一种小麦抗赤霉病基因TaXAX1及其应用的制作方法

本发明涉及分子育种技术领域，具体为一种小麦抗赤霉病基因taxax1及其应用。

背景技术：

赤霉病（fusariumheadblight,fhb）是由禾谷镰刀菌复合种fusariumgraminearumspaciescomplex（fgsc）引发的世界范围的流行性病害(bai&shaner,2004)，可侵染小麦和多种禾谷类作物。其中禾谷镰刀菌（f.graminearum，f.g）是我国麦类赤霉病的主要致病种。赤霉病不仅引起产量的严重降低，而且分泌多种对人畜有害的毒素和次生代谢物质(康振生,2004)，降低小麦品质，对人畜健康产生严重威胁(j.davidmiller,greenhalgh,wang,&lu,1991)。而在当前小麦育种过程中，亲本选择具有单一性，使得育成小麦品种的遗传组成单一化，农艺性状和对各种病害的抵御能力下降，所以小麦抗病基因的挖掘和功能研究对小麦病害问题具有重要意义。

技术实现要素：

本发明针对以上不足之处，提供了一种小麦抗赤霉病基因taxax1。在小麦中过量表达了taxax1基因，可显著提高小麦赤霉病的抗性。

本发明解决以上问题，采用的技术手段为：一种小麦抗赤霉病基因taxax1，cdna如seqidno.1所示。

小麦抗赤霉病基因taxax1编码的蛋白质，其序列为seqidno：2。

所述的小麦抗赤霉病基因taxax1在小麦品种改良中的应用。

所述的小麦抗赤霉病基因taxax1在提高小麦抗赤霉病中的应用。

本发明提供了一种提高小麦抗赤霉病的基因taxax1及其编码的蛋白taxax1。通过构建过表达载体，转化感病小麦，经过除草剂及pcr筛选阳性植株，最终发现在小麦中过量表达taxax1基因后，转基因阳性植株赤霉菌的发病现象产生了明显的延缓，赤霉病抗性得到显著提高。

本发明首次分离克隆了小麦taxax1基因，并首次在小麦中过量表达了taxax1基因，为培育抗赤霉病的小麦品种提供了新的思路。也为其他单子叶植物的抗赤霉病育种提供了参考。

附图说明

图1所示是本发明taxax1cdna扩增结果，其中m:marker;c1、c2：taxax1cdna扩增带。

图2所示是taxax1基因在应激条件下的rna-seq表达模式，其中y轴的单位是每千百万个碱基（tpm）的转录本，taxax1基因的每个tpm值是三个生物学重复的平均值。误差棒代表sd。t检验进行差异显著分析，*pvaluettest<0.05；**pvaluettest<0.01；***pvaluettest<0.001；

图3所示是转基因植株的pcr验证结果，其中m:marker;ck:fielder;1-12:不同的转基因小麦植株；v：pc611-taxax1表达载体；

图4所示是t2代阳性转基因植株不同时间点发病表型，其中a.病穗率；**pvaluettest<0.01；b.4天穗部发病表型；c.14天穗部发病表型；d.21天穗部发病表型；wt：野生型fielder；line1、line3：转基因阳性纯系，阴：转基因阴性植株；箭头表示初步侵染部位。

图5中，a所示为总rna电泳图，b所示为cdna电泳图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细描述：

实施例1、基因taxax1的筛选

以小麦品种“望水白”叶片为材料，将don(deoxynivalenol,脱氧雪腐镰刀菌烯醇，sigma公司)毒素标准液稀释至100ppm，然后用一次性注射器注射进小麦幼苗叶片表皮，同时以无菌水相同操作注射为对照。分别培养12、24小时后取样备用。

把don诱导处理的2份望水白叶片组织样品等量混合作为实验样品，把无菌水处理的2份望水白叶片组织样品等量混合作为对照样品。依照trizolreagentkit（invitrogen公司）提取2份混合样品的总rna（图5a）。分离mrna后,按照bdsmartpcrcdnasynthesis试剂盒(clontech公司)的说明合成双链cdna。经1.4%的琼脂糖凝胶电泳后,cdna呈现为一条0.3～2kb的smear状（图5b)，从大小上来看与真核植物的基因转录本大小相吻合。

