一种小麦千粒重和粒长基因TaGS3-4A的分子标记及其应用的制作方法

本发明涉及小麦分子生物技术与育种应用领域，具体地说是一种小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记及其应用。

背景技术：

小麦(triticumaestivuml.)是世界上最重要的粮食作物之一，提高产量是小麦最重要的育种目标。亩穗数、穗粒数和粒重共同构成产量三要素，其中粒重遗传力高、表型稳定，高产育种过程中对粒重的选择最为有效(alexanderetal.,1984)，而增加粒长和粒宽是提高小麦粒重的有效方式。我国小麦增产过程中粒重的提高发挥了关键作用，千粒重由上世纪40年代的31.5g提高到近年的44.64g，平均每十年提高2.19g(wangetal.,2012；zhangetal.,2012)。克隆小麦中调控籽粒大小的关键基因，发掘优异等位变异，开发功能标记，将有效丰富小麦高产基因资源，促进小麦高产分子育种的发展。

同源克隆是挖掘新基因的重要途径，利用微核心种质(mcc)进行基因优异等位变异的筛选已广为应用(郝晨阳等，2008)。近几年，已同源克隆了多个与籽粒大小相关的基因，分析其优异等位变异，并开发了分子标记(maetal.,2012；changetal.,2013)。su等(2011)发现，在tagw2-6a启动子区域存在hap-6a-a和hap-6a-g两种单倍型。hap-6a-a增加千粒重达3g以上，为优异单倍型，在育种中被强烈选择。jiang等(2011)报道，tasus2的两种单倍型hap-h和hap-l与千粒重相关，而且高千粒重相关的单倍型hap-h在育成品种中被强烈选择。zhang等(2012)鉴定出tackx6-d1的5种单倍型，其中hap-a与高千粒重显著相关，为优异单倍型。zhang等(2014)对tags-d1进行标记/性状关联分析，在175个育成品种中检测到tags-d1a与高千粒重显著相关。jiang等(2015)对tacwi-4a和tacwi-5d开展标记/性状关联分析，在我国348个主要育成品种中检测到hap-5d-c与高千粒重显著关联。ma(2016)利用tags5的等位变异开发了区分tags5-3a-t和tags5-3a-g的caps标记，关联分析发现tags5-3a-t与籽粒大小和粒重相关。总之，行业内的相关研究人员正在积极地克隆与高产相关的基因并开发相关的分子标记，以利用分子标记辅助选择育种，为提高目标性状选择，达到改良作物的目的。但是，迄今为止，行业内还没有报到关于小麦基因tags3-4a的千粒重和粒长的优异单倍型，因此克隆小麦调控籽粒大小的关键基因，发掘优异等位变异，开发增加小麦千粒重和粒长的功能标记，为小麦分子辅助育种、选育更多高产小麦品种增加一条新的有效途径。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记及其应用，用于高效鉴定小麦品种或品系中基因tags3-4a是否携带增加小麦千粒重和粒长优异单倍型，为丰富小麦高产基因资源，促进小麦高产分子育种的发展提供科学手段。

本发明是通过以下方法实现的：一种小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记，该分子标记是小麦增加千粒重和粒长优异单倍型的分子标记，由分子标记caps-4a-357/713和分子标记indel-4a-351一对成套的分子标记组成；

所述分子标记caps-4a-357/713为小麦基因组中tags3-4a的核苷酸序列seqidno:1中所对应的第357和713位核苷酸，分子标记caps-4a-357/713的上游引物caps-4a-357/713-f如seqidno:2所示、下游引物caps-4a-357/713-r如seqidno:3所示，以所述上、下游引物对小麦基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物分别用hpy188i和bsri酶切，酶切产物分别进行电泳检测，扩增产物在hpy188i酶切后获得分子量大小分别为537bp和265bp的两个目的条带或540bp和265bp的两个目的条带，且扩增产物在bsri酶切后获得分子量大小为181bp和621bp的两条目的条带或184bp和621bp的两条目的条带；

所述分子标记indel-4a-351为小麦基因组中tags3-4a的核苷酸序列seqidno:1中所对应的第351位核苷酸，分子标记indel-4a-351的上游引物indel-4a-351-f如seqidno:4所示、下游引物indel-4a-351-r如seqidno:5所示，以上、下游引物对小麦基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物电泳分离，获得扩增产物的分子量大小为198bp、200bp或201bp的任意一条目的条带。

本发明克隆了小麦kn9204中基因tags-4a的核苷酸序列，如seqidno:1所示；其中分子标记caps-4a-357/713的引物是根据小麦基因组dna中对应序列表seqidno:1的第357位核苷酸为g或缺失和713位核苷酸为t或a进行的设计；分子标记indel-4a-351的引物是根据小麦基因组dna中对应序列表seqidno:1的第351位核苷酸的3bp的act串联插入/缺失(insertion/deletion)进行的设计；以分子标记caps-4a-357/713的上、下游引物和分子标记indel-4a-351的上、下游引物对小麦基因组dna进行pcr扩增，确定tags3-4a的基因序列seqidno:1中351bp处为act缺失(351-0)或act(351-1act)，且357bp处为g(357-g)，且713bp处为t(713-t)为增加千粒重和粒长优异单倍型的小麦品种或品系，为本发明的分子标记。

所述分子标记caps-4a-357/713和所述分子标记indel-4a-351中pcr扩增体系均为20μl，分别包括2×taqpcrmastermix10μl、上下游引物各1μl、dna模板1μl、其余用ddh2o补足。

所述分子标记caps-4a-357/713的pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

所述分子标记indel-4a-351的pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本发明还提供了所述的分子标记在分子辅助育种中的应用。

所述应用是指利用所述分子标记鉴定基因tags3-4a是否为增加千粒重和粒长优异单倍型的小麦品种或品系，其方法包括以下步骤：

(1)提取待鉴定小麦样品的基因组dna；

(2)以分子标记caps-4a-357/713的上、下游引物对小麦基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物用hpy188i酶切，电泳检测，即能够获得分子量大小分别为537bp和265bp的两条目的条带或540bp和265bp的两条目的条带，或获得分子量大小为802bp、804bp或808bp的任意一条目的条带；将扩增产物用bsri酶切，电泳检测，即能够获得分子量大小为181bp和621bp的两条目的条带或184bp和621bp的两条目的条带或187bp和621bp的两条目的条带，或获得分子量大小为804bp的一条目的条带；

(3)以分子标记indel-4a-351的上、下游引物对小麦基因组dna进行pcr扩增，将扩增产物电泳分离，即会获得扩增产物的分子量大小为198bp、200bp、201bp或204bp的任意一条目的条带；

(4)扩增结果中，若待测样品采用分子标记caps-4a-357/713检测，用hpy188i酶切检测后获得分子量大小为537bp和265bp的两条目的条带或540bp和265bp的两条目的条带，且用bsri酶切检测后获得分子量大小为181bp和621bp的两条目的条带或184bp和621bp的两条目的条带，以及采用分子标记indel-4a-351检测后获得扩增产物的分子量大小为198bp、200bp或201bp的任意一条目的条带，则该样品为基因tags3-4a增加千粒重和粒长优异单倍型的小麦品种或品系。

应用中步骤(2)所述分子标记caps-4a-357/713的上游引物caps-4a-357/713-f如seqidno:2所示、下游引物caps-4a-357/713-r如seqidno:3所示。

应用中步骤(3)所述分子标记indel-4a-351的上游引物indel-4a-351-f如seqidno:4所示、下游引物indel-4a-351-r如seqidno:5所示。

所述应用中，分子标记caps-4a-357/713和所述分子标记indel-4a-351中pcr扩增体系均为20μl，分别包括2×taqpcrmastermix10μl、上下游引物各1μl、dna模板1μl、其余用ddh2o补足。

所述应用中，所述分子标记caps-4a-357/713的pcr扩增的程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃终延伸10min，4℃保存；所述分子标记indel-4a-351的pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。

本发明中小麦品种科农9204，属半冬性，中熟杂交小麦品种，品种审定编号：国审麦2003037。

本发明提供的小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记及其应用，该分子标记由分子标记caps-4a-357/713和分子标记indel-4a-351一对成套的分子标记组成；其中分子标记caps-4a-357/713的引物是根据小麦基因组dna中基因tags3-4a对应序列表seqidno:1的第357位核苷酸为g或缺失和713位核苷酸为t或a进行的设计；分子标记indel-4a-351的引物是根据小麦基因组dna中基因tags3-4a对应序列表seqidno:1的第351位核苷酸的3bp的act串联插入/缺失(insertion/deletion)进行的设计，通过pcr扩增结果和表型鉴定的关联分析证明，分子标记caps-4a-357/713和分子标记indel-4a-351成套联合使用，可以有效筛选出基因tags3-4a为增加小麦千粒重和粒长优异单倍型(hap-4a-1和hap-4a-2)的小麦品种或品系。因此，本发明所公开的tags3-4a基因的等位变异和成套分子标记caps-4a-357/713和indel-4a-351在小麦分子辅助育种中具有较大的应用空间。

附图说明

图1为基因tags3-4a在小麦不同组织表达特异性分析结果。

图2为小麦基因tags3-4a的351和357位点部分序列比对。

图3为小麦基因tags3-4a的713位部分点序列比对。

图4为小麦基因tags3-4a的351位点的分子标记检测结果。

图5为小麦基因tags3-4a的357位点的分子标记检测结果。

图6为小麦基因tags3-4a的713位点的分子标记检测结果。

具体实施方式

下面实施例用于进一步详细说明本发明，但不以任何形式限制本发明。

实施例1基因tags3的克隆

利用常规ctab法提取六倍体小麦品种kn9204(科农9204)的基因组dna，对tags3基因区进行扩增，采用的扩增引物为上游引物tags3-f和下游引物tags3-r，其核苷酸序列分别为：

上游引物tags3-f：5’-caatggcggcgcccaggc-3’；

下游引物tags3-r：5’-tggaacacaggcagcagcgagg-3’。

扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，回收扩增片段连接t载体并进行测序；通过enseblplants(http://plants.ensembl.org/index.html)与六倍体小麦中国春中三个tags3同源基因序列traescs7a02g017700、traescs7d02g015000、traescs4a02g474000比对，确定kn9204中tags3-4a核苷酸序列，序列如seqidno:1所示。

实施例2tags3-4a基因表达模式及表达量差异分析

利用定量pcr对tags3-4a基因进行表达模式和表达量差异分析，对小麦根、茎、旗叶、穗等不同组织器官以及穗和籽粒发育不同时期(7天间隔)取材，提取rna，dnase消化dna污染，进行cdna反转录；设计特异引物，其引物及核苷酸序列为：

上游引物tags3-4a-mf：5’-gatctgcggcggcgggtgctct-3’；

下游引物tags3-4a-mr：5’-cgagcagccacacgagggcccg-3’。

以上述一对引物进行荧光定量pcr扩增，检测tags3-4a基因的相对表达量；同时，以gadph为内参基因，以上游引物gapdh-f：5’-ttagacttgcgaagccagca-3、下游引物gapdh-r：5’-aaatgcccttgaggtttccc-3’进行荧光定量pcr扩增。扩增结果如图1所示，kn9204中tags3-4a基因在发育的种子中表达量相对较高。

实施例3tags3-4a基因核苷酸序列多态性分析

利用常规ctab法提取小麦材料的基因组dna，对不同小麦材料的tags3-4a基因区进行扩增，采用的扩增引物为：

上游引物tags3-4a-f：5’-ctgctgttactctgttattattac-3’；

下游引物tags3-4a-r：5’-caagaactgcctgtacagtc-3’。

扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，回收扩增片段进行测序；利用dnaman进行序列比对，结果如下所示。

第一、tags3-4a基因在第一个内含子351bp处存在一个3bp串联插入/缺失，形成三种等位变异类型，部分序列如图2所示，图中显示：

当351位点的核苷酸为缺失时，tags3-4a基因的等位变异类型为351-0；

当351位点的核苷酸为act时，tags3-4a基因的等位变异类型为351-1act；

当351位点的核苷酸为actact时，tags3-4a基因的等位变异类型为351-2act。

第二、tags3-4a基因在第一个内含子357bp处存在一个snp，形成两种等位基因类型，部分序列如图2所示，图中显示：

当357位点的核苷酸为缺失时，tags3-4a基因的等位变异类型为357-0；

当357位点的核苷酸为g时，tags3-4a基因的等位变异类型为357-g。

第三、tags3-4a基因在第二个内含子713bp处存在一个snp，形成两种等位基因类型，部分序列如图3所示，图中显示：

当713位点的核苷酸为t时，tags3-4a基因的等位变异类型为713-t；

当713位点的核苷酸为a时，tags3-4a基因的等位变异类型为713-a。

根据351、357位点和713位点的等位变异确定tags3-4a基因的单倍型如下：

表1351、357和713位点的等位变异及tags3-4a的单倍型

实施例4tags3-4a基因功能性分子标记的开发

(1)利用常规ctab法提取小麦材料的基因组dna，对tags3-4a基因713和357位点所在核苷酸区进行pcr扩增，扩增引物为：

上游引物caps-4a-357/713-f：5’-ctgctgttactctgttattattac-3’(seqidno:2)；

下游引物caps-4a-357/713-r5’-caagaactgcctgtacagtc-3’(seqidno:3)。

pcr扩增体系为20ul，包括2×taqpcrmastermix10ul,上下游引物各1μl，dna模板1μl，其余用ddh2o补足；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min/kb，33个循环；72℃终延伸10分钟，4℃保存。将上述扩增产物分别用hpy188i和bsri酶切。酶切产物均进行质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并根据酶切结果判断并记录待测小麦在所述713和357位点的情况，如图5和图6所示。

①若pcr产物在hpy188i酶切后电泳得到大小分别为537bp和265bp的两个目的条带或540bp和265bp的两个目的条带，则tags3-4a基因的713位点等位变异类型为713-t；若pcr产物hpy188i酶切后电泳得到大小为802bp、804bp或808bp任意一个目的条带，则tags3-4a基因的713位点等位变异类型为713-a，如图6所示。图6中16份小麦材料样本分别是：1、晋春3号(析春矮2号)；2、梁来友白皮小麦；3、山西白麦；4、牛趾甲；5、麻花板；6、假红麦；7、红金麦；8、丰抗2号(5248)；9、长治6406；10、北京8号；11、铭贤169；12、东方红3号；13、京红5号；14、内麦11；15、定兴寨；16、大红麦。

②若pcr产物在bsri酶切后电泳得到大小分别为181bp和621bp的两个目的条带或184bp和621bp的两个目的条带或187bp和621bp的两个目的条带，则tags3-4a基因的357位点等位变异类型为357-g；若pcr产物在bsri酶切后电泳得到大小为804bp的一条目的条带，则tags3-4a基因的357位点等位变异类型为357-0，如图5所示。图5中22份小麦材料样本分别为：1、山西白麦；2、丰抗2号(5248)；3、长治6406；4、北京8号；5、铭贤169；6、东方红3号；7、线麦；8、江东门；9、京红5号；10、内麦11；11、晋春3号(析春矮2号)；12、梁来友白皮小麦；13、定兴寨；14、大红麦；15、牛趾甲；16、麻花板；17、假红麦；18、红金麦；19、原冬822；20、吕旱328；21、江西早；22、红花早。

(2)分子标记indel-4a-351的开发：利用常规ctab法提取小麦材料的基因组dna，对tags3-4a基因351位点所在核苷酸区进行pcr扩增，扩增引物为：

上游引物indel-4a-351-f：5’-tgctgttactctgttattatta-3’(seqidno:4)；

下游引物indel-4a-351-r：5’-taacacttagaatctactac-3’(seqidno:5)。

pcr扩增体系为20μl，包括2×taqpcrmastermix10μl、上下游引物各1μl、dna模板1μl、其余用ddh2o补足；pcr扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，33个循环；72℃终延伸10min，4℃保存。将上述扩增产物进行质量百分比浓度为12％的聚丙烯酰胺凝胶电泳，电压140伏，3.5小时。通过银染识别pcr产物片段大小，并根据如下方法判断并记录待测小麦在所述351位点的情况，如图4所示。图4中12个小麦材料样本分别为：1、晋春3号(析春矮2号)，2、梁来友白皮小麦；3、定兴寨；4、大红麦；5、京红5号；6、内麦11；7、山西白麦；8、铭贤169；9.牛趾甲；10.麻花板；11.假红麦；12.红金麦。

①若待测小麦的pcr产物大小为204bp的片段(最大)，则所述待测植物基因组中tags3-4a基因的等位变异类型为351-2act；

②若待测小麦的pcr扩增产物大小为200bp或201bp的片段(居中)，则所述待测植物基因组中tags3-4a基因的等位变异类型为351-1act；

③若待测小麦的pcr扩增产物大小为198bp的片段(最小)，则所述待测植物基因组中tags3-4a基因的等位变异类型为351-0。

实施例5tags3-4a基因多态性位点的功能验证应用

利用实施例3和4所得到的基因单倍型位点和分子标记引物，采用如上所述的扩增体系及扩增条件，在我国小麦微核心种质进行tags3-4a基因的功能验证，对千粒重、粒长、粒宽多年多点的表型数据进行标记/性状的关联分析。本实施例全部小麦微核心种质材料tags3-4a基因单倍型鉴定数据详见表2。

表2小麦微核心种质材料中tags3-4a基因型鉴定数据

关联分析具体结果见表3。表3显示：hap-4a-1和hap-4a-2与hap-4a-3相比在2002年、2005年、2006年、2010年和2016年的千粒重差异分别为5.33-5.47g、3.79-3.98g、3.23-3.57g、6.17-3.26g和5.12-4.82g，差异达到显著和极显著水平(p＜0.05或p＜0.01)；与hap-4a-3相比，hap-4a-1单倍体在五年中的四年显著增加籽粒长度0.30-0.43mm(p＜0.05或p＜0.01)。可见，等位变异hap-4a-1和hap-4a-2为优异等位变异，由此得出小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记由分子标记caps-4a-357/713和分子标记indel-4a-351一对成套的分子标记组成。

表3小麦微核心种质材料中tags3-4a基因及籽粒相关性状的关联分析

注：02ly表示洛阳(2002年)；05ly表示洛阳(2005年)；06ly表示洛阳(2006年)；10sy表示北京顺义(2010年)；16lc表示栾城(2016年)。大写字母表示p＜0.01，小写字母表示p＜0.05因此，分子标记caps-4a-357/713和indel-4a-351成套联合使用，可有效筛选出能够显著提高小麦千粒重及粒长的小麦tags3-4a基因优异单倍型hap-4a-1和hap-4a-2，可作为提高小麦千粒重和粒长、进行小麦高产分子标记辅助育种的功能标记。

上述实施例为本发明优化的实施方案，仅用于说明本发明而非限制本发明。本领域的技术人员在不脱离本发明实施方案的宗旨和原理的基础上所作的修改或等同替换，均属于本发明要求保护的范围。

sequencelisting

<110>中国科学院遗传与发育生物学研究所农业资源研究中心

河北经贸大学

<120>一种小麦千粒重和粒长基因tags3-4a的分子标记及其应用

<130>

<160>5

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>1936

<212>dna

<213>tags3-4a

<400>1

atggcggcgcccaggcccaagtccccgctcgacccctgcggccgccaccggctgcagctc60

gccgtcgacacgctccaccgccagatcagcttcctcgaggtacccaagctcctgacctta120

atcgctcttcctggttggctcccgcaccacagccctgttacatggtgccctgctgctgct180

gttactctgttattattacgcaagaaaattactaatttgcaattgagcctacacaacaaa240

tgattaccattttttatacagtagtaggtattagagtctgttaccagcacacagtttagt300

tgtcacttctaagtcagttccaggtgtccctttctactactactactactactactggta360

gtagattctaagtgttagaatatcccacacagcagcctgaaaagttggcacatgccctct420

cctccttgtactctagcttgtagctactgcttttttttcagtaaaaaataatttctctgg480

aattcaacaagctgttctctctgtgccagggggagatcagttccattgaagggctccatg540

ctgcctccatatgctgcaaagagtaagctgctgtcttgttcaattcttatactatcaatt600

tcctttttgaagtttaagaggtaacttggggagtgaaaacaagaaacagttctccggctc660

caagaatggggaacaatccattgcaagtgagcccatgtttgaacaaagtcgttcagacag720

gtgcaacacatctacatggatgtgtgaaagcaacacagattttagttaaaacctacaaat780

ggaagtttagcaaatccggtaatgattgaaaatagtatacacgtacagttgaacattatg840

caaatctggtaacgatagtttaggaggtttggttacttgaaatttgattaggatgattga900

ttgtatttaaacatatgaatatgttttagaattggacctaaattatatagggttgcggtg960

actgtacaggcagttcttgtatttctgtctccagtcttagtgccactgtttactttattc1020

ttcttcataaatgaatatcagcgtaagctgcagacgtagcagtcaggtcatgtgtgcaaa1080

agccaaaaatatgtaattcttcttcatatgtcaatcagttcacatagttgtgccaatttt1140

aagttaattttcttcttgttcatgacatatggagctgattgatcgctgtttgcccctttg1200

ataaaatttgcagggtcgatgagttcataggaaagaatgccgatccattcataacgatgt1260

atggattttcaggttgagaaattgtcttggcctacaagatatctttgttcttactagtat1320

ctctctttacaagcttgcagttcatctgagaaggggaacgccgatcaatctcatcgctcc1380

ccaaagaagattcggtaatcattttcttcccgcagatcctaatatatgtcgacggttctc1440

tcgaaagaaaatgatgccggatcaacccaagctgatgcaaattgttgtactaaactgcac1500

atgtttatatttaaaagttttggaatgttgataattttcccagttttacatctgcgctct1560

acaaaccataacaattatgaatcagccagcaatgcatgcatcgatttgaactcggtttta1620

gtagtctcgttgtaatgaactgactgaggggaatgttaatgtttgtgcctgcagaacccg1680

gtgggcgtgtttgagctgcttcccgtggatctgcggcggcgggtgctctgccgtccagct1740

caaggggccgagctgctgccgcggatgcccccgctgctgcgcggggagcgggggctgcgg1800

cggcggcgggccctcgtgtggctgctcgtgctcctgcgccggctgctcctcctcttgcgc1860

gtgccctgcctgtgccggctgcggccccgtgtgctgcggcggtgtccctcgccctcgctg1920

ctgcctgtgttcctga1936

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>上游引物caps-4a-357/713-f

<400>2

ctgctgttactctgttattattac24

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>下游引物caps-4a-357/713-r

<400>3

caagaactgcctgtacagtc20

<210>4

<211>22

<212>dna

<213>上游引物indel-4a-351-f

<400>4

tgctgttactctgttattatta22

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>下游引物indel-4a-351-r

<400>5

taacacttagaatctactac20