一株过表达Spt7基因的黑曲霉工程菌株与应用

一株过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株与应用
技术领域
1.本发明属于技术领域，特别是涉及黑曲霉菌株中转录调控因子spt7的功能及其应用。


背景技术：

2.saga（spt
‑
ada
‑
gcn5 acetyltransferase complex）即spt
‑
ada
‑
gcn5乙酰转移酶复合体，是一个多亚基保守的转录辅助因子，主要负责体内 10%的基因转录。最早发现于酿酒酵母中，随后在果蝇、家兔以及人类等真核生物中被鉴定存在。作为一类多功能蛋白复合体，saga复合物通过对组蛋白翻译后修饰，包括组蛋白乙酰化和去泛素化，实现染色质结构在沉默和活跃状态之间的转换，为基因转录起始创造了合适的遗传条件。其还能与基因特异性转录激活因子、通用转录因子以及 rna 聚合酶 ii等作用，帮助将它们募集到靶基因的启动子区域，直接参与多种生物学过程，包括基因转录、dna 损伤修复、mrna 输出等。
3.saga 复合物的结构与功能目前发现 saga 复合物由至少 20 个蛋白组成，以酿酒酵母为例，分为四大类，包括转录接头蛋白（ada）：负责组蛋白的乙酰化；spt 结构蛋白：负责复合物结构的稳定；tbp 相关蛋白（taf）和 tral 蛋白：这两类的蛋白亚基是 tata box 的相关蛋白，主要负责染色质重塑和募集其他转录因子到启动子区域，参与基因的转录调控。同时还含有两个具有催化功能的亚基，gcn5 和 ubp8，能够分别对组