橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用与流程

本发明属于橡胶树炭疽病的病原菌检测技术领域，具体涉及一种检测橡胶树叶片携带暹罗炭疽菌的方法及引物。

背景技术：

天然橡胶是世界四大工业原料之一，我国是世界上最大的天然橡胶消费国，虽然也是生产国家之一，但远远不能满足国内的需求。如何保证天然橡胶生产的稳定和提高，是当前亟待解决的问题。

由炭疽属真菌(colletotrichumspp.)引起的炭疽病(colletotrichumleafdisease，cld)是威胁天然橡胶产业的重要病害。该病在橡胶树的各个生理期均能发生，主要为害橡胶树叶片，引起橡胶树反复落叶、树冠稀疏，影响幼苗和幼树生长，降低开割树产胶量。该病在叶片上表现出多种症状，包括成熟叶片上的典型炭疽症状、纸质状病斑、圆锥状凸起病斑以及嫩叶上的皱缩病斑。胶孢炭疽菌(colletotrichumgloeosporioides)在过去被认为是该病害的病原菌，直到1994年尖孢炭疽菌在橡胶树上被首次报道。由于炭疽菌的重要性，其分类问题一直是菌物学家研究的热点。近年来，分子生物学技术在真菌分类鉴定中的应用，对炭疽菌属的分类鉴定方法产生了深刻影响，属下分类单元也不断增加。按最新的分类方法，炭疽属包括14个复合种。目前在橡胶树上报道的与引起炭疽病相关的复合种包括胶孢炭疽复合种、尖孢炭疽复合种和博宁炭疽复合种，其中胶孢炭疽复合种中的暹罗炭疽菌(coletotrichumsiamense)和尖孢炭疽复合种中华南炭疽(c.australisinense)为优势种。由于引起该病害的病原菌种类多，有些症状易与白粉病等其它的病害症状混淆。因此，给该病害的准确鉴定带来了一定的困难。对病原菌进行准确鉴定，进而对病害进行快速的早期诊断，具有重要实际应用价值。

目前，只是建立了橡胶树炭疽病胶孢炭疽复合种和尖孢炭疽复合种的特异引物和pcr检测方法，还没有复合种内特定种的特异引物和pcr检测方法。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一对暹罗炭疽菌的特异引物,以及特异性强、灵敏度高、易于操作、结果可靠的橡胶树炭疽病分子检测方法。

本发明的研究人员对大量的基因进行了序列分析，最终根据apmat序列(apmat是位于apn2和mat1-2-1基因之间的基因间隔区)设计了一对橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽的特异性检测引物，并建立了等位基因特异性pcr(allelespecificpcr，as-pcr)检测方法，实现高效准确的对橡胶树炭疽病病原菌的分子检测。

本发明提供的鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(colletotrichumsiamense)的专用引物，是由序列1和序列2组成的引物对。

本发明的鉴定橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌(coletotrichumsiamense)的方法是通过以下方式实现的：

对橡胶树炭疽病发病叶片进行取样，提取样品基因组dna作为模板，以上游引物csampf：5’-agtcgtgacagcggctgtgt-3’(序列表中序列1)

下游引物csampr2：5’-attcccttcccgcatgctgc-3’(序列表中序列2)进行pcr扩增，pcr扩增反应体系中含有待测样品dna，2.5μl含15mmmgcl2的10×pcr缓冲液，2μl浓度为2.5mmdntp,浓度为10μmoll^-1上游正向引物和下游反向引物各1μl，；1u的taqdna聚合酶，加双蒸水补足到25μl；

pcr反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s,72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。

取5μlpcr产物用质量分数1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。染料染色后根据有无扩增产物判定结果，扩增产物中含有416bp的条带，则待测样品中带有暹罗炭疽菌。

本发明的有益效果为：上述引物可应用于引起橡胶树炭疽病暹罗炭疽菌株的鉴定和检测，可以在菌量较少的情况下检测到病原菌的存在。实验证明，当待测样品达到10pg时即可检出，表明该方法具有较高的灵敏性。同时，本发明的引物可以缩短对病原菌菌种的鉴定时间，从而达到快速高效鉴定菌种的目的。

所发明的检测方法适用于橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽(colletotrichumsiamense)和田间带菌橡胶树组织高灵敏度快速检测，为橡胶树炭疽病的早期诊断和及时预防提供可靠地理论依据和技术方法。

附图说明

图1为本发明特异性引物检测样品dna扩增后的凝胶电泳图；

图1中，泳道1-5为5株暹罗炭疽(coletotrichumsiamense)菌株，泳道6和7为2株果生刺盘孢(colletotrichumfructicola)菌株；泳道8和9为2株乐东炭疽(coletotrichumledongense)菌株；泳道10和11为2株华南炭疽(colletotrichumaustralisinense)菌株；泳道12和13为2株版纳炭疽(coletotrichumbannaense)菌株；泳道14为1株橡胶粉孢(oidium.hevea)；泳道15为1株橡胶树多主棒孢(corynesporacassicola)菌株。

图2为本发明的引物灵敏度检测结果。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步地说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

以下实施例旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。

实施例1、用于快速检测暹罗炭疽菌引物的获得

将本实验室测序获得的不同炭疽种类的apmat基因序列与ncbi数据库中已登录apmat基因序列进行比对分析，根据暹罗炭疽与其它种类间的差异位点设计特异引物，所得引物即为本发明的引物，引物序列为上游引物csampf：5’-agtcgtgacagcggctgtgt-3’(序列表中序列1)；下游引物csampr2：5’-attcccttcccgcatgctgc-3’(序列表中序列2)。

二、本发明用于暹罗炭疽菌的快速检测引物的效果验证

1、引物合成

上游引物csampf：5’-agtcgtgacagcggctgtgt-3’(序列表中序列1)；下游引物csampr2：5’-attcccttcccgcatgctgc-3’(序列表中序列2)由华大基因生物技术有限公司合成。

2、特异引物的准确性验证

以下为研究所用菌株：5株暹罗炭疽(coletotrichumsiamense)菌株；2株果生刺盘孢(coletotrichumfructicola)菌株；2株乐东炭疽(coletotrichumledongense)菌株；2株华南炭疽(coletotrichumaustralisinense)菌株；2株版纳炭疽(coletotrichumbannaense)菌株；1株橡胶粉孢(oidium.hevea)；1株橡胶树多主棒孢(corynesporacassicola)菌株。

上述菌株除了橡胶粉孢(oidium.hevea)的基因组dna从发病组织直接提取，其它菌株均相应的分离自我国海南、云南、广东等植胶区的橡胶树炭疽病病样，所有菌株都经过了形态鉴定和its序列的分子鉴定，炭疽菌株还进行了多基因序列的系统发育分析。菌株保藏于中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。

3、提取病原菌dna

(1)从生长7d的转化子培养物边缘打取菌丝块，将菌丝转接到50ml马铃薯葡萄糖液体培养基(pdb)中，25℃，200rpm振荡培养4-5d；

(2)将生长了5d的菌丝真空抽滤，用whatmanno.1滤纸过滤收集菌丝体，然后用无菌水清洗菌丝体3次，置于真空冷冻干燥仪中干燥，放于－80℃冰箱，备用；

(3)用预冷的研钵和研磨棒在液氮中充分迅速的将1g菌丝体研磨成粉状。将研磨粉碎的菌丝体分装于50ml离心管中(注意分装时离心管应预冷，且粉状菌丝要一直处于冷却状态以防止dna降解)。加入15ml预热(65℃)的ctab提取缓冲液，充分振荡均匀，65℃下水浴1h，期间10min振荡一次；

(4)加入3ml5mol/lkac，冰浴20min；

(5)加入氯仿：异戊醇(24：1)，4℃10,000rpm离心5min；

(6)取上清转入另一个干净的50ml离心管中，加入0.6v体积的-20℃预冷的异丙醇，轻轻混匀后，-20℃静置30min；

(7)用毛细管挑出絮状沉淀，75％的乙醇反复漂洗数次，再用无水乙醇漂洗一次，倒置离心管于干净的吸水纸上，在灭菌的工作台中吹干沉淀；

(8)将沉淀重悬于500μl的te缓冲液中，加入1μlrnasea(10mg/ml)，37℃处理1h；

(9)将上步所获的溶液转入干净的2ml离心管中，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，来回颠倒离心管数次将其混匀，4℃10,000rpm离心10min；再用氯仿：异戊醇(24：1)抽提一次；

(10)吸取上清转入干净的2ml离心管中，加入1/10体积预冷的3mol/lnaac(ph5.2)，2.5v体积预冷的无水乙醇，-80℃沉淀30min以上，4℃12,000rpm离心30min。弃上清，用70％的乙醇洗一次，吹干后溶于500μl的te，-20℃保存备用。

4、病原菌特异性的pcr扩增

以步骤3提取的5株暹罗炭疽(coletotrichumsiamense)；2株果生刺盘孢(coletotrichumfructicola)；2株乐东炭疽(colletotrichumledongense)；2株华南炭疽(colletotrichumaustralisinense)；2株版纳炭疽(colletotrichumbannaense)；1株橡胶粉孢(oidium.hevea)；1株橡胶树多主棒孢(corynesporacassicola)样品基因组dna分别作为模板，以

上游引物csampf：5’-agtcgtgacagcggctgtgt-3’；

下游引物csampr2：5’-attcccttcccgcatgctgc-3’；

进行pcr扩增，pcr扩增反应体系中含有待测样品dna，2.5μl含15mmmgcl2的10×pcr缓冲液，2μl浓度为2.5mmdntp,浓度为10μmol/l上游正向引物和下游反向引物各1μl，；1u的taqdna聚合酶，加双蒸水补足到25μl；

pcr反应程序为：95℃预变性3min；94℃变性30s，66℃退火30s,72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min。

取5μlpcr产物用质量分数1.2％琼脂糖凝胶电泳进行分离。染料染色后根据有无扩增产物判定结果，扩增产物中含有416bp的条带，则待测样品为暹罗炭疽菌。

结果如图1所示，结果表明，5株暹罗炭疽菌株(图1中泳道1-5)均扩增出416bp的条带，而其他病原菌(泳道6-15)均未扩增到相应条带。说明本发明的方法准确性很高。

将其中一株暹罗炭疽菌(coletotrichumsiamense)的基因组dna定容，然后依次稀释十倍，用上述方法进行扩增，结果表明，当待测样品在扩增体系中达到10pg时即可检出，表明该方法具有较高的灵敏性(图2，图2的泳道1-7为依次十倍稀释的暹罗炭疽菌的基因组dna)。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110>中国热带农业科学院环境与植物保护研究所

<120>橡胶树炭疽病病原菌暹罗炭疽菌的快速分子检测方法与应用

<130>whoi201008

<160>2

<170>patent-in3.5

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>1

agtcgtgacagcggctgtgt20

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

attcccttcccgcatgctgc20