一种用于肺炎致病菌及耐药基因检测的试剂盒的制作方法

1.本发明具体涉及一种用于肺炎致病菌及耐药基因检测的试剂盒。


背景技术：

2.《小儿肺炎患者院感病原菌检测、耐药性及其防治措施》，中国卫生检验杂志2019年3月第29卷第6期chin j health lab tec，mar.2019，vol.29，no.6通过方法回顾性分析1194例肺炎患儿临床资料，结果1194例肺炎患儿痰标本中有835例检出病原菌，发病率为69.9％，常见病原菌为革兰阴性杆菌450株(53.9％)，以肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌、卡他莫拉菌为主；其次是革兰阳性球菌351株(42.0％)，以肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌为主；真菌34株(4.1％)，以白色念珠菌为主。常见病原菌耐药性较高，其中肺炎克雷伯杆菌、流感嗜血杆菌、大肠埃希菌对头孢唑林、氨苄西林和肺炎链球菌对克林霉素、青霉素的耐药率为100.0％，金黄色葡萄球菌对克林霉素的耐药率为100.0％。
3.明确肺炎致病菌的种类是肺炎早诊断、及时采取有效治疗措施、减少肺炎病死率的重要环节。cn107338315a公开了用于15种肺炎致病菌快速检测的试剂盒，但该试剂盒需要分成3管进行多重不对称pcr反应。
4.另外，由于部分病原菌耐药性较高，因此，仅检测肺炎致病菌是不够的，还需要尽快明确致病菌的耐药特性，采用针对性的治疗措施，才能够有效降低肺炎病死率和死亡率。cn107475422a公开了用于肺炎致病菌耐药基因快速检测的试剂盒，但该试剂盒需要分成4管进行pcr反应。
5.并且，目前的试剂盒仅能够单独检测致病菌和耐药基因，从而使得目前的检测方法较为繁琐，所需试剂和样本较多。


技术实现要素：

6.为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种能够同时检测肺炎致病菌和耐药基因的试剂盒。
7.为解决以上技术问题，本发明采取如下技术方案：
8.本发明一方面提供一种用于肺炎致病菌及耐药基因检测的试剂盒，所述的试剂盒包括用于多重不对称pcr反应的引物、以及含有探针的基因芯片。
9.所述的引物包括对应于肺炎致病菌的引物对以及对应于肺炎致病菌耐药基因的引物对，所述的探针包括对应于肺炎致病菌的探针以及对应于肺炎致病菌耐药基因的探针，且至少部分所述的引物对和至少部分所述的探针对应于同一种肺炎致病菌或肺炎致病菌耐药基因；从而使得本发明的试剂盒可以同时检测肺炎致病菌和耐药基因。
10.其中，“至少部分所述的引物对和至少部分所述的探针对应于同一种肺炎致病菌或肺炎致病菌耐药基因”是指，例如当所述的引物对包括针对鲍曼不动杆菌的引物对时，所述的探针至少包括针对鲍曼不动杆菌的探针；而对于甲氧西林来说，需要femb基因和meca基因协同表达，则所述的引物对至少包括针对金黄色葡萄球菌的femb基因的引物对以及针
对meca的引物对，所述的探针至少包括针对meca的探针。
11.所述的引物对包括对应于鲍曼不动杆菌的oxa-51型基因的第一引物对、对应于金黄色葡萄球菌的femb基因的第二引物对、对应于肺炎链球菌的自溶素基因lyta基因的第三引物对、对应于肺炎克雷伯杆菌的荚膜多糖的合成调节基因rcsa基因的第四引物对、对应于大肠埃希氏菌的管家基因phoa基因的第五引物对、对应于铜绿假单胞菌o抗原乙酰基转移酶基因pao1的第六引物对、对应于流感嗜血杆菌的外膜p6基因omp6基因的第七引物对、对应于产酸克雷伯菌的pehx基因的第八引物对、对应于阴沟肠杆菌的分子伴侣基因dnaj基因的第九引物对、对应于溶血葡萄球菌的微生物甲羟戊酸途径辅酶a mvas基因的第十引物对中的一种或多种，以及对应于超广谱β－内酰胺酶shv的第十一引物对、对应于超广谱β－内酰胺酶tem的第十二引物对、对应于超广谱β－内酰胺酶ctx-m-q1的第十三引物对、对应于超广谱β－内酰胺酶ctx-m-14的第十四引物对、对应于碳青霉烯酶oxa-23的第十五引物对、对应于甲氧西林耐药基因meca的第十六引物对中的一种或多种；所述的探针包括主体序列以及在所述的主体序列的5’端标记的多个碱基t，所述的主体序列包括对应于鲍曼不动杆菌的第一主体序列、对应于金黄色葡萄球菌的第二主体序列、对应于肺炎链球菌的第三主体序列、对应于肺炎克雷伯杆菌的第四主体序列、对应于大肠埃希氏菌的第五主体序列、对应于铜绿假单胞菌的第六主体序列、对应于流感嗜血杆菌的第七主体序列、对应于产酸克雷伯菌的第八主体序列、对应于阴沟肠杆菌的第九主体序列、对应于溶血葡萄球菌的第十主体序列中的一种或多种，以及对应于shv的第十一主体序列、对应于tem的第十二主体序列、对应于ctx-m-q1的第十三主体序列、对应于ctx-m-14的第十四主体序列、对应于oxa-23的第十五主体序列、对应于meca的第十六主体序列中的一种或多种。
12.其中，ctx-m-q1属于ctx-m-1群；ctx-m-14属于ctx-m-9群。
13.本发明中，主体序列的5’端标记的碱基t的个数为8～16个，优选为9～15个，优选为10～14个，优选为11～13个，最优选为12个。
14.本发明的试剂盒可以检测鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、溶血葡萄球菌中的至少一种以及shv、tem、ctx-m-q1、ctx-m-14、oxa-23、meca中的至少一种。
15.根据一种优选方式，当本发明的试剂盒同时含有上述十六对引物对和上述十六条探针时，本发明的试剂盒可以同时检测鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、流感嗜血杆菌、产酸克雷伯菌、阴沟肠杆菌、溶血葡萄球菌、shv、tem、ctx-m-q1、ctx-m-14、oxa-23、meca。