正向差减杂交cdna(以don处理过的cdna作为tester)和反向差减杂交cdna(以水处理过的cdna作为tester)，构建don毒素处理的小麦cdna抑制差减杂交文库（suppressionsubtractivehybridization,ssh），从中筛选获得一个don诱导的262bpest片段。

利用ensemblplants小麦物种数据库（http://plants.ensembl.org/triticumaestivum）中blast得到一个全长为2210bp的全长cdna克隆，位于7d染色体上。同时发现另外a、b基因组中的同源基因。并且在登录号erp003465的转录组数据库中，在抗fhb(fusariumheadblight)小麦品种cm-820365的穗中分别接菌f.g和水mock50h后，3条同源基因都发现明显上调（图2）。

实施例2、基因taxax1cdna序列获得

以望水白叶片cdna为模板，用引物taxax1f（5’—tatatgcggccgcatggcgtccacggcgtacg—3’，seqidno：3），taxax1r（5’—tatatggcgcgcccatcctgcagctggtcgag—3’，seqidno：4）pcr扩增基因taxax1。使用超保真dna聚合酶（phantamaxsuper-fidelitydnapolymerase南京诺唯赞公司）：

pcr反应（50μl）：

2×phantamaxbuffer25μl

dntpmix（2.5mm）4μl

引物1(10μm)2μl

引物2(10μm)2μl

模板xμl（约100ng）

phantamaxsuper-fidelity

dnapolymerase（1u/μl）1μl

ddh2oto50μl

pcr反应程序：95℃与变性3min,94℃变30s,68℃退火30s，72℃延伸(1min/1kb),共30~40个循环，之后72℃终延伸5min，16℃保存。pcr产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分析。切胶回收目的片段。将该核苷酸与t-载体（全式金）在25℃连接15min,连接体系为5μl，包括t-载体0.5μl，pcr产物4.5μl，连接产物通过42℃热击90秒，冰浴2min,转化到大肠杆菌细胞中，送至博日公司测序。扩增结果见图1，所得基因taxax1的序列如seqidno.1所示，该蛋白包含546个氨基酸,等电点为5.98，如seqidno.2所示。

实施例3、

将taxax1基因连接到表达载体pc611强启动子ubi下游，获得过表达载体pc611-taxax1。验证后，构建好的pc611-taxax1载体由中国农业科学院小麦遗传转化平台转化感病材料fielder。

转化完成后，将分化苗转移至生根壮苗培养基后，待苗长至10cm左右时炼苗移栽，缓苗后先用除草剂涂饰叶片，初步筛选阳性植株,对有除草剂抗性的植株提取叶片dna进行pcr验证，验证引物为taxax1f/r。验证结果如图3所示。

将阳性株系种植于山东农业大学温室中，种植阴性转基因株系和野生型fielder为对照。扬花期，利用禾谷镰刀菌（f.graminearum）野生型菌株ph-1，单花滴定接种赤霉菌(kong,anderson,&ohm,2005;lietal.,2016)。将孢子液浓度调整为4×10⁵个/ml，吸取10μl孢子悬浮液滴入麦穗中部小穗外稃和内稃中间的小花处。套袋保湿72h。每天按时观察统计。统计过程中一般将小穗发生明显枯黄作为发病表型，只有菌丝一般不认为小穗开始发病。计算病穗率以判断赤霉病的严重程度。病穗率(percentageofscabbedspiklet,pss)=（发病小穗数/总小穗数）×100%。

如图4所示，初始统计时发现株系line1、line3发病表型出现较晚，野生型与阴性植株注菌第4天出现明显枯黄表型，line1、line3第5天才可以观察到明显发病表型。后期发病中，line1、line3的病穗率一直明显低于野生型与阴性植株，这说明过表达taxax1基因的植株对赤霉病的抗性能力得到提高。推测taxax1基因与赤霉病抗性相关，可能与该基因参与细胞壁木聚糖的生物合成有关，增强细胞壁抗降解酶的能力，使小麦抗赤霉病的能力增强。

序列表

<110>山东农业大学

<120>一种小麦抗赤霉病基因taxax1及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1641

<212>dna

<213>小麦品种望水白(triticumaestivuml.)

<400>1

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<211>546

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<213>小麦品种望水白(triticumaestivuml.)

<400>2

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glnasp

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<212>dna

<213>人工序列(artificial)

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