一种增强脐带间充质干细胞的生存活性的方法与流程

本发明涉及干细胞技术领域，尤其涉及一种增强脐带间充质干细胞的生存活性的方法。

背景技术：

间充质干细胞(mesenchymalstemcell，msc)是一群具有很强的增殖能力和多向分化潜能的干细胞，在免疫调节和抗炎症反应方面效果显著。msc的组织来源广泛，如脐带、骨髓、脂肪等多种组织中富含msc。其中脐带是连于胚胎脐部与胎盘间索状结构的医疗废弃物，具有取材方便，不涉及医学伦理等限制的优势受到广大关注。

因此，脐带间充质干细胞在骨、软骨、肌肉、肌腱、韧带、神经、肝、内皮和心肌等组织工程方面具有广阔的临床应用前景。但是，目前关于脐带间充质干细胞的技术研究大多针对其分离、保存、冻存、复苏等培养方法，针对于提高脐带间充质干细胞生存力的发明研究很少。而本发明就增强脐带间充质干细胞的生存活性做了相关技术研究。

技术实现要素：

为了增强脐带间充质干细胞的生存活性，解决目前针对脐带间充质干细胞由于活性有限在应用上的限制等问题，本发明提供了一种增强脐带间充质干细胞的生存活性的方法。该方法采用含有脐静脉内皮细胞的外泌体的培养基培养同源的脐带间充质干细胞。

进一步地，包括以下步骤：

步骤一、取无血清培养的脐静脉内皮细胞的培养上清液，应用超速离心方法分离、提取外泌体；

步骤二、将步骤一得到的外泌体加入基础培养基中，作为条件培养基培养同源的脐带间充质干细胞。

进一步地，步骤一采用的脐静脉内皮细胞的培养上清液为无血清培养20h-28h的脐静脉内皮细胞的培养上清液。优选为24h。

进一步地，步骤一中的超速离心方法分离、提取外泌体具体为：先低温低速离心去除悬浮细胞，收集上清；再提升速度离心，去除细胞碎片，收集上清；接着再更进一步提升速度离心，去除细胞器，收集上清；最后再次提升速度超速离心，去除上清，用保存液重悬沉淀，获得外泌体。

进一步地，保存液为磷酸盐缓冲液(pbs)。

进一步地，步骤一中的超速离心方法分离、提取外泌体具体为：4℃条件下首先300g离心10min去除悬浮细胞，收集上清；1000g离心20min，去除细胞碎片，收集上清；10000g离心30min，去除细胞器，收集上清；100000g离心2h，去除上清，100ulpbs轻轻冲洗离心管底部，充分重悬，获得外泌体。

进一步地，步骤一还包括将获得的外泌体-80℃保存以备后续实验使用。

进一步地，步骤二中外泌体的浓度为60ug/ml以上(含60ug/ml)。

优选地，步骤二中外泌体的浓度为60ug/ml到100ug/ml。

进一步地，获得同源的细胞，所述脐带间充质干细胞通过脐带组织小块贴壁法分离获得，而脐静脉内皮细胞通过ⅰ型胶原酶消化培养脐静脉血管获得。

本发明的有益效果是：本发明所涉及的增强脐带间充质干细胞的生存活性的方法能促进脐带间充质干细胞的增殖、迁移及抗凋亡的生存能力，为间充质干细胞在宿主体内发挥更大的功能提供前提条件。同源细胞间减小移植免疫排斥，具有适用性、可控性、易行性。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1是贴壁后加入不含外泌体的培养基培养72h后的脐带间充质干细胞的x10倍镜下显微照片。

图2是贴壁后加入含有外泌体的培养基培养72h后的脐带间充质干细胞的x10倍镜下显微照片。

图3是对照组的增殖的脐带间充质干细胞经edu试剂盒染色后的荧光显微照片。

图4是试验组的增殖的脐带间充质干细胞经edu试剂盒染色后的荧光显微照片。

图5是对照组和试验组增殖细胞的百分比柱状图。

图6是贴壁的脐带间充质干细胞在加入外泌体的培养基中生长的示意图。

图7是外泌体浓度的选择试验柱状图。

图8是对照组的脐带间充质干细胞迁移到trans-well膜下室的荧光显微照片。

图9是试验组的脐带间充质干细胞迁移到trans-well膜下室的荧光显微照片。

图10是对照组和试验组迁移的细胞数量柱状图。

图11是对照组和试验组中的凋亡相关蛋白表达印迹图。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的技术方案做进一步的描述。以下的实施例是对本发明的进一步说明，而不是限制本发明的范围。以下实施例中采用的外泌体(exo)均为人脐静脉内皮细胞外泌体(huvec-exo)。