16.所述的第一引物对的正向引物的序列为caccataaggcaaccaccaca(seq id no.1)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为caacacgcttcacttccttagaca(seq id no.2)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
17.所述的第二引物对的正向引物的序列为caactgagtatgatacatcgagcca(seq id no.3)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为agcacgctcttcagtttcacg(seq id no.4)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具
有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
18.所述的第三引物对的正向引物的序列为taagaacagatttgcctcaagtcg(seq id no.5)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为ctgcataggtctcagcattcca(seq id no.6)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
19.所述的第四引物对的正向引物的序列为ggatatctgaccagtcgggga(seq id no.7)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为gccgggttttgcgtaatga(seq id no.8)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
20.所述的第五引物对的正向引物的序列为agcggttgattgatcaggtagag(seq id no.9)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列与tcacaggggtaaacagtaacggt(seq id no.10)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
21.所述的第六引物对的正向引物的序列为gggtcgaaaggtggttgttatc(seq id no.11)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为ctggtgcggctgagtctgag(seq id no.12)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
22.所述的第七引物对的正向引物的序列为atgcaacgccagctgctaa(seq id no.13)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为ttcttcaccgtaagatactgtgcc(seq id no.14)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
23.所述的第八引物对的正向引物的序列为ggagtatgcctttacggtgcg(seq id no.15)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为accttgcagccctgaggatag(seq id no.16)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
24.所述的第九引物对的正向引物的序列为tactgtgaagtcccgatcaacttt(seq id no.17)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为cgtgggctgtttttctcacc(seq id no.18)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
25.所述的第十引物对的正向引物的序列为tggtcgcttagtcggaacaatag(seq id no.19)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为
tgctgaaaagttctgtgccaatc(seq id no.20)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
26.所述的第十一引物对的正向引物的序列为ggatgccggtgacgaacag(seq id no.21)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为ccgtttcccagcggtcaa(seq id no.22)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
27.所述的第十二引物对的正向引物的序列为cccgaagaacgttttccaatg(seq id no.23)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为tcacgctcgtcgtttggtatg(seq id no.24)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
28.所述的第十三引物对的正向引物的序列为acgctgggtaaagcattggg(seq id no.25)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为ccttaggttgaggctgggtga(seq id no.26)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
