肽t2a核酸人工序列、signalpeptide核酸人工序列、srcr-d3核酸人工序列、stalk核酸人工序列、cd6tm核酸人工序列、cytoplasmic核酸人工序列合成其整个表达框，插入plent-c-gfp载体，转化到e.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取得到。

第三方面，本发明提供了t细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)将egfrviii-car核酸人工序列、自裂解多肽t2a核酸人工序列、signalpeptide核酸人工序列、srcr-d3核酸人工序列、stalk核酸人工序列、cd6tm核酸人工序列、cytoplasmic核酸人工序列合成其整个表达框，插入plent-c-gfp载体，转化到e.coli，测序正确后，使用质粒提取试剂盒提取得到重组质粒，获得重组表达载体plent-anti-egfrviii-car3hs；

2)取外周血，分离外周血单个核细胞；用重组干扰素α2a的培养基诱导培养后，加入il-2、okt-3和患者自体血浆诱导继续培养；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测t细胞中的cd3+阳性率>80％，cd3+cd56+双阳性率>20％，视为t细胞诱导成功，并留取该t细胞待病毒感染；

3)复苏293t细胞，步骤1)得到的重组表达载体plent-anti-egfrviii-car3hs与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法转染293t细胞，获得plent-anti-egfrviii-car3hs慢病毒；

4)将步骤3)得到的所述plent-anti-egfrviii-car3hs慢病毒感染步骤2)制得的anti-egfrviii-car3hst细胞(即为本发明所述的利用重组cd6基因修饰的t细胞)。

第四方面，本发明提供了重组cd6基因的应用，是指重组cd6基因在制备治疗gbm、非小细胞肺癌、头颈癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等实体肿瘤药物方面得以应用。

本发明中，作为一种优选的技术方案，重组cd6基因尤其应用在制备治疗抗脑肿瘤的药物方面。

由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：

发明人在研究中发现，在胶质母细胞瘤中，脑血管系统会发生改变-过表达alcam，icam1和vcam1低表达或者不表达，导致t细胞无法进入跨过血脑屏障，进而无法攻击脑肿瘤。如果将合成的cd6分子导入t细胞，使t细胞表达更多的分子蛋白，一旦有足够的配体分子cd6与alcam结合后，就会激活t细胞上的slp-76蛋白，slp-76蛋白会促使lfa-1蛋白移动到细胞表面，并与内皮细胞上的少量icam-1分子结合，进一步增强t细胞与内皮细胞之间的黏附。这些分子变化会激活fak蛋白，促使t细胞能够跨过血脑屏障成功进入脑部，从而使t细胞发挥攻击脑胶质瘤的作用(图1)。因此，通过合理地重组cd6来优化alcam结合以创建一个引导t细胞归巢于脑癌的系统，使t细胞能够通过血脑屏障进入大脑，通过原本限制的肿瘤内皮细胞，对于脑部肿瘤及转移性脑肿瘤具有重要的意义。

基于该思路，发明人创造性的重组了cd6基因片段，本发明所述cd6分子可以与脑胶质瘤高表达靶点，如gd2、her2、egfrviii、tgf-β2等car序列相连接，增强对脑胶质瘤的精准靶向杀伤作用。本发明首次提出利用逆转录病毒将t细胞表面的配体分子cd6引入t细胞，以增强t细胞对alcam的锚定并弥补icam1表达的降低，促进迁移的发生，促使t细胞能够穿过血脑屏障进入大脑，从而达到对抗脑肿瘤的效果。本发明提供的t细胞可时携带cd6分子以及常见脑胶质瘤靶点的car，cd6分子使t细胞能够穿过内皮细胞进入大脑，引导t细胞归巢于脑瘤，发挥cd6的归巢作用(homingsystem,hs)；再加入针对脑胶质瘤靶点，使改造后的t细胞严格靶向脑肿瘤区域，并且不影响其他正常的大脑以及身体组织，因而具有突破血脑屏障、精准靶向脑肿瘤、安全性高的优势。

