本发明属于生物技术领域，具体涉及一种鸭圆环病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法。
背景技术：
鸭圆环病毒(duckcircovirus，ducv)，是圆环病毒科(circoviridaeus)圆环病毒属(circovims)的新成员，2018年ictv将ducv列入圆环病毒属中的暂定种。鸭圆环是目前已知的最小的鸭病毒，会入侵鸭的免疫系统，导致机体的免疫功能下降，常与鸭流感病毒、鸭细小病毒、鸭呼肠孤病毒、鸭大肠杆菌和鸭疫里默氏杆菌等病原形成混合感染，造成鸭群的死亡率提升、生产性能下降，给养殖业造成巨大损失。抗病毒化学药物在鸭群上已全面禁用，中药则对鸭圆环病毒病未见确实的临床效果，养鸭业急需一种疗效明确、成本低廉的鸭圆环病毒病预防、治疗制剂。
卵黄抗体是用特异性的抗原多次免疫接种健康蛋鸡，待蛋黄内抗体滴度达到一定高度后，收集其所产鸡蛋经过提取纯化制备而成，常作为特效药物用于疫病的紧急预防和治疗。卵黄抗体的制备工艺中，优选免疫原性突出的免疫抗原，使其最大化的刺激蛋鸡的细胞免疫与体液免疫水平，获得抗体滴度高、持续时间长的高免鸡蛋，对降低卵黄抗体的生产成本具有显著经济价值。鸭圆环病毒病目前还未见卵黄抗体类产品成功商业化的报道，开发相关产品对其全面防控具有重要的经济与社会效益。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种鸭圆环病毒的复合疫苗及卵黄抗体制备方法。该制备方法优选的鸭圆环病毒复合疫苗免疫蛋鸡后可显著提高蛋黄中鸭圆环病毒抗体效价，提取纯化制备的卵黄抗体性质稳定、纯度高，可大大降低鸭圆环病毒卵黄抗体的生产成本，对鸭圆环病毒病的预防及治疗极具应用价值。
根据鸭圆环病毒sdfc12株的orfc1基因序列，将其两端分别加上合适酶切位点后进行全基因合成，合成的鸭圆环病毒orfc1基因双酶切后连入pvax1载体相应的酶切位点。该重组pvax1-cap质粒转化大肠杆菌dh5α后经发酵、dna提取纯化等步骤进行大量制备。
将鸭圆环病毒sdfc12株的cap蛋白中富含精氨酸的n端21-36位肽段用t细胞表位肽段(takskkfpsytatyqf)进行替换，并经大肠杆菌稀有密码子优化后与pet28a载体相连、转化大肠杆菌表达菌株bl21(de3)制备而成。将重组鸭圆环病毒cap蛋白生产菌dp株高密度发酵、菌体破碎、镍柱纯化、甲醛灭活后适当稀释制备而成。
将重组pvax1-orfc1质粒与重组鸭圆环病毒cap蛋白混合制备水相。
水相中优选的重组pvax1-orfc1质粒终浓度是20～80μg/ml，重组cap蛋白终浓度为0.2～0.8mg/ml。
更优选的重组pvax1-orfc1质粒终浓度是50μg/ml，重组cap蛋白终浓度为0.5mg/ml。
将水相与白油佐剂乳化制备成鸭圆环病毒复合疫苗。
将高免蛋经过蛋黄分离、灭活、萃取、过滤、分装等步骤，制备卵黄抗体成品，终产品抗体琼扩效价达1:16。
本发明首先制备了一种重组pvax1-orfc1质粒，其是由鸭圆环病毒的orfc1基因与真核表达载体pvax1通过酶切连接而成。该重组pvax1-orfc1质粒转化大肠杆菌dh5α后经发酵、提取纯化等方法可进行大量制备。然后，将鸭圆环病毒cap蛋白生产菌dp株进行高密度发酵、菌体破碎、蛋白纯化等，制备改造的重组鸭圆环病毒cap蛋白。将重组pvax1-orfc1质粒与重组鸭圆环病毒cap蛋白混合制备水相。将水相与白油佐剂乳化制备成鸭圆环病毒复合疫苗。
