一种卤代苯酚降解菌株及其生产的菌剂的制作方法

本发明属于生物高技术领域，涉及一种卤代苯酚降解菌株及其生产的菌剂。

技术背景

卤代芳烃类化合物多具有化学性质稳定，化学性能优越的优点，可作为农药、药物及各类中间体，被广泛运用于工农业生产，产生了巨大的经济和社会效益，大大改善了人类的生活。但卤代芳烃同时也具有高毒性、高稳定性的特点，可在环境中长期稳定存在，有一定刺激性、致癌性、致畸性与神经和生殖毒性等。卤代芳烃污染对生态环境以及人类健康造成了严重的威胁，因此卤代芳烃污染环境的治理已成为当前科学研究的热点。

卤代苯酚是一类重要的化工中间体，也是许多复杂的卤代芳烃在环境中代谢的重要中间产物。由于卤素元素的电负性极强，易与生命细胞中的酶系统结合，导致这类化合物稳定性高、毒性强，易在环境中迁移，造成了严重的土壤和水体等面源污染。2,4-二氯苯酚(2,4-dichlorophenol,2,4-dcp)是一种重要的农药和医药中间体。比如，在农药上可合成有机磷杀虫剂丙硫磷、除草剂2,4-滴、2,4-滴丁酯、禾草灵、甲羧除草醚、甲氧除草醚、唑啶草酮、丙炔恶草酮以及新杀菌剂氰菌胺等。医药方面可作为药物硫双二氯酚的重要原料。由于除草剂2,4-滴等的大量使用，导致2,4-dcp在环境中被广泛检出，对生态环境与人类健康构成了巨大威胁。

微生物是环境中污染物降解的主力军，利用微生物的降解作用消除土壤中的卤代芳烃是一种经济的、安全的、有效的和无二次污染的方法，具有广阔的应用前景。

技术实现要素：

技术问题本发明针对环境修复的实际问题与重要需求，开发研制出一种新型的卤代苯酚污染修复菌剂，使用本菌剂可以使土壤和水体中2,4-dcp的残留量降低95％以上，且生产成本较低。

技术方案下面为本发明的主要内容：

本发明提供一株高效降解卤代苯酚的微生物菌株。该菌株为革兰氏染色反应阴性菌株dcp-2，2019年12月23日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno：m20191083,经鉴定为boseasp.(图2)。菌株dcp-2的形态学特征为：lb平板上生长时菌落呈米黄色，圆形，小而凸起，表面干燥，边缘整齐，不透明；透射电子显微镜下菌株dcp-2呈杆状(0.9μm×2.0μm)，端生鞭毛(图1)。菌株dcp-2的生理生化特征为：需氧，能运动，革兰氏染色呈阴性；吲哚反应为阴性，不能水解淀粉，不能氧化葡萄糖产酸，过氧化氢酶和氧化酶阳性，使石蕊牛乳凝固；对链霉素，壮观霉素有耐受性。菌株dcp-2能以2,4-dcp为唯一碳源和能源生长，在实验室摇瓶培养条件下降解率达99％以上。该菌株可以用发酵工业通用发酵设备进行生产。

本发明所述的降解菌株dcp-2在降解卤代苯酚中的应用；所述的卤代苯酚选自2,4-dcp、邻氯苯酚、对氯苯酚和间氯苯酚中的任意一种或多种；优选2,4-dcp。

本发明所述的降解菌株dcp-2在制备卤代苯酚降解菌剂中的应用；所述的卤代苯酚选自2,4-dcp、邻氯苯酚、对氯苯酚和间氯苯酚中的任意一种或多种；优选2,4-dcp。

一种用所述的卤代苯酚降解菌株生产的卤代苯酚降解菌剂。

使用上述卤代苯酚降解菌生产菌剂的工艺为：斜面种－摇瓶种－种子罐－生产罐－产品(包装剂型为液体菌剂或固体吸附菌剂)。

本发明的详细实施步骤为：

1)将卤代苯酚降解菌dcp-2的试管种接种于lb培养基摇瓶中，振荡培养至对数期；

2)将上述培养好的菌液按10％的接种量接种入种子罐，培养至对数生长期，种子罐所用的培养基配方为：葡萄糖8gl^-1，酵母膏5gl^-1，k2hpo41gl^-1，nacl5gl^-1，caco32gl^-1，mgso40.2gl^-1，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；

3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同；

4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8，搅拌速度为180-240rpm，培养温度为30℃，全流程培养时间为96小时,发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上,发酵液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