29.所述的第十四引物对的正向引物的序列为ggatcgcactgaacctacgc(seq id no.27)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为gctgccggtcttatcaccc(seq id no.28)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
30.所述的第十五引物对的正向引物的序列为gctgaaattggacagcaggttg(seq id no.29)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为gcatttctgaccgcatttccata(seq id no.30)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
31.所述的第十六引物对的正向引物的序列为gaagttagattgggatcatagcgtc(seq id no.31)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性；反向引物的序列为tcatcttgtacccaattttgatccat(seq id no.32)，或与其具有至少80％同源性，优选具有至少85％的同源性，进一步优选具有至少90％的同源性，更优选具有至少95％的同源性。
32.所述的第一主体序列与gaaagcttccgctattccggtttatcaagatttagctcgtcgtattgg具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的鲍曼不动杆菌的探针序列为ttttttttttttgaaagcttccgctattccggtttatcaagatttagctcgtcgtattgg(seq id no.33)。
33.所述的第二主体序列与tgtttcaggtgttttaccttcaaggtttaatacgcccatccatcg具有
至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的金黄色葡萄球菌的探针序列为tttttttttttttgtttcaggtgttttaccttcaaggtttaatacgcccatccatcg(seq id no.34)。
34.所述的第三主体序列与cccccaacgtcccaggcaccattatcaacaggtcctacc和/或tcaggatcttttctgtaatggtagtcagcctcattttgaaccgttg和/或ggtctttccgccagtgataatccgcttcattctgtacggttg具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的肺炎链球菌的探针序列如ttttttttttttcccccaacgtcccaggcaccattatcaacaggtcctacc(seq id no.35)和/或tttttttttttttcaggatcttttctgtaatggtagtcagcctcattttgaaccgttg(seq id no.36)和/或ttttttttttttggtctttccgccagtgataatccgcttcattctgtacggttg(seq id no.37)。
35.所述的第四主体序列与ttcattcagaaacaccaccgccgggcaacacgac和/或tgcagatccgcagcattgttgacctcaacgatttcc具有至少80％同源性，优选具有至少83％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少89％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少95％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的肺炎克雷伯杆菌的探针序列如ttttttttttttttcattcagaaacaccaccgccgggcaacacgac(seq id no.38)和/或tttttttttttttgcagatccgcagcattgttgacctcaacgatttcc(seq id no.67)。
36.所述的第五主体序列与ctccgtatcgtcgtcaggaatgctggcatcgggct具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的大肠埃希氏菌的探针序列如ttttttttttttctccgtatcgtcgtcaggaatgctggcatcgggct(seq id no.39)。
37.所述的第六主体序列与cctggattgtttcgccgaacgtgatggctggtc和/或cgtcgcctacgtgaatgcgctgttcgatgcgttgg和/或cgtgctctgcgatggcctggattgtttcgccgaac和/或gatgtcgggcgcgcacgttttcccttcgctgag和/或tgccgatcgcgccggatgatcgaagtgatcaggtag具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的铜绿假单胞菌的探针序列如ttttttttttttcctggattgtttcgccgaacgtgatggctggtc(seq id no.40)和/或ttttttttttttcgtcgcctacgtgaatgcgctgttcgatgcgttgg(seq id no.41)和/或ttttttttttttcgtgctctgcgatggcctggattgtttcgccgaac(seq id no.42)和/或ttttttttttttgatgtcgggcgcgcacgttttcccttcgctgag(seq id no.43)和/或tttttttttttttgccgatcgcgccggatgatcgaagtgatcaggtag
