NtLRR-RLK基因在TMV侵染烟草中的应用的制作方法

本发明涉及基因工程领域，具体为烟草ntlrr-rlk基因在tmv侵染烟草中的应用。

背景技术：

植物在生长发育的过程中不可避免会遭受细菌、真菌、病毒和线虫等病原菌的威胁，我们称之为生物胁迫。虽然植物没有像动物一样的免疫系统，但是植物在长期的逆境胁迫进化过程中，同样形成了复杂而精细的环境应答调节及防卫反应机制来抵抗这些病原菌的胁迫。并在长期的胁同地进化过程中形成了自身独特的有效的防御系统。主要包括植物诱导性抗性和组成型抗性两种，组成型抗性主要涉及以下两方面：第一、植物本身的某些结构障碍如细胞壁的角质、栓质、蜡质、木质素等；第二、具有抗病功效的化学成分如抗病基因、抗菌肽、小分子抗病物质和影响病原物细胞透性的蛋白质等。

诱导型的植物防卫系统是植物受到病原菌侵染而诱导激活自身防卫机制,包括一系列基因表达水平变化和生理生化变化,又称先天免疫反疫反应(innateimmunity)。植物的先天免疫反应从机制和层次上可以分为两类：一类是细胞膜表面的模式识别受体(patternrecognitionreceptors，prrs)识别病原菌表面存在的分子特征pamps(pathogen-associatedmolecularpatterns)所激发的免疫反应(pamp-triggeredimmunity；pti)；另一类是植物专化性的抗病蛋白(r蛋白)识别病原菌分泌的效应蛋白激发的免疫反应(effector-triggeredimmunity，eti)。pti是基础抗性的重要组成部分，而eti可能是形式上更进化的专化性免疫反应。在植物体内，它们之间相互影响、相互平衡来共同抵抗病原菌的入侵。

受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶类(lrr-rlk)属于pti，最早是ronald等在水稻中发现的，他们研究了水稻和白叶枯病交互作用，并发现了xa21为典型的抗性基因。这一基因编码蛋白含有蛋白激酶，并且具有跨膜序列和胞外lrr结构，研究者推测该基因的抗性机制可能是其表达产物胞外lrr区域与病原物激发子进行结合，致使侵染信号被感知，进而将信号通过跨膜区传递到细胞内，激活了蛋白激酶，使得其他蛋白和激酶发生磷酸化和去磷酸化作用，可能最终导致植株防卫相关基因表达参与抗性反应。

目前，烟草花叶病是世界范围内普遍发生的植物病害，由于其寄主范围广泛，对农业生产尤其是茄科植物危害严重。长期以来，科研工作者在基因工程策略和生物源农药防治等方面进行了大量的研究，但植物抗病反应是一个非常复杂的过程，涉及到多种调控防卫反应，包括对病原菌的识别、植物-病原互作过程中的信号传导途径、抗病基因的调控和表达等。

因此，深入理解tmv侵染寄主免疫的分子基础，有利于对tmv的防治和抗tmv侵染的分子育种，达到进一步对烟草花叶病进行控制和防治的目的是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明正是基于上述技术问题至少之一，深入理解tmv侵染寄主免疫的分子基础，有利于对tmv的防治和抗tmv侵染的分子育种，达到进一步对烟草花叶病进行控制和防治的目的。

本发明提出了烟草ntlrr-rlk基因通过增加防御相关蛋白的表达，在防御tmv侵染烟草中应用，ntlrr-rlk基因序列为seqidno.1。

进一步的，e3泛素连接酶(e3-keg)、内质网结合蛋白er(bip1)和支链氨基酸转氨酶1(bcat1)。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案包括以下步骤：

(1)烟草ntlrr-rlk基因的在不同抗性品种中的表达模式；

(2)烟草ntlrr-rlk基因的甲基化分析；

(3)构建prnai-ntlrr-rlk载体转化植株检测病毒侵染性；

(4)检测tmv感染后对互作蛋白的影响。

其中步骤(1)的具体方法如下：

利烟草ntlrr-rlk基因的在抗花叶病品种和易感花叶病品种中的表达模式分析

选用对tmv具有耐受性的豫烟8号(y)和易感品种nc89(n)作为实验材料。人工接种tmv24h后y品种为(yd)，n品种为(nd)，采集与接种叶片相邻的上部叶，提取总rna为模板进行反转录实验，根据烟草ntlrr-rlk的编码区序列，设计特异性引物进行rt-pcr扩增，分析ntlrr-rlk基因在易感品种n和nd中的基因表达水平和在抗性品种y和yd的基因表达水平。

其中步骤(2)的具体方法如下：

引物设计位点和引物序列如下：

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其中，为设计的引物位置；中间部分为待测序列；加粗斜体表示cpg位点，其在序列中的位置依次为：37，39，130，324，345。

分析ntlrr-rlk基因的cpg位点在n和nd中dna甲基化状态和在y和yd中的dna甲基化状态。

步骤(3)的具体方法如下：

构建prnai-ntlrr-rlk载体转化植株

构建rnai表达载体，并通过转化农杆菌eha105的方式瞬时表达tmv-gfp，分析抑制ntlrr-rlk基因后，与野生型相比病毒侵染情况。

其中步骤(4)的具体方法如下：

用tmv病毒提取液分别处理野生型植株和转基因植株，24h后取其与侵染tmv相邻上部叶作为样品，进行qpcr检测。

通过以上技术方案，深入理解tmv侵染寄主免疫的分子基础，有利于对tmv的防治和抗tmv侵染的分子育种，达到进一步对烟草花叶病进行控制和防治的目的。

附图说明

图1为烟草ntlrr-rlk基因的在不同抗性品种接种tmv前后的表达量；

图2为烟草ntlrr-rlk基因的不同甲基化cpg位点在不同抗性品种中的状态图；

图3为转基因植株瞬时表达tmv-gfp荧光图；

图4为转基因植株感染tmv后互作蛋白基因的表达量。

具体实施方式

为了能够更清楚地理解本发明的上述目的为特征和优点，下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是，本发明还可以采用其他不同于在此描述的其他方式来实施，因此，本发明的保护范围并不受下面公开的具体实施例的限制。