综上所述，本发明提供的t细胞严格靶向脑肿瘤区域，并且不影响其他正常的大脑以及身体组织，因而具有突破血脑屏障、精准靶向脑肿瘤、安全性高的优势。

附图说明

图1为cd6分子与alcam结合传导示意图。

图2为本发明所述的egfrviii-car-cd6-cd6-cd6重组基因设计图。

图3为共同表达抗egfrviii-car和cd6的模块示意见图。

图4为流式细胞术检测anti-egfrviii-car3hst细胞的表达car的效率为36.8％。

图5为本发明anti-egfrviii-car3hst细胞体内杀伤结果图。

图6为本发明egfrviii-car3hst细胞与egfrviii-car-t细胞、空白对照中位生存期比较图，egfrviii-car3hst细胞中位生存期显著高于其他两组。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

重组cd6基因，该重组cd6基因包括依序连接的signalpeptide核酸人工序列、srcr-d3核酸人工序列、stalk核酸人工序列、跨膜-共刺激结构域核酸人工序列、cytoplasmic核酸人工序列。其中，signalpeptide核酸人工序列为seqidno.4；srcr-d3核酸人工序列为seqidno.5；stalk核酸人工序列为seqidno.6；cd6tm核酸人工序列为seqidno.7；cytoplasmic核酸人工序列为seqidno.8。

因本发明将重组cd6基因与表达抗egfrviii-car基因片段协同使用，因此，下述实施例均以共同表达抗egfrviii-car和cd6基因片段合在一起描述。

实施例2

制备共同表达抗egfrviii-car和cd6基因片段

共同表达抗egfrviii-car和cd6的模块示意见图3(完整核酸序列见附录seqidno.1)。

anti-egfrviii-car-cd6各模块序列如下(其中cd6分子各模块序列为(3)-(7))：

egfrviii-car核酸人工序列(seqidno.2)

自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.3)

signalpeptide(信号肽区)核酸人工序列(seqidno.4)

srcr-d3核酸人工序列(seqidno.5)

stalk(柄区)核酸人工序列(seqidno.6)

cd6tm(跨膜-共刺激区)核酸人工序列(seqidno.7)

cytoplasmic(胞内区)核酸人工序列(seqidno.8)

分别egfrviii-car核酸人工序列(seqidno.2)、自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.3)、signalpeptide核酸人工序列(seqidno.4)、srcr-d3核酸人工序列(seqidno.5)、stalk核酸人工序列(seqidno.6)、cd6tm核酸人工序列(seqidno.7)、cytoplasmic核酸人工序列(seqidno.8)(其中signalpeptide核酸人工序列-cytoplasmic核酸人工序列共重复3次，重组基因图见图2)委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体puc上，因此命名为puc-anti-egfrviii-car3hs，将puc-anti-egfrviii-car3hs进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有anti-egfrviii-car3hs的dna片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中，采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500mldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500mlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的anti-egfrviii-car3hsdna片段。

实施例3

重组质粒的制备

分别将egfrviii-car核酸人工序列(seqidno.2)、自裂解多肽t2a核酸人工序列(seqidno.3)、signalpeptide核酸人工序列(seqidno.4)、srcr-d3核酸人工序列(seqidno.5)、stalk核酸人工序列(seqidno.6)、cd6tm核酸人工序列(seqidno.7)、cytoplasmic核酸人工序列(seqidno.8)(其中signalpeptide核酸人工序列-cytoplasmic核酸人工序列共重复3次，重组基因图见图2)委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体puc上，因此命名为puc-anti-egfrviii-car3hs，同时将puc-anti-egfrviii-car3hs和plent-c-gfp载体进行fastdigestasisi(购自thermofisher公司)和fastdigestnoti(购自thermofisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；dna6μg；asisi酶：3μl；noti酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有anti-egfrviii-car3hs的dna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。

采用dnaextractionkit(购自thermofisher公司)将dna从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500mldfbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入dfcolumn，并套上collectiontube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500mlwashbuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将dfcolumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlelutionbuffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的anti-egfrviii-car3hsdna片段和线性化的plent-c-gfpdna片段。

将上述两种dna片段在16℃进行过夜连接形成plent-anti-egfrviii-car3hscar质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；t4连接酶：1μl；anti-egfrviii-car3hsdna：4μl；线性化的plent-c-gfpdna：4μl。

将上述plent-anti-egfrviii-car3hs转化到e.coli(dh5α)。筛选鉴定出阳性克隆，选取阳性克隆37℃、250rpm摇菌(12h-16h)，按照质粒提取纯化试剂盒(购自invitrogen公司)提取plent-anti-egfrviii-car3hs质粒，具体步骤见说明书。plent-anti-egfrviii-car质粒制备方法同plent-anti-egfrviii-car3hs质粒。