(seq id no.44)。
38.所述的第七主体序列与ttacctgctaaataacctttaactgcatctgcacgacgttgtcct具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的流感嗜血杆菌的探针序列如ttttttttttttttacctgctaaataacctttaactgcatctgcacgacgttgtcct(seq id no.45)。
39.所述的第八主体序列与gctttaaccaccgcgctgtccggagattcctggcc和/或gaatgtgctggcttcgatgacgtgcggcgttttgc具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的产酸克雷伯菌的探针序列如ttttttttttttgctttaaccaccgcgctgtccggagattcctggcc(seq id no.46)和/或ttttttttttttgaatgtgctggcttcgatgacgtgcggcgttttgc(seq id no.47)。
40.所述的第九主体序列与gtggttgaaaccccggttggcctgaatgacaagcagaa和/或ctgaaaatcccaggcgaaacgcagaccggtaagctgttcc具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的阴沟肠杆菌的探针序列如ttttttttttttgtggttgaaaccccggttggcctgaatgacaagcagaa(seq id no.48)和/或ttttttttttttctgaaaatcccaggcgaaacgcagaccggtaagctgttcc(seq id no.49)。
41.所述的第十主体序列与gcaatactttcgtaccgccaccgacgatcgctaatgtcat和/或ccaacagcagcaacaacctgacctaattcttgtgctgattga和/或attcaagtgatgctttcgcaattggcaatactttcgtaccgc具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的溶血葡萄球菌的探针序列如ttttttttttttgcaatactttcgtaccgccaccgacgatcgctaatgtcat(seq id no.50)和/或ttttttttttttccaacagcagcaacaacctgacctaattcttgtgctgattga(seq id no.51)和/或ttttttttttttattcaagtgatgctttcgcaattggcaatactttcgtaccgc(seq id no.52)。
42.所述的第十一主体序列与gctgaccggcgagtagtccaccagatcctgctggcgatagt和/或cgagtagtccaccagatcctgctggcgatagtggatctttc具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的shv的探针序列如ttttttttttttgctgaccggcgagtagtccaccagatcctg
ctggcgatagt(seq id no.53)和/或ttttttttttttcgagtagtccaccagatcctgctggcgatagtggatctttc(seq id no.54)。
43.所述的第十二主体序列与ggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggg和/或atgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaa具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的tem的探针序列如ttttttttttttggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatggg(seq id no.55)和/或ttttttttttttatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaa(seq id no.66)。
44.所述的第十三主体序列与gccaaaagatcgtgcgccgctgattctggtc和/或acgggcgcagctggtgacatggatgaaaggcaata具有至少80％同源性，优选具有至少83％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少89％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少95％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的ctx-m-q1的探针序列如ttttttttttttgccaaaagatcgtgcgccgctgattctggtc(seq id no.56)和/或ttttttttttttacgggcgcagctggtgacatggatgaaaggcaata(seq id no.64)。
45.所述的第十四主体序列与attcgggccggcttaccgacgtcgtggactgtgggtgata具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的ctx-m-14的探针序列如ttttttttttttattcgggccggcttaccgacgtcgtggactgtgggtgata(seq id no.57)。