制备的鸭圆环病毒复合疫苗免疫蛋鸡后，三免后7日即可达到收蛋要求(1:64)，最高可达1:512，且三免后4个月进行检测，卵黄抗体效价仍符合要求。不论是卵黄抗体产生时间、抗体产生高度还是抗体持续期，复合疫苗组均远优于dna疫苗组与亚单位疫苗组，显示了良好的应用前景。
卵黄抗体治疗组与预防组使用后鸭群获得100％保护，生理盐水对照组的鸭群则100％发病，证明本发明制备的鸭圆环病毒卵黄抗体对感染鸭圆环病毒的鸭群具有良好的临床保护效果，可进行临床推广和应用。
本发明的鸭圆环病毒卵黄抗体制备方法，与常规制备方法相比将高免蛋抗体效价提高4倍以上，从而大大降低鸭圆环病毒卵黄抗体的制作成本，极具推广与应用价值。制备的鸭圆环病毒卵黄抗体用于鸭圆环病毒的预防或治疗，均取得优异效果，注射抗体的鸭群获得完全保护。
具体实施方式
实施例1
重组pvax1-orfc1质粒的构建与制备
1重组pvax1-orfc1质粒的载体构建
1.1根据鸭圆环病毒sdfc12株(genbank登录号：ky328304)的orfc1基因序列，将其两端分别加上kpni和xhoi酶切位点后进行全基因合成。
1.2合成的鸭圆环病毒orfc1基因用kpni和xhoi双酶切后连入pvax1载体相应的酶切位点，cacl2法转化大肠杆菌dh5α，提取质粒进行kpni和xhoi双酶切鉴定，正确后送上海生工测序，测序结果表明鸭圆环病毒orfc1基因成功连入pvax1载体相应酶切位点。
2重组pvax1-orfc1质粒的体外表达与鉴定
2.1选取生长良好的pk-15细胞接种6孔细胞培养板，37℃、5％二氧化碳培养箱培养至细胞85％～90％汇合度时，进行重组pvax1-orfc1质粒转染。
2.2细胞转染操作按lipofectaminetm2000试剂盒说明书进行，步骤如下：
2.2.1取4μg重组pvax1-orfc1质粒dna，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀。
2.2.2取10μl的lipo2000，用无血清细胞培养基稀释至250μl，轻轻混匀，室温静置5min。
2.2.3将dna悬液和lipo2000悬液混合后轻轻混匀，室温静置20min。
2.2.4将pk-15细胞已长好的6孔板中培养液弃掉，无血清细胞培养液洗2次，吸弃培养液，加入上述混合液，轻轻混匀后，补加1ml无血清细胞培养基，置于37℃、5％co2培养箱中培养。
2.2.5转染6h后，弃掉6孔板细胞液，每孔加入2ml含10％新生牛血清的dmem培养基。
2.2.6设转染pvax1空载体的pk-15细胞做为阴性对照。
2.3转染48小时后，用ph7.2的pbs液洗涤接毒后细胞板1遍，注意动作轻缓，防止细胞脱落，预冷的甲醇4℃固定细胞15～20min，pbs洗3遍，加入鼠抗鸭圆环病毒阳性血清100μl，37℃孵育1h，pbs洗3遍，加入100倍稀释的fitc标记羊抗鼠二抗100μl，37℃避光孵育45min，pbs洗3遍，荧光显微镜观察结果。
结果重组pvax1-orfc1质粒转染pk-15细胞后可观察到明显的荧光信号，而对照组无明显荧光信号，证明构建的重组pvax1-orfc1质粒可正确表达鸭圆环病毒cap蛋白。
3重组pvax1-orfc1质粒的大量制备
3.1重组菌的高密度发酵与菌体裂解含重组pvax1-orfc1质粒dna的大肠杆菌dh5α经50l发酵罐高密度发酵培养后，5000r/min离心10min收集菌体，按每克湿菌重5ml的比例加入solutioni，再按1:2:1.5的比例分别加入solutionii和solutioniii，室温孵育15min后，10000r/min室温离心10min，收集上清，加入0.7倍体积异丙醇，-20℃沉淀30min，10000r/min室温离心10min，弃上清，沉淀溶解于10mmol/lte缓冲液。