实施例1

烟草ntlrr-rlk基因的在不同抗性品种中的表达模式

烟草ntlrr-rlk基因的在抗花叶病品种和易感花叶病品种中的表达模式分析。

选用对tmv具有耐受性的豫烟8号(y)和易感品种nc89(n)作为实验材料。人工接种tmv24h后y品种为(yd)，n品种为(nd)，采集与接种叶片相邻的上部叶，提取总rna后反转录为cdna作为扩增模板。实时荧光定量pcr选用烟草actin基因为内参基因，引物序列如下：

上游引物为5'-gttgggcgtcctcgtca-3'；seqidno.2

下游引物为5'-tgggtcatcttctccctgtt-3'；seqidno.3

ntlrr-rlk基因的特异性引物如下：

上游引物：5'-tagttgttcgacgtaggcgg-3'，seqidno.4

下游引物：5'-acgaacaaccaaaggcggat-3'，seqidno.5；扩增片段为210bp。总rna提取采用trizol试剂盒操作手册进行；cdna第一链合成按照takara公司的primescripttmrtreagentkit试剂盒说明书进行操作。实时荧光定量pcr在bioradiq5荧光定量pcr仪上进行，结果分析采用2-δδct法，其中ct是循环阈值，δct是目的基因与看家基因的ct值的差异，δδct是不同时间处理与对照δct值的差异。结果如图1，分析ntlrr-rlk基因在易感品种n和nd中的基因表达水平和在抗性品种y和yd的基因表达水平。由图1可知烟草ntlrr-rlk基因在易感品种n和nd中基因表达水平低于抗性品种y和yd，而且易感品种n在接种tmv24h后该基因的表达量下降达到极显著水平，抗性品种y接种tmv后稍ntlrr-rlk基因表达却是上升的。说明ntlrr-rlk基因高表达可起到抗tmv作用。

实施例2

烟草ntlrr-rlk基因的甲基化分析

引物设计位点和引物序列如下：

ctacattcgcgagattattgtttaaatataatgcagagattgaatatcatggttgatgttgcatctgctctagaatatctccatcatggttactcagtaccggttattcactgtgatctgaagcctagcaatgtgttacttgacaatgacatggtgggacacctaactgactttggcattgctaaacttttgactaaggaagaatctattgctcacactacaacctttgccactattggttacattgctccaggtgaattctttatttaactttgtaacaatgtaattgattaacgcaacaacaacaacaacatac

其中，为设计的引物位置；中间部分为待测序列；加粗斜体表示cpg位点，其在序列中的位置依次为：37，39，130，324，345。

分析ntlrr-rlk基因的cpg位点在n和nd中dna甲基化状态和在y和yd中的dna甲基化状态，结果如图2。由图2可知，ntlrr-rlk基因的cpg位点在n和nd中dna甲基化状态分别为94％和100％高于y和yd的76％和72％，尤其是130位点，y品种接种tmv前后十个克隆均未甲基化，而在n和nd中甲基化程度都很高。说明ntlrr-rlk基因的低甲基化可以发挥抗tmv的作用。

实施例3

构建prnai-ntlrr-rlk载体转化植株检测病毒侵染性

设计特异性引物lic-1和lic-2进行pcr反应，回收得到pcr产物1。然后以产物1为模板，lic-3和lic-4为引物进行pcr反应，回收得到产物2。将prna-lic质粒用smai进行酶切消化，产物用线性化载体t4-dna聚合酶处理。将t4-dna聚合酶处理过的pcr产物以及t4-dna聚合酶处理过prna-lic产物混合均匀后，22℃温育30min，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。将构建好的rnai表达载体转化农杆菌eha105，注射器注射叶片的方式瞬时表达tmv-gfp，分析抑制ntlrr-rlk基因后，与野生型相比病毒侵染情况，结果如图3。由图3可知，与野生型相比，转基因植株5d时表现出较强的荧光(图3)，说明抑制ntlrr-rlk基因后，病毒侵染加剧。

lic-1：cgacgacaagaccctactcctttattggtgaaacttc；seqidno.6；

lic-2：gaggagaagagcccttggaatatggcccttgagg；seqidno.7；

lic-3：ccagcacggaacccttgaggagaagagccct；seqidno.8；

lic-4：agagcacacgacccttcgacgacaagaccct；seqidno.9。

实施例4

检测tmv感染后对互作蛋白的影响

选取移栽期50d左右、长势一致烟苗，用tmv病毒提取液分别在野生型植株和转基因植株顶端新生叶下数第4片叶，表面均匀撒下石英砂，棉签蘸取等量病毒汁液后轻轻摩擦来回重复三次。接种完成1h后清水喷洗叶面，以利于植株发病，24h后取其与侵染tmv相邻上部叶作为样品，进行qpcr检测结果如图4。由图4可知，在rnai植株中，e3-keg、bip1、bcat1基因表达量均显著下调。

ntlrr-rlk基因对防御tmv感染具有一定积极作用。在ntlrr-rlkrnai转基因植株中，e3-keg、bip1、bcat1基因表达量均显著下调，植株更易感病。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改为等同替换为改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>河南农业大学

<120>ntlrr-rlk基因在tmv侵染烟草中的应用

<141>2020-03-20

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5163

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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<210>2

<211>17

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<213>人工序列(artificialsequence)

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<210>9

<211>31

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<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

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