46.所述的第十五主体序列与gggttgagcagccagatggaaaaattgtcgcttttgcatta具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的oxa-23的探针序列如ttttttttttttgggttgagcagccagatggaaaaattgtcgcttttgcatta(seq id no.58)。
47.所述的第十六主体序列与cctatctcatatgctgttcctgtattggccaattccacattgtttcgg和/或gaacgatgcctatctcatatgctgttcctgtattggccaattccac具有至少80％同源性，优选具有至少82％的同源性，优选具有至少84％的同源性，优选具有至少86％的同源性，优选具有至少88％的同源性，优选具有至少90％的同源性，优选具有至少92％的同源性，优选具有至少94％的同源性，优选具有至少96％的同源性，优选具有至少98％的同源性。根据一种具体且优选地实施方式，对应于所述的meca的探针序列如ttttttttttttcctatctcatatgctgttcctgtattggccaattccacattgtttcgg(seq id no.59)和/或ttttttttttttgaacgatgcctatctcatatgctgttcctgtattggccaattccac(seq id no.65)。
48.对于主体序列有多个的方案，可以在芯片上同时包括各个不同序列的探针，从而提高检测的准确性，但同时也会增加成本。因此，对于分型较多的致病菌和耐药基因，优选采用多个探针分别固定于不同的芯片孔中，以提高检测的准确性；而对于分型较少的致病
端未经12个t修饰的序列)的5’端采用氨基修饰；所述的阳性探针互补荧光引物的5’端进行荧光修饰；所述的阴性探针的主体序列(即5’端未经12个t修饰的序列)的5’端采用氨基修饰。
57.根据上述方案中，采用hex进行所述的荧光标记。
58.本发明中，所述的肺炎致病菌及耐药基因为小儿肺炎致病菌及耐药基因。
59.本发明第二方面提供一种所述的试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
60.(1)提取待测样品的dna；
61.(2)采用所述的试剂盒中的引物对所述的dna进行多重不对称pcr反应，所述的反应的条件为
[0062][0063]
(3)将步骤(2)扩增后的样本加入所述的基因芯片进行杂交反应。
[0064]
本发明的第三方面提供一种用于肺炎致病菌及耐药基因检测的引物，所述的引物包括上述用于多重不对称pcr反应的引物。
[0065]
本发明的第四方面提供一种用于肺炎致病菌及耐药基因检测的基因芯片，所述的基因芯片包括上述探针。
[0066]
由于以上技术方案的实施，本发明与现有技术相比具有如下优点：
[0067]
本发明的试剂盒可以同时检测肺炎致病菌及耐药基因，并且，本发明的试剂盒在进行多重不对称pcr反应时，可以在1管中进行，而无需分成多管，从而节约了原料和样本的用量，且更便于检测人员使用，本发明操作简便，准确性高，可重复性强，可在4.5小时内给出检测结果，对于临床医生的用药有一定的指导意义。
附图说明
[0068]
图1为本发明的试剂盒进行检测的流程图；
[0069]
图2为针对鲍曼不动杆菌oxa-51的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0070]
图3为针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌femb的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0071]
图4为针对肺炎链球菌lyta的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0072]
图5为针对肺炎克雷伯菌rcsa的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0073]
图6为针对大肠埃希氏菌phoa的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0074]
图7为针对铜绿假单胞菌pao1的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0075]
图8为针对流感嗜血杆菌omp6的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0076]
图9为针对产酸克雷伯菌pehx的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0077]
图10为针对阴沟肠杆菌dnaj的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0078]
图11为针对溶血葡萄球菌mvas的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0079]
图12为针对耐药基因shv的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0080]
图13为针对耐药基因tem的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0081]
图14为针对耐药基因ctx-m-q1的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0082]
图15为针对耐药基因ctx-m-14的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0083]
图16为针对耐药基因oxa-23的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0084]