将上述的plent-anti-egfrviii-car3hs质粒和plent-anti-egfrviii-car质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

实施例4

慢病毒包装

将慢病毒包装细胞系293t接种于含有dmem+10％fbs10cm培养皿中，37℃，5％co2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将实施例1中的重组质粒(约10μg)和空载质粒(约10μg)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293t细胞，轻轻混匀，置于37℃、5％co2培养箱中培养12h，加入含10％fbs的dmem液体培养基8ml，继续培养至48小时。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，除去细胞碎片，收获病毒后进行浓缩，获得浓缩过的egfrviii-car3hs病毒液和egfrviii-car病毒液，-70℃低温冰箱中保存备用。

根据lenti-x^tmgostix^tm试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度分别是3.36×10⁶pfu/ml和3.32×10⁶pfu/ml。

实施例5

t细胞的制备

取50ml患者自体外周血，用tbd样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000iu/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自corning公司，88-551-cm)诱导培养24小时后，加入1000iu/ml的il-2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的okt-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测t细胞中的cd3⁺、cd56⁺的阳性表达率(cd3-fitc，cd16/cd56-pe抗体购自beckman公司，a07735)。cd3⁺阳性率>80％，cd3⁺cd56⁺双阳性率>20％，视为t细胞诱导成功，并留取该细胞待病毒感染。

实施例6

慢病毒感染t细胞及car-t细胞的扩增培养

t细胞经活化后，取出1×10⁶个细胞，分别加入浓缩过的egfrviii-car3hs病毒液和egfrviii-car病毒液，混匀，moi＝6。在一周后分别对转染的t细胞进行相关检测。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于gfp与car共表达，检测gfp的阳性细胞即为表达car和cd6的阳性细胞。

图3为流式细胞术检测的利用本发明构建的egfrviii-car3hst细胞载

体在t细胞表面上的表达情况。结果表明有36.8％的细胞是gfp(慢病毒载体本身表达gfp蛋白)阳性，说明利用本发明构建的egfrviii-car3hs能够在t细胞表面表达，且转染效率分别为36.8％。

实施例7

anti-egfrviii-car3hst细胞体外杀伤

egfrviii+u87细胞作为靶细胞，效应细胞为anti-egfrviii-car3hst细胞、anti-egfrviii-cart细胞和未转染t细胞。

按e：t(效应细胞和靶细胞比)为5：1，加入1×10⁶个egfrviii+u87细胞，待细胞完全贴壁后，收集anti-egfrviii-car3hst细胞和未转染t细胞，分别调整细胞浓度为1.36×10⁷/ml，每孔加入100μl，37℃，5％的co2条件下培养12h。弃上清，加入20μl稀释的cck8(购自mce公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测od450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔od值-单独效应细胞的od值)/单独靶细胞的od值]×100％。anti-egfrviii-car3hst细胞对egfrviii+u87细胞的杀伤效率为98.66％(p<0.02)明显高于egfrviii-cart细胞和未转染t细胞(egfrviii-cart细胞和未转染t细胞对egfrviii+u87细胞的杀伤效率分别为52.36％(p<0.02)和18.39％(p<0.02))。因此，说明本发明制备的anti-egfrviii-car3hst细胞具有高效杀伤egfrviii+u87细胞的能力。

实施例8

anti-egfrviii-car3hst细胞体内杀伤

egfrviii+u87细胞用高糖dmem培养基(含10％fbs)、37℃、5％co2培养箱中培养。长至对数期时用0.25％胰蛋白酶消化，收集至15ml离心管中，用高糖dmem培养基洗涤细胞，弃上清液。用无菌pbs重悬制成细胞密度为1×10⁶/ml的单细胞悬液备用。裸鼠(体重17-20g，6-8周龄)采取俯卧式，用75％乙醇行穿刺点消毒，垂直进针2.5mm，相当于右顶叶深部白质(即裸小鼠顶枕部)，注射10ul细胞悬液，拔针后压迫针孔片刻，接种后送回spf饲养室饲养。接种后，每天观察小鼠饮食、排便及精神等状况。一周后，若发现小鼠顶针骨向外膨出，颅内压升高，并结合mri影像学检查，则判定小鼠脑部向外膨出并形成肿瘤组织。当肿瘤体积达到约600mm³时，u87-gbm小鼠模型建立成功，将小鼠按每组10只随机分为3组。按如下将细胞溶于1mlpbs，分别于第6天和12天通过尾静脉注射小鼠体内：