本发明所述的菌剂在降解卤代苯酚中的应用，所述的卤代苯酚选自2,4-dcpp、邻氯苯酚、对氯苯酚和间氯苯酚中的任意一种或多种；优选2,4-dcp。

本发明所述的菌剂优选在降解土壤中2,4-dcp的应用。

有益效果

本发明提供一株能够高效、快速降解卤代苯酚的细菌dcp-2。降解菌dcp-2具有较广的降解谱，可降解2,4-dcp、邻氯苯酚、对氯苯酚和间氯苯酚等多种卤代芳烃。降解菌dcp-2具有较高的降解效率，可在54小时内完全降解50mgl^-1的2,4-dcp。具有广泛的应用潜力和价值。使用该细菌生产的降解菌剂具有生产使用成本低，使用方便，修复效果好的优点，适合在全国受卤代芳烃污染的化工园区、农业生产区、粮油蔬菜生产出口基地或有绿色食品商标标志的地方大面积推广使用。本发明对于治理卤代苯酚污染，保护生态环境，防治地下水污染，保护人民的身体健康等方面具有重要的意义。

本发明成功地解决了工农业生产活动中造成的卤代苯酚的污染问题，从而保护生态环境，维护人类健康。

附图说明

图1菌株dcp-2在lb平板上的菌落形态和电镜照片

图2菌株dcp-2的16srrna基因系统发育分析

图3菌株dcp-2对2,4-dcp的生长和降解曲线

图4温度对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

图5ph对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

图6接种量对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

图7菌株dcp-2的底物谱

生物材料保藏信息

dcp-2，分类命名为boseasp.dcp-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno：m20191083，保藏日期为2019年12月23日，保藏地址为中国武汉·武汉大学。

具体实施方式

实施例1、菌株的分离与鉴定

本发明提供一种能高效降解卤代苯酚的菌株及其生产的菌剂，所用菌株为革兰氏染色阴性菌株dcp-2，分离自江苏南京某农药厂厂区的土壤中。菌株具体的分离筛选方法为：

取10.0g污染土样加入到100ml含有50mgl^-12,4-dcp的无机盐(以下简称mm)培养基，30℃、150rpm摇床培养7d，以15％接种量(v/v)转接至新鲜的经同样处理的培养基中，连续富集培养四次。紫外分光光度计检测第五代富集液的降解情况。将有效果的第五代富集液在含有50mgl^-12,4-dcp的mm固体培养基上稀释涂布，30℃培养5d。挑取平板上的单菌落于3ml液体lb试管培养基中，然后保存并转接至20ml含有50mgl^-12,4-dcp的mm培养基中，30℃培养5d。用等体积的二氯甲烷萃取，紫外分光光度计检测效果，从而获得2,4-dcp降解菌株。

2019年12月23日寄存于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为cctccno：m20191083，经鉴定属于boseasp.。菌株dcp-2的形态学特征为：lb平板上生长时菌落呈米黄色，圆形，小而凸起，表面干燥，边缘整齐，不透明；透射电子显微镜下菌株dcp-2呈杆状(0.9μm×2.0μm)，端生鞭毛(图1)。菌株dcp-2的生理生化特征为：需氧，能运动，革兰氏染色呈阴性；吲哚反应为阴性，不能水解淀粉，不能氧化葡萄糖产酸，过氧化氢酶和氧化酶阳性，使石蕊牛乳凝固；对链霉素，壮观霉素有耐受性。将菌株dcp-2的16srrna基因序列(seqidno.1)在数据库ezbiocloud中比对分析，结果显示菌株dcp-2与bosea属亲缘关系最近，其中与bosearobiniaedsm26672^t相似性达99.65％，与boseathiooxidansdsm9653^t相似性达99.15％。结合菌落形态特征、生理生化特性以及16srrna基因系统发育分析，菌株dcp-2初步鉴定为bosea属(图2)。

实施例2、实验室降解实验

2.1菌株dcp-2对2,4-dcp的生长利用和降解

高效液相色谱法检测dcp-2：取3ml样品，12,000rpm离心5min，小心吸取上清，加入25％的盐酸，将ph调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后0.5ml甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测。检测条件：高效液相色谱仪为岛津rid-10a；色谱柱为c18反相柱，规格250mm×4.6mm；柱温40℃；流动相为甲醇:水:乙酸(80:20:0.5,v:v:v)，流速为1.0mlminl^-1；检测波长为220nm和235nm。

将菌株dcp-2按终浓度0.2(od600值)的接种量接至含有50mgl^-12,4-dcp的100mlmm中，30℃、150rpm摇床培养，每隔6h取样4ml，取至54h。其中1ml用于检测菌体的浓度(od600值)，绘制菌株生长曲线；另外3ml用于hplc检测2,4-dcp的浓度，绘制其降解曲线。结果如图3所示，菌株dcp-2可在54h内完全降解50mgl^-1的2,4-dcp，并能以其为唯一碳源生长，菌体浓度(od600值)由初的0.2增至0.23。

2.2种子液制备

挑取菌株dcp-2单菌落至100ml添加有50mgl^-12,4-dcp的lb液体培养基中，30℃，150rpm摇床培养至菌体生长对数期，6,000rpm离心5min收集菌体，用灭菌的mm培养基洗涤菌体2次，再用10ml灭菌的mm培养基重悬，此即为菌体种子液。