3.2内毒素的去除将纯化的质粒dna溶液加入10％的tritonx-114，使其终浓度为1％，混匀后冰浴10min，然后42℃继续孵育10min，10000r/min室温离心10min，小心吸取上清液至无热原容器中，必要时重复操作1次。
3.3定量分装用10mmol/lte缓冲液稀释至500μg/ml，定量分装，即为重组pvax1-orfc1质粒。
3.4重组pvax1-orfc1质粒的检测
3.4.1重组pvax1-orfc1质粒的浓度测定超微量核酸分析仪检测质粒浓度，应不低于500μg/ml。
3.4.2酶切鉴定将纯化的重组pvax1-orfc1质粒用kpni和xhoi双酶切后进行琼脂糖凝胶电泳分析。结果应看到约3000bp与789bp大小的两条带。
3.4.3宿主蛋白检测按照bca蛋白检测试剂盒说明书，以已知浓度的bsa制备标准曲线。用无菌水将纯化的重组pvax1-orfc1质粒进行梯度稀释，在同样条件下对纯化质粒dna中的菌体蛋白进行定量检测，重组质粒的菌体蛋白含量应低于10μg/mg。
3.4.4内毒素检测按鲎试剂方法进行内毒素检测，内毒素含量应低于1000eu/mg。
实施例2
鸭圆环病毒复合疫苗的制备与检验
1重组鸭圆环病毒cap蛋白的制备
1.1生产菌株重组鸭圆环病毒cap蛋白生产菌dp株，是将鸭圆环病毒sdfc12株(genbank登录号：ky328304)的cap蛋白中富含精氨酸的n端21-36位肽段用t细胞表位肽段(takskkfpsytatyqf)进行替换，并经大肠杆菌稀有密码子优化后与pet28a载体相连、转化大肠杆菌表达菌株bl21(de3)制备而成。
1.2重组鸭圆环病毒cap蛋白的制备将重组鸭圆环病毒cap蛋白生产菌dp株高密度发酵、菌体破碎、镍柱纯化、甲醛灭活，最后用无菌生理盐水将蛋白液稀释至终浓度2.0mg/ml，无菌过滤，待用。
2鸭圆环病毒复合疫苗的制备
1.1半成品制备将实施例1的3.3中制备的重组pvax1-orfc1质粒dna与实施例2的1.2中制备的鸭圆环病毒cap蛋白适当稀释，使质粒dna终含量为50μg/ml，cap蛋白终含量为0.5mg/ml，充分混匀，即为半成品。
1.2疫苗制备
1.2.1油相制备取优质注射用白油94份，硬脂酸铝2份。在油相罐中混合均匀，加热融化至半透明状，再加司本-806份，至温度达到125～130℃时维持30分钟，冷却至室温备用。
1.2.2水相制备取灭菌的吐温-804份，加检验合格的半成品96份，充分搅拌至吐温-80完全溶解。
1.2.3乳化取油相2份置于高速剪切机内，开动电机低速搅拌，同时缓缓加入水相1份，再以3600r/min乳化40分钟，在终止搅拌前加入1％硫柳汞溶液，终浓度达到0.01％。乳化后，取样10ml加入离心管，以3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出。
1.2.4分装定量分装，密封瓶口。
2鸭圆环病毒复合疫苗的检验
2.1物理性状
外观为乳白色乳剂。
剂型为油包水型。取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，除第1滴外，均应不扩散。
稳定性吸取疫苗10ml加入离心管中，经3000r/min离心15分钟，管底应无水相析出。
黏度按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
装量检查按现行《中国兽药典》进行，符合规定。
2.2无菌检验按现行《中国兽药典》进行，无菌生长。
2.3安全检验将7日龄健康易感鸡20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的疫苗，1.0ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鸡群，结果两组雏鸡均全部健活，无任何不良反应。
2.4甲醛、汞类防腐剂残留量测定按现行《中国兽药典》进行，均符合规定。
3鸭圆环病毒复合疫苗对蛋鸡免疫程序研究
选取120日龄蛋鸡80只，平均分为4组，每组20只。dna疫苗组免疫实施例1制备的重组pvax1-orfc1质粒，10μg/只；亚单位疫苗组免疫重组鸭圆环病毒亚单位疫苗，由实施例2制备的重组鸭圆环病毒cap蛋白与白油佐剂按1:2比例乳化制成，其中水相中cap蛋白的终浓度为0.5mg/ml；复合疫苗组免疫实施例3制备的鸭圆环病毒复合疫苗；不免疫对照组注射同等体积的生理盐水。各组蛋鸡分别进行相应疫苗免疫，皮下注射，0.5ml/只，免疫间隔14日，共三次免疫。分别于免疫前，三免前(二免后14日)，三免后7、14、21、28日收集鸡蛋测定卵黄抗体效价，之后每30日收集高免蛋鸡蛋测定卵黄抗体效价，确定蛋鸡的卵黄抗体产生期和持续期。
结果：制备的鸭圆环病毒复合疫苗免疫蛋鸡后，三免后7日即可达到收蛋要求(不低于1:64)(见表1)，最高可达1:512，且三免后4个月进行检测，卵黄抗体效价仍符合要求(见表2)。结果表明不论是卵黄抗体产生时间、抗体产生高度还是抗体持续期，复合疫苗组均远优于dna疫苗组与亚单位疫苗组，显示了良好的应用前景。
表1各疫苗组免疫后蛋鸡的卵黄抗体产生期
表2各疫苗组免疫后蛋鸡的卵黄抗体持续期
实施例3
鸭圆环病毒卵黄抗体的制备与检验
1鸭圆环病毒卵黄抗体的制备
按实施例2中3部分的方法将鸭圆环病毒复合疫苗免疫蛋鸡制备高免蛋，收集合格的高免蛋(抗体效价不低于1:64)，蛋壳消毒后进行卵黄分离、萃取、灭活、过滤除菌、稀释分装等方法，终产品抗体效价应不低于1:16。
2鸭圆环病毒卵黄抗体的安全性实验
将7日龄健康易感鸭20只平均分为两组，每组10只。第一组腿部肌肉注射本发明制备的卵黄抗体，1.0ml/只，第二组腿部肌肉注射同体积生理盐水。免疫后21日观察鸭群，应全部健活，无任何不良反应。
3鸭圆环病毒卵黄抗体的效力试验
将28日龄健康易感鸭90只平均分为三组，每组30只。第一组为卵黄抗体治疗组，腿部肌肉注射鸭圆环强毒wf株0.2ml(含104.0id50)，24h后肌肉注射本发明制备的鸭圆环病毒卵黄抗体，0.5ml/只。第二组为卵黄抗体预防组，肌肉注射本发明制备的鸭圆环病毒卵黄抗体，0.5ml/只，24h后腿部肌肉注射鸭圆环强毒wf株0.2ml(含104.0id50)。第三组为生理盐水对照组，腿部肌肉鸭圆环强毒wf株0.2ml(含104.0id50)，24h后肌肉注射无菌生理盐水，0.5ml/只。攻毒14天后统计治疗效果。其中发病标准：1、羽毛营养失调，羽轴出血、毛刺、逐渐消瘦；2、死亡。以上两者出现之一即判为发病。
结果：卵黄抗体治疗组与预防组在鸭圆环强毒攻毒后鸭群获得100％保护，生理盐水对照组的鸭群则100％发病。证明本发明制备的鸭圆环病毒卵黄抗体对感染鸭圆环病毒的鸭群具有良好的临床保护效果，可进行临床推广和应用。
表3鸭圆环病毒卵黄抗体治疗效果试验