实验组a组：1×10⁷anti-egfrviii-car3hst细胞；

实验组b组：1×10⁷anti-egfrviii-car-t细胞；

对照组c组：1×10⁷anti-gcc-car-t细胞(靶向其他分子的无关靶点car)；

空白对照d组：只加1mlpbs。

输注后，继续按如上方法观察，每天观察小鼠精神、饮食及排便等状况，称量小鼠体重，观察各注射点有无红肿破溃，并结合mrimri影像学检查评估肿瘤的长度和宽度，评估肿瘤体积，共观察60d。当肿瘤体积达到>2000mm³时，处死老鼠。统计各组数据，绘制图表(结果见图5)。

尾静脉注射实验组a组：anti-egfrviii-car3hst细胞与实验组b组：anti-egfrviii-car-t细胞相比，18d后，注射anti-egfrviii-car3hst细胞的小鼠颅内肿瘤逐渐缩小，直接完全消失，因此，实验组a组可诱导小鼠颅内脑胶质瘤已形成肿瘤的消退，而实验组b租只可短暂减缓肿瘤生长；尾静脉注射实验组a组与对照组c组：anti-gcc-car-t细胞(靶向其他分子的无关靶点car)和空白对照d组相比，20d后，无关靶点对照c组和d组中的小鼠出现明显的进食减少，行动迟缓，精神萎靡，肿瘤生长速度加快等现象，无肿瘤消退现象。

在实验中，我们还发现接受实验组a组细胞治疗的小鼠的中位生存期约为60天(实验组b组与空白对照d组的小鼠的中位生存期仅为是21天或18天)。因此，本发明构建的anti-egfrviii-car3hst细胞可以延缓小鼠的生存期(见图6)。

因而，anti-egfrviii-car3hst细胞能够穿过血脑屏障，发挥抗癌作用，延缓生存期。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110>山东兴瑞生物科技有限公司

<120>重组cd6基因、及利用其修饰的t细胞、制备方法和应用

<130>2018

<160>8

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3579

<212>dna

<213>homosapiens

<400>1

atggcactgccagtgaccgccctgctgctgcctctggccctgctgctgcacgcagccaga60

ccccaggttaccttgaaggagtctggtcctgtgctggtgaaacccacagagaccctcacg120

ctgacctgcaccgtctctgggttctcactcaataatgctagaatgggtgtgagctggatc180

cgtcagcccccagggaaggccctggagtggtttgcacacattttttcgactgacgaaaaa240

tccttcagaacatctctgcggagcaggctcaccctctccaaggacacctccaaaagccag300

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ttccgaggggtctggaacacagtgtgtgacagtgagtggtacccatcggaggccaaggtg1860

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ttgtccggcaggatgtactactcatgcaatggggaggagctcaccctctccaactgctcc1980

tggcggttcaacaactccaacctctgcagccagtcgctggcagccagggtcctctgctca2040

gcttcccggagtttgcacaatctgtccactcccgaagtccctgcaagtgttcagacagtc2100

actatagaatcttctgtgacagtgaaaatagagaacaaggaatctcgggagctaatgatc2160

ccctccatcgttctgggaattctcctccttggctccctcatcttcatagccttcatcctc2220

ttgagaattaaaggaaaatatgccctccccgtaatggtgaaccaccagcacctacccacc2280

accatcccggcagggagcaatagctatcaaccggtccccatcaccatgtggctcttcttc2340

gggatcactggattgctgacggcagccctctcaggttggcgcctgacagggggcgctgac2400

cgctgcgaggggcaggtggaggtacacttccgaggggtctggaacacagtgtgtgacagt2460

gagtggtacccatcggaggccaaggtgctctgccagtccttgggctgtggaactgcggtt2520

gagaggcccaaggggctgccccactccttgtccggcaggatgtactactcatgcaatggg2580

gaggagctcaccctctccaactgctcctggcggttcaacaactccaacctctgcagccag2640

tcgctggcagccagggtcctctgctcagcttcccggagtttgcacaatctgtccactccc2700

gaagtccctgcaagtgttcagacagtcactatagaatcttctgtgacagtgaaaatagag2760

aacaaggaatctcgggagctaatgatcccctccatcgttctgggaattctcctccttggc2820

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<210>2

<211>1644

<212>dna

<213>人种(homosapiens)

<400>2