图17为针对耐药基因meca的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0085]
图18为针对aac-aph的引物对的扩增产物的凝胶电泳图；
[0086]
图19为针对鲍曼不动杆菌oxa-51的引物对的扩增产物的测序结果；
[0087]
图20为针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌femb的引物对的扩增产物的测序结果；
[0088]
图21为针对肺炎链球菌lyta的引物对的扩增产物的测序结果；
[0089]
图22为针对肺炎克雷伯菌rcsa的引物对的扩增产物的测序结果；
[0090]
图23为针对大肠埃希氏菌phoa的引物对的扩增产物的测序结果；
[0091]
图24为针对铜绿假单胞菌pao1的引物对的扩增产物的测序结果；
[0092]
图25为针对流感嗜血杆菌omp6的引物对的扩增产物的测序结果；
[0093]
图26为针对产酸克雷伯菌pehx的引物对的扩增产物的测序结果；
[0094]
图27为针对阴沟肠杆菌dnaj的引物对的扩增产物的测序结果；
[0095]
图28为针对溶血葡萄球菌mvas的引物对的扩增产物的测序结果；
[0096]
图29为针对耐药基因shv的引物对的扩增产物的测序结果；
[0097]
图30为针对耐药基因tem的引物对的扩增产物的测序结果；
[0098]
图31为针对耐药基因ctx-m-q1的引物对的扩增产物的测序结果；
[0099]
图32为针对耐药基因ctx-m-14的引物对的扩增产物的测序结果；
[0100]
图33为针对耐药基因oxa-23的引物对的扩增产物的测序结果；
[0101]
图34为针对耐药基因meca的引物对的扩增产物的测序结果；
[0102]
图35为针对aac-aph的引物对的扩增产物的测序结果；
[0103]
图36为a332143号样本的芯片扫描图；
[0104]
图37为a332165号样本的芯片扫描图；
[0105]
图38为a0332132号样本的芯片扫描图；
[0106]
图39为a332387号样本的芯片扫描图；
[0107]
图40为a0333225号样本的芯片扫描图；
[0108]
图41为700324号样本的芯片扫描图；
[0109]
图42为a332025号样本的芯片扫描图；
[0110]
图43为a0332693号样本的芯片扫描图；
[0111]
图44为a0334091号样本的芯片扫描图；
[0112]
图45为流感嗜血杆菌样本的芯片扫描图；
[0113]
图46为一个临床咽试纸样本的芯片扫描图；
[0114]
图47为另一个临床咽试纸样本的芯片扫描图；
[0115]
图48为阴性对照图；
[0116]
图49为不同菌落数的肺炎克雷伯菌的芯片扫描图。
具体实施方式
[0117]
下面结合具体实施例对本发明做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。实施例中采用的实施条件可以根据具体使用的不同要求做进一步调整，未注明的实施条件为本行业中的常规条件。本发明中的各序列按照5'—3'顺序书写。
[0118]
一、实验材料/设备/试剂：
[0119]
1、实验材料：
[0120]
omega d6943-01质粒小量提取试剂盒(培养细菌提取试剂盒)。
[0121]
天根高效口腔拭子基因组dna提取试剂盒(离心柱型)(dp362)(临床样本提取试剂盒)。
[0122]
天根的hotmaster taq dna聚合酶(货号et106)(多重扩增酶)；
[0123]
下述实施例中采用的引物及探针(通用生物合成)，各反向引物采用hex荧光标记。其中各引物的序列如seq id no.1至seq id no.32、seq id no.68、seq id no.69、seq id no.72以及seq id no.73所示。探针的序列如seq id no.33至seq id no.59、seq id no.64至67、seq id no.70、seq id no.71以及seq id no.74所示，各探针的主体序列的5'端c6采用氨基修饰。表面质控探针如seq id no.60所示，其5'端c6采用氨基修饰，3'端采用hex荧光标记。阳性探针如seq id no.61所示。阳性探针互补荧光引物如seq id no.62所示，其5'端采用hex荧光标记，阴性探针如seq id no.63所示。
[0124]
10％sds溶液(生工)；
[0125]
20
×
ssc缓冲液，depc处理(生工)；
[0126]
醛基基片(博奥晶典)；
[0127]
denhardt's solution(50
×
)therom 750018，
[0128]
无核酸酶水ambion am9930。
[0129]
2、实验设备：
[0130]
pcr仪，biomixerⅱ生物芯片杂交仪，晶芯personalarrayer 16个人点样仪，slidewasher 8生物芯片洗干仪
[0131]
3、试剂配制：
[0132]
封闭液配制：通风橱中操作，在1000ml玻璃烧杯中将45ml 10
×
pbs加纯化水稀释至450ml，称取1.5g硼氢化钠加入上述溶液至完全溶解，再量取150ml无水乙醇加入混匀，备用；
[0133]
0.2％sds配制：在1000ml玻璃烧杯中将12ml 10％sds加纯化水稀释至600ml；
[0134]
杂交液配制：50％去离子甲酰胺，3
×
ssc，0.2％sds，5
×
denhardts，样本(4μl)(多重pcr产物)；
[0135]
洗液1：0.3
×
ssc，0.1％sds；
[0136]
洗液2：0.06
×
ssc。
[0137]
二、实验方法：
[0138]
1.样品制备：
[0139]
实验室保存的临床菌株过夜培养后，采用omega d6943-01质粒小量提取试剂盒提取得到细菌质粒dna。
[0140]