2.3环境因素对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

2.3.1温度对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

在装有20mlmm液体培养基的50ml锥形瓶中添加50mgl^-1的2,4-dcp作为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为od600＝0.2，混合均匀后立即取3ml菌液，12,000rpm，离心5min取上清，作为对照。然后分别置于不同温度(4℃、16℃、25℃、30℃、35℃、37℃和45℃)的摇床中，150rpm培养30h后取样3ml离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将ph调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后0.5ml甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算2,4-dcp的降解率。每种处理设三个重复。结果如图4所示，菌株dcp-2对2,4-dcp的最适降解温度为30℃。

2.3.2ph对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

在装有20ml不同ph(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0)的mm液体培养基50ml锥形瓶中添加50mgl^-1的2,4-dcp为唯一碳源，接种种子液至初始菌体浓度为od600＝0.2，混合均匀后立即取3ml菌液，12,000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、150rpm摇床培养30h后取样3ml离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将ph调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后0.5ml甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算2,4-dcp的降解率。每种处理设三个重复。结果如图5所示，菌株dcp-2在ph7.0时对2,4-dcp的降解效果最好。

2.3.3接种量对菌株dcp-2降解2,4-dcp的影响

按1％、3％、5％、8％、10％与12％的接种量将种子液分别接入含50mgl^-12,4-dcp的20mlmm培养基中，混合均匀后立即取3ml菌液，12,000rpm，离心5min取上清，作为对照。30℃、150rpm摇床培养30h后取样3ml离心，取上清，与对照上清液分别加入25％的盐酸，将ph调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后取2ml二氯甲烷相吹干，然后0.5ml甲醇复溶，用孔径为0.22μm有机相滤膜过滤后用hplc检测，计算2,4-dcp的降解率。由图6所示，接种量的大小对2,4-dcp的降解效率有直接的关系，接种量越大，2,4-dcp的降解效率就越高。

2.4菌株dcp-2的降解底物谱

菌株dcp-2的种子液分别接种到50mgl^-1不同卤代苯酚类化合物(2,4-dcp、邻氯苯酚、对氯苯酚、间氯苯酚和2,4,6-三氯苯酚)的20mlmm液体培养基中，30℃、150rpm摇床振荡培养60h后取培养液，加入25％的盐酸，将ph调至3.0左右。然后，用等体积的二氯甲烷萃取，无水硫酸钠除水后利用紫外分光光度计检测不同化合物的降解情况。结果显示菌株dcp-2可以降解2,4-dcp、邻氯苯酚、对氯苯酚和间氯苯酚(图7)，但不能降解2,4,6-三氯苯酚。

实施例3菌剂制备

将本发明的卤代苯酚降解菌株dcp-2的原种在培养皿上活化，并接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200mllb培养基(lb培养基配方：蛋白胨10gl^-1，酵母粉5gl^-1，氯化钠5gl^-1，ph7.4)的1,000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期，准备接种一级种子罐。一级种子罐50l，投料量40l，培养基配方为：葡萄糖8gl^-1，酵母膏5gl^-1，k2hpo41gl^-1，nacl5gl^-1，caco32gl^-1，mgso40.2gl^-1，大豆油0.1％(v/v)，ph值7.2-7.5；投料完毕后高压蒸汽灭菌，冷却至30℃后，将上述培养好的摇瓶菌种按10％的接种量接种入50l一级种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220rpm，无菌空气通入量为1:0.8。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入二级种子罐。二级种子罐500l，投料量400l，培养基配方和培养条件与一级种子罐一致。将到达对数期的种子液按10％的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐高压蒸汽灭菌，灭菌后冷却至30℃，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在30℃，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.8，搅拌速度为220rpm，整个工艺流程培养时间为96小时。发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上。

发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。

实施例4土壤降解实验

采取菜园土作为供试土样。将土样过2mm筛，取一定量的2,4-dcp粉剂溶于100ml甲醇中，然后浸泡硅藻土，使化合物被完全吸附。浸泡后的硅藻土置于通风橱中吹干，将其拌入土壤中，使土壤中2,4-dcp的浓度约为50mgkg^-1。取土样500g，按10％的接种量接入dcp-2种子液，于30℃恒温培养箱中培养，以接入等量无菌mm液体的土样作为对照，土壤的持水量保持在60％。5d后取样检测，每种处理每次取3个样品，每个样重20g。样品用等体积的甲醇震荡萃取2次，合并两次的甲醇，氮气吹干后，使用1ml甲醇重溶样品，然后hplc检2,4-dcp的残留量。测定结果如表1所示，5天后检测发现，菌株dcp-2对2,4-dcp的降解率达到95.6％。以上结果说明，菌株dcp-2在施入土壤中后，没有出现不降解或降解效率急剧下降的现象，其降解性能稳定，这就为菌株dcp-2对2,4-dcp污染土壤的修复提供了科学依据。

表1菌株dcp-2在土壤中对三种除草剂的降解

序列表

<110>南京农业大学

<120>一种卤代苯酚降解菌株及其生产的菌剂

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1448

<212>dna

<213>bosea属(boseasp.)

<400>1

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