实施例1、增强脐带间充质干细胞的生存活性的方法

脐带间充质干细胞通过脐带组织小块贴壁法分离获得；脐静脉内皮细胞通过ⅰ型胶原酶消化培养脐静脉血管获得。

步骤一、取无血清培养24h的脐静脉内皮细胞的培养上清液，应用超速离心方法分离、提取外泌体，简要过程如下：4℃条件下首先300g离心10min去除悬浮细胞，收集上清；1000g离心20min,去除细胞碎片，收集上清；10000g离心30min,去除细胞器，收集上清；100000g离心2h，去除上清，100ulpbs轻轻冲洗离心管底部，充分重悬，获得外泌体。-80℃保存以备后续实验使用。

步骤二、加入不同外泌体浓度的条件培养基培养同源的脐带间充质干细胞，利用多种检测方式检测脐带间充质干细胞的活性指标，实验结果证明当外泌体浓度为60ug/ml时，增强脐带间充质干细胞的活性能力作用较强。其活性能力包括细胞增殖能力、细胞迁移能力和细胞抗凋亡的能力。研究证明，外泌体浓度不限于60ug/ml，当超过60ug/ml时，也能同样达到增强脐带间充质干细胞的活性能力的作用。

以下实施例将以60ug/ml为例进行详细说明，有特别说明外泌体浓度为其他数值的除外。

实施例2、细胞增值能力试验一

取对数生长期的msc细胞，以1000个/孔密度接种于96孔板中，分为2组。待其贴壁后：其中一组换成加入浓度为60ug/ml外泌体的基础培养基培养，为试验组，继续培养至72h后，在显微镜下进行拍照(见图2)。另一组换成基础培养基培养(不含外泌体)，为对照组，继续培养至72h后，在显微镜下进行拍照(见图1)。比较两组的显微照片发现试验组的细胞密度明显大于对照组，表明外泌体具有增强msc细胞增殖能力的作用。

实施例3、细胞增值能力试验二

用加入60ug/ml的huvec-exo或pbs条件培养基培养msc72小时，通过细胞增殖成像分析试剂盒5-溴-2-脱氧尿嘧啶(edu)试剂盒染色后，在荧光显微镜下拍摄msc(见图3和4)，并测定增殖细胞的百分比，每组n＝5。带有huvec-exo条件培养基的为试验组(见图6)；pbs条件培养基(不含huvec-exo)的为对照组。结果表示为来自3个独立实验的平均值±sd。如图5所示，试验组增殖细胞的百分比显著高于对照组，*表示p＜0.05。

实施例4、外泌体浓度的选择试验

发明人利用cck8(cellcountingkit-8)实验检测0ug/ml、20ug/ml、40ug/ml、60ug/ml、80ug/ml和100ug/ml六组不同浓度的外泌体条件培养脐带间充质干细胞的增殖活性。结果发现当外泌体的浓度为60ug/ml、80ug/ml和100ug/ml时，脐带间充质干细胞的增殖活性明显升高，出现显著差异，**表示p<0.01，如图7所示。试验表明外泌体的浓度为60ug/ml以上时能够显著增强脐带间充质干细胞的增殖活性。同时，80ug/ml和100ug/ml这两个浓度之间的增殖活性差别较60ug/ml和80ug/ml这两个浓度之间的差别小，说明100ug/ml之后继续增加外泌体的浓度对于增殖活性的帮助可能趋近于100ug/ml。而提高外泌体的浓度会增加成本，故采用外泌体浓度在60ug/ml到100ug/ml为佳。

实施例5、细胞迁移能力试验

将msc种植在trans-well膜的上室，在下室加入60ug/ml的huvec-exo或pbs条件培养基培养72小时后，用荧光显微镜拍摄并统计迁移到下室的细胞数目(见图8和9)。带有huvec-exo条件培养基的为试验组；pbs条件培养基(不含huvec-exo)的为对照组。数据表示为来自3个独立实验的平均值±sd。如图10所示，试验组细胞迁移数量极显著高于对照组，***表示p＜0.001。

实施例6、对凋亡相关蛋白表达的影响试验

内皮细胞外泌体可以改善脐带间充质干细胞的凋亡情况。采用annexin-v检测细胞的凋亡相关蛋白的表达情况，发现与对照组相比，加入外泌体后聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(parp)、b淋巴细胞瘤-2基因(bcl-2)等抗凋亡指标升高，而与凋亡相关的bcl-2-associatedx的蛋白质(bax)、活化的半胱天冬酶(cleavedcaspase3)表达降低(见图10)。该试验以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)为内参蛋白。加入了外泌体(exo)的为试验组，未加入外泌体的为对照组。结果表示脐静脉内皮细胞外泌体可以改善msc的凋亡情况。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。