临床样本：用咽试纸采集样本，拿到后采用天根高效口腔拭子基因组dna提取试剂
盒(离心柱型)(dp362)直接提取细菌dna。
[0141]
2.多重不对称引物混合：
[0142]
本实验采用天根的hotmaster taq dna聚合酶(货号et106)作为扩增反应试剂。并按照实验优化后的引物浓度，引物按照普通引物：荧光引物＝1:10的摩尔浓度比对混合。
[0143]
3.多重pcr反应体系：
[0144]
试剂名称用量(20μl)dna5μl多重pcr mastermix10μlm-primer1μlh2o4μl
[0145]
多重引物测试引物浓度为0.5μm。
[0146]
4.多重pcr反应条件
[0147][0148]
5.将上述实验材料所列各单个引物对按照上述步骤2至步骤4实验方法进行多重pcr扩增，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行测序。
[0149]
针对鲍曼不动杆菌oxa-51的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图2所示，测序结果如图19所示。针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌femb的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图3所示，测序结果如图20所示。针对肺炎链球菌lyta的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图4所示，测序结果如图21所示。针对肺炎克雷伯菌rcsa的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图5所示，测序结果如图22所示。针对大肠埃希氏菌phoa的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图6所示，测序结果如图23所示。针对铜绿假单胞菌pao1的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图7所示，测序结果如图24所示。针对流感嗜血杆菌omp6的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图8所示，测序结果如图25所示。针对产酸克雷伯菌pehx的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图9所示，测序结果如图26所示。针对阴沟肠杆菌dnaj的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图10所示，测序结果如图27所示。针对溶血葡萄球菌mvas的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图11所示，测序结果如图28所示。针对耐药基因shv的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图12所示，测序结果如图29所示。针对耐药基因tem的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图13所示，测序结果如图30所示。针对耐药基因ctx-m-q1的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图14所示，测序结果如图31所示。针对耐药基因ctx-m-14的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图15所示，测序结果如图32所示。针对耐药基因oxa-23的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图16所示，测序结果如图33所示。针对耐药基因meca的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图17所示，测序结果如图34所示。针对aac-aph的引物对的扩增产物的凝胶电泳图如图18所示，测序结果如图35所示。
[0150]
6.将上述实验材料中所列十八对引物对混合为1管，按照上述步骤2至步骤4的方
法进行多重pcr扩增。
[0151]
7.样本杂交步骤
[0152]
7.1芯片探针阵列设计
[0153]
根据需要设计探针阵列，保证芯片上具有针对18种致病菌及耐药基因的探针中的至少一种，部分致病菌或耐药基因可以固定两个及以上不同的探针，并且，每个探针分别加入并排的三个孔中做平行样，表面质控探针终浓度在0.5μm，不需要太明显，主要用于探针的定位和监测芯片点制流程。
[0154]
7.2芯片预处理：探针固定、封闭
[0155]
(1)用水稀释探针至目标浓度的两倍，然后跟点样液等比例混合，点样浓度为10μm。
[0156]
(2)用接触式点样仪将步骤(1)得到的核酸样品按照步骤7.1设计的阵列点样于基片表面。
[0157]
(3)点样后芯片于湿盒中放置；37℃12小时以上固定。
[0158]
(4)将芯片插入芯片架，放入盛有0.2％sds清洗液的烧杯中，在摇床上以75rpm速度摇洗5min；取出含有芯片的芯片架放入盛有纯化水的烧杯中，在摇床上以110rpm速度摇洗3min。
[0159]
(5)将芯片放入盛有封闭液的烧杯中，在摇床上以75rpm速度摇洗5min；取出芯片架及芯片放入盛有纯化水的烧杯中，在摇床上以110rpm速度摇洗3min，甩干；离心后观察芯片表面是否洁净无水痕，如有异样，则重复离心操作。
[0160]
7.3芯片围栏操作：
[0161]
(1)去掉杂交围栏上的胶纸，胶面朝上，放在杂交模具中心凹槽中。
[0162]
(2)用手捏着芯片上贴有标签纸一段，将芯片另一端顶着模具的顶端，然后将芯片正面朝下放入模具。轻轻用镊子下按(隔开不同的样本，防止交叉污染)，贴好围栏往杂交盒底部的水槽中加入少量ddh2o(200μl)防止杂交液挥发。
[0163]
(3)把芯片正面(有杂交围栏的一面)朝上放入杂交盒中，按芯片摆放方向盖上盖片，注意使盖片上的凸面朝下，以4样品围栏为例，使盖片上的4个凸起正好覆盖4个点阵，形成4个微量的杂交室，盖上杂交盒。
[0164]
7.4芯片杂交：
[0165]
以4围栏为例：配4份12μl杂交样本混合液，混匀，离心3000r/min，30s。95
°
变性5min，冰浴5min。用移液器将4份杂交液分别注入盖片的四个小孔。确认杂交液覆盖后，放进杂交盒，放入45
°
杂交仪中杂交1.5h。
[0166]
7.5芯片清洗
[0167]
(1)取出芯片，将芯片放入清洗仪中42℃洗液i(0.3％ssc，0.1％sds)中清洗4分钟；
[0168]
(2)42℃洗液ii(0.06％ssc)中清洗4分钟，离心甩干。
[0169]
7.6芯片扫描
[0170]
扫描参数：pmt:65；power:520。
[0171]
7.7.检测结果
[0172]
本发明采用的实验室样本的情况见表1。
[0173]
表1
[0174][0175][0176]
图36至44是按照一种探针阵列排布制备得到的芯片检测表1中部分样本的扫描结果图，图46和图47是该种探针阵列排布的芯片检测临床咽试纸样本的扫描结果，图48为该种探针阵列排布的芯片的阴性对照的扫描结果。其中，tem的亮点固定的探针的序列为seq id no.55，ctx-m-q1对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.56、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.64，phoa的亮点固定的探针的序列为seq id no.39，shv对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.53、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.54，rcsa的亮点固定的探针的序列为seq id no.38，oxa23的亮点固定的探针的序列为seq id no.58，oxa51的亮点固定的探针的序列为seq id no.33，pao1对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.40、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.41，pehx对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.46、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.47，meca
对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.59、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.65，femb的亮点固定的探针的序列为seq id no.34，dnaj对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.48、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.49，mvas对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.50、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.51。aac对应的亮点固定的探针的序列为seq id no.74。从图36至图44可见，扫描结果与细菌样本及相应细菌样本的耐药性一致。根据临床医生的反馈，图46和47的检测结果与临床判断一致。
[0177]
图45是按照另一种探针阵列排布制备得到的芯片检测流感嗜血杆菌的扫描结果图，其中，tem对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.55、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.66，流感的亮点固定的探针的序列为seq id no.45。
[0178]
7.8芯片灵敏度测试结果
[0179]
按照再一种探针阵列制备得到的芯片检测不同菌落数的肺炎克雷伯菌，其中图49为不同菌落数的芯片扫描结果，其中，shv对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.53、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.54，tem对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.55、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.66，ctx-m-q1对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.56、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.64，23s对应的上排亮点固定的探针的序列为seq id no.70、下排亮点固定的探针的序列为seq id no.71。可见，本发明的芯片的灵敏度可达3*103cfu/ml。
[0180]
以上对本发明做了详尽的描述，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明的精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。