混元萜类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于医药技术领域，具体涉及混元萜类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

混元萜类化合物是一类部分结构片段源自于萜的混合型天然小分子，主要分为聚酮-混元萜和非聚酮-混元萜类(geris,r.；simpson,t.j.；nat.prod.rep.2009,26,1063-1094；wen,h.；yang,x.；liu,q.；li,s.；li,q.；zang,y.；chen,c.；wang,j.；zhu,h.；zhang,y.j.nat.prod.2020,83,99-104；matsuda,y.；abe,i.nat.prod.rep.2016,33,26-53)。补身烷混源萜化合物广泛分布于海绵、海洋来源的藻类和真菌中。这类化合物的补身烷骨架通常连有苯酚或醌/对苯二酚基团，具有广泛的生物活性，如抗菌、抗病毒、细胞毒性、破骨细胞分化抑制和抗炎作用(he,w.j.；zhou,x.j.；qin,x.c.；mai,y.x.；lin,x.p.；liao,s.r.；yang,b.；zhang,t.；tu,z.c.；wang,j.f.nat.prod.rep.2016,31,604-609；gordaliza,m.mar.drugs.2010,8,2849-2870；marcos,i.s.；conde,a.；moro,r.f.；basabe,p.；díez,d.；uronesj.g.mini-rev.org.chem.2010,7,230-254)。目前还未见有混元萜类化合物调节神经元兴奋性的报道。

真菌alternariasp.广泛分布于自然环境中，有250多种，它们会引起植物的发病，对人和动物有害(lee,h.b.；patriarca,a.；magan,n.mycobiology2015,43,371-371；meena,m.；samal,s.toxicologyreports2019,6,745-758)。常见代谢产物是真菌毒素，包括二苯甲酮、苝和四羧酸衍生物。最近有不少新型的次级代谢产物从alternariasp.中分离出来，并且具有显著的生物活性，如抗菌，蛋白酪氨酸磷酸酶抑制和细胞毒性作用(shi,y.n.；pusch,s.；shi,y.m.；richter,c.；macia-vicente,j.g.；schwalbe,h.；kaiser,m.；opatz,t.；bode,h.b.j.org.chem.2019,84,11203-11209；yang,h.y.；qi,b.w.；ding,n.；jiang,f.f.；jia,f.f.；luo,y.；xu,x.p.；wang,l.l.；zhu,z.x.；liu,x.；tu,p.f.；shi,s.p.fitoterapia2019,137,8；pan,d.y.；zhang,x.x.；zheng,h.z.；zheng,z.h.；nong,x.h.；liang,x.；ma,x.；qi,s.h.org.chem.front.2019,6,3252-3258；xu,j.；hu,y.w.；qu,w.；chen,m.h.；zhou,l.s.；bi,q.r.；luo,j.g.；liu,w.y.；feng,f.；zhang,j.bioorganicchem.2019,90,7；zhao,d.l.；cao,f.；wang,c.y.；yang,l.j.；shi,t.；wang,k.l.；shao,c.l.；wang,c.y.journalofnaturalproducts2019,82,3201-3204；lou,j.f.；fu,l.y.；peng,y.l.；zhou,l.g.molecules2013,18,5891-5935)。目前还未见有关从该属真菌中分离得到补身烷混元萜类化合物或调节神经元兴奋性的报道。

技术实现要素：

基于此，本发明自中国南海软珊瑚lobophytumsp.共附生真菌alternariasp.的发酵液提取到几种混元萜类化合物，其中部分化合物具有调节神经元兴奋性的性能。

本发明的目的之一在于公开一种可调节神经元兴奋性的混元萜类化合物，其是以补身烷倍半萜为基础结构单元的衍生物，结构通式为

其中，r1是oh、＝o或与c-2形成双键；

r2与c-13形成环外双键；

r3是

r4是h或β-oh；

r5是h或＝o；

r6是h或oh；

或者，

r1是oh、＝o或与c-2形成双键；

r2是-o-；

r3与r2形成

r4是h或β-oh；

r5是h或＝o；

r6是h或oh。

本发明中，“α”和“β”为立体构型标识，代表键的朝向，在上述结构通式中，α构型表示键的朝向为纸面朝下，β构型表示键的朝向为纸面朝上，比如r4是β-oh表示的就是而未标识的则表示两种构型皆可。

优选的，

r1是oh或与c-2形成双键；

r2是h或与c-13形成环外双键；

r3是

r4是β-h、α-oh或β-oh；

r5是h或＝o；

r6是α-h或α-oh。

或者优选的，

r1是oh或与c-2形成双键；

r2是-o-；

r3与r2形成

r4是β-h、α-oh或β-oh；

r5是h或＝o；

r6是α-h或α-oh。

更优选的，其为真菌alternariasp.的发酵液提取的下列两种化合物(编号分别为d13和d36)中的一种，

本发明的目的之二在于提供一种混元萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述混元萜类化合物是以补身烷倍半萜为基础结构单元的衍生物，结构通式为

其中，r1是oh、＝o或与c-2形成双键；r2是h、-o-或与c-13形成环外双键；r3是或与r2形成r4是h、oh或oh；r5是h或＝o；r6是h或oh；

所述方法包括提取真菌alternariasp.的发酵液的步骤。

所述制备方法尤其适用于制备以下混元萜类化合物，

较佳的，所述制备方法还包括制备菌株发酵液的步骤。

优选的，制备菌株发酵液的步骤包括：

(1)从南海软珊瑚lobophytumsp.分离出共附生真菌alternariasp.，再将该菌株接种至培养基，在25～30℃发酵26～30天得到菌株发酵液；所述培养基含有2.5～4wt％的生物麦芽提取物和1.8～2.5wt％的琼脂；

其中，发酵温度优选27～29℃，更优选28℃。

发酵时间优选27～29天，优选28天。

所述培养基中，生物麦芽提取物含量优选2.8～3.5wt％，更优选3wt％；琼脂含量优选1.8～2.2wt％，更优选2wt％。

本发明的一些较佳实施例中，菌株发酵液的制备步骤具体为：将南海软珊瑚lobophytumsp.共附生真菌alternariasp.菌株接种至培养基，在28℃发酵28天得到菌株发酵液；所述培养基含有3wt％的生物麦芽提取物和2wt％的琼脂。

优选的，提取发酵液的步骤包括：

(2)提取发酵液：将菌株发酵液采用有机溶剂提取，提取液减压浓缩得总粗提物；

(3)分离纯化：总粗提物经过色谱分离纯化得到所述混元萜类化合物。

优选的，提取采用的所述有机溶剂为乙酸乙酯、二氯甲烷或者三氯甲烷，更优选乙酸乙酯。

优选的，提取时通过超声助溶。

优选的，所述色谱分离包括正相硅胶色谱柱层析、sephadexlh-20凝胶柱层析和高效液相色谱柱层析。

优选的，分离纯化包括步骤：

将总粗提物用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用ch2cl2∶meoh＝100∶1～1∶1洗脱液进行梯度洗脱，监测并收集含有化合物d13，d36和territremb的第一目标馏分；第一目标馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱(流动相为ch2cl2∶meoh＝2∶1)层析，监测并收集含有化合物d13，d36和territremb的第二目标馏；第二目标馏分浓缩后经正相硅胶色谱(流动相为ch2cl2∶meoh＝50∶1)和高效液相色谱纯化(流动相为meoh∶h2o＝75∶25，流速为1.5ml/min)，得到化合物d13，d36和territremb。

优选的，分离纯化包括步骤：

将总粗提物用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用ch2cl2∶meoh＝100∶1～1∶1洗脱液进行梯度洗脱，监测并收集含有化合物macrophorina和macrophorinb的第三目标馏分；第三目标馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱(流动相为ch2cl2∶meoh＝2∶1)层析，监测并收集含有化合物macrophorina和macrophorinb的第四目标馏分；

第四目标馏分浓缩后经正相硅胶色谱(流动相为ch2cl2∶meoh＝40∶1)和高效液相色谱纯化(流动相为meoh∶h2o＝72∶28，流速为1.5ml/min)，得到macrophorina；

或者，第四目标馏分浓缩后经正相硅胶色谱(流动相为二氯甲烷∶甲醇＝40∶1)和高效液相色谱纯化(流动相为meoh∶h2o＝68∶32，流速为1.5ml/min)，得到macrophorinb。

本发明的目的之三在于提供混元萜类化合物在制备抗癫痫药物中的药物中的应用，其特征在于，所述混元萜类化合物是以补身烷倍半萜为基础结构单元的衍生物，结构通式为

其中，r1是oh或与c-2形成双键；

r2是h或与c-13形成环外双键；

r3是

r4是h或oh；r5是h或＝o；r6是h或oh；

或者，

r1是oh或与c-2形成双键；

r2是-o-；

r3与r2形成

r4是h或oh；r5是h或＝o；r6是h或oh。

优选的，用于制备抗癫痫药物中的药物的混元萜类化合物是以下化合物中的一种或两种及以上，

经实验验证，本发明的上述三种混元萜类化合物可有效抑制小鼠原代大脑皮层神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶(4-aminopyridine，简称4-ap)对神经元的刺激作用，可用于神经保护药物的研发。

本发明的有益效果在于：

本发明从真菌alternariasp.的发酵液中提取分离得到本发明中的混元萜类化合物，通过红外、紫外、质谱和二维核磁共振等多种现代光谱技术的综合解析进行结构鉴定，确定了这些化合物的化学结构。本发明的混元萜类化合物有效抑制小鼠原代大脑皮层神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶对神经元的刺激作用，可用于神经保护药物的研发。本发明为神经保护药物研发提供了先导化合物和新的活性骨架，并且有利于海洋药用资源的开发和利用。

附图说明

图1为本发明的化合物d13对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中a为d13处理的皮层神经元的钙振荡在加入veh/4-ap(veh指0.1％dmso)前后的活动痕迹；(b)和(c)为d13抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(d)和(e)为d13抑制4-ap引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。

图2为本发明的化合物d36对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中a为d36处理的皮层神经元的钙振荡在加入veh/4-ap前后的活动痕迹；(b)和(c)为d36抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(d)和(e)为d36抑制4-ap引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。

图3为本发明的化合物territremb对小鼠神经元的自发同步钙振荡影响的测试数据图；其中a为territremb处理的皮层神经元的钙振荡在加入veh/4-ap前后的活动痕迹；(b)和(c)为territremb抑制钙振荡频率和幅度的浓度-效应关系；(d)和(e)为territremb抑制4-ap引发的钙振荡频率和幅度变化的浓度-效应关系。

具体实施方式

本发明从中国南海软珊瑚lobophytumsp.共附生真菌alternariasp.的发酵液中提取分离得到3种已知的混元萜类化合物territremb、macrophorina和macrophorinb以及2种新化合物d13和d36，通过红外、紫外、质谱和二维核磁共振等多种现代光谱技术的综合解析进行结构鉴定，确定了化合物d13和d36的化学结构。

实施例所用菌株的来源与鉴定：该真菌是于2015年12月从南海东沙环礁15米深处采集的软珊瑚lobophytumsp.体内组织中分离得到，经其rdna的基因间隔序列(its)分析被鉴定为alternariasp.(genbank注册号2081031)。

实施例1混元萜类化合物的制备

1、菌株发酵液的制备：将菌株接种至生物麦芽提取物(biomalt)琼脂(agar)培养基(3％biomalt，2％agar)，在28℃发酵28天。

2、制备总粗提物

将12l菌株发酵液，按常规乙酸乙酯超声提取，将提取液减压浓缩，得总粗提物27g。

3、分离纯化

将总粗提物用正相硅胶色谱(200～300目)分离，用ch2cl2∶meoh＝100∶1-1∶1洗脱液进行梯度洗脱，根据薄层板监测，按照各流份极性的差别从小到大共收集11个部分洗脱液，以馏分1-馏分11表示。

将馏分8经sephadexlh-20凝胶柱(流动相为ch2cl2∶meoh＝2∶1)层析，得到5部分，以馏分8.1-8.5表示，将馏分8.2经正相硅胶色谱(流动相为ch2cl2∶meoh＝50∶1)和高效液相色谱(hplc)纯化(流动相为meoh∶h2o＝75∶25，流速为1.5ml/min)，得到d13(12.3mg，保留时间为19.0min)，d368.0mg，保留时间为38.8min)和territremb(4.3mg，保留时间为31.0min)。

将馏分6经sephadexlh-20凝胶柱(流动相为ch2cl2∶meoh＝2∶1)层析，得到4部分，以馏分6.1-6.4表示，将馏分6.2经正相硅胶色谱(流动相为ch2cl2∶meoh＝40∶1)和高效液相色谱(hplc)纯化，得到macrophorina(1.4mg，流动相为meoh∶h2o＝72∶28，流速为1.5ml/min，保留时间为36.5min)，macrophorinb(1.5mg，流动相为meoh∶h2o＝68∶32，流速为1.5ml/min，保留时间为25min)。

结构鉴定

通过红外、紫外、质谱和二维核磁共振等多种现代光谱技术的综合解析进行结构鉴定，确定了化合物d13和d36的化学结构。

d13：无定形固体；[α]25d-117.8(c0.27,chcl3)；uv(ch3cn)λmax(logε)192nm(1.47),214(0.60),249(0.17)；ecd(ch3cn,c0.0055m)λmax(δε)290(-0.9),255(+2.0),210(-1.7)nm；ir(film)νmax3377,2956,2932,2871,1712,1643,1387,1178,1009cm^-1；hresimsm/z517.2237[m+na]⁺(calcdforc26h38o7sna,517.2236)。¹h和¹³c核磁共振数据见表1和表2。

d36：白色固体；[α]25d+305.2(c0.16,chcl3)；uv(ch3cn)λmax：197nm，231nm；ir(film)νmax3492,3360,3198,2924,2854,1712,1659,1463,1115和1034cm^-1；[m+h]⁺m/z526.2，c29h34o9。¹h和¹³c核磁共振数据见表1和表2。

territremb：白色固体；[α]25d+92.7(c0.10,chcl3)；[m+h]⁺m/z526.2，c29h34o9。¹h和¹³c核磁共振数据见文献：peng,f.-c.journalofnaturalproducts1997,60,842-843.

macrophorina：白色固体；[α]25d+20.6(c0.14,meoh)；¹h和¹³c核磁共振数据见文献：sassa,t.；yoshikoshi,h.agriculturalandbiologicalchemistry1983,47,187-189；sassa,t.；ishizaki,a.；nukina,m.；ikeda,m.；sugiyama,t.bioscience,biotechnology,andbiochemistry1998,62,2260-2262。

macrophorinb：白色固体；[α]25d+55.1(c0.08,meoh)；¹h和¹³c核磁共振数据见文献：sassa,t.；yoshikoshi,h.agriculturalandbiologicalchemistry1983,47,187-189；sassa,t.；ishizaki,a.；nukina,m.；ikeda,m.；sugiyama,t.bioscience,biotechnology,andbiochemistry1998,62,2260-2262。

表1d13和d36的氢谱数据

600mhz,incdcl3,jinhz

表2d13和d36的碳谱数据

150mhz,incdcl3,jinhz

实施例2本发明化合物对小鼠原代皮质神经元自发同步钙振荡的影响实验

1、小鼠大脑皮层神经元的分离与培养

c57bl/6j小鼠大脑皮层神经元的分离与培养见参考文献(zheng,j.；yu,y.；feng,w.；li,j.；liu,j.；zhang,c.；dong,y.；pessah,in.；cao,z.environmentalhealthperspectives2019,127,67003)。取出生0-1天的乳鼠，断头，取大脑。在解剖镜下分离大脑皮层，仔细剥除脑膜，巴斯德吸管吹散后，胰蛋白酶37℃消化25min。在含有胰蛋白酶抑制剂(soybean)和脱氧核糖核酸酶i的解剖缓冲液中将皮层吹散为单细胞悬液，取细胞悬液离心(1000rmp/5min)。用neuronplatingmedia重悬，以1×106个cells/ml的密度接种于经0.5mg/ml的多聚-l-赖氨酸包被的96孔flipr板上，每孔150μl。24h-36h内加10μm阿糖胞苷，每孔10μl。细胞板培养于37℃、5％co2和95％湿度的细胞培养箱中。第5天、第7天各换液一次。

2、胞内同步自发钙振荡的测定

原代神经元培养9天之后，吸弃96孔板中的培养基，每孔加入60μl含有染料的缓冲液(含有4μmfluo-4和5％牛血清白蛋白的lockes’缓冲液)，在37℃、5％co2和95％湿度的环境下孵育45min-60min，然后用lockes’缓冲液洗5次，最终每孔剩余150μl的液体。将细胞置入flipr中，激发波长为470-495nm，发射波长515-575nm，每1s读一个点。记录基线自发ca²⁺振荡5分钟后，加入25μl浓度为终浓度8倍的化合物工作液，并监测[ca²⁺]i15分钟。为了测试化合物抗癫痫能力，加入癫痫引发剂25μl4-ap(80μm)，并继续监测[ca²⁺]i，持续10分钟。给出的数据是f/f0的值，其中f是任何时间点的荧光强度，f0是基本荧光强度。

实验结果

对比对照组和本发明合物处理组的神经元钙离子振荡的活动(振幅和频率)来分析化合物对神经元兴奋性的影响。如图1所示，图1为化合物d13在不同浓度下对神经元钙振荡的影响。化合物d13浓度依赖性地降低钙振荡的频率和振幅，其频率ic50值为3.2μm，振幅ic50值为1.8μm。此外，d13还有效地抑制了4-ap诱导的皮质神经元钙振荡的过分活跃，其频率ic50值为10.0μm，振幅ic50值为4.6μm。化合物d36和territremb对神经元钙振荡的活动具有类似的抑制作用，见图2和图3。化合物macrophorina和macrophorinb对神经元钙振荡的活动影响不明显。

上述实验结果表明，本发明中的几个化合物在较低的微摩尔浓度下能有效地抑制神经元的兴奋性，并能解除癫痫诱发剂4-氨基吡啶对神经元的刺激作用，可用于制备神经保护的药物。本发明为研制新的神经保护药物提供了先导化合物和新的活性骨架，有利于开发利用海洋药用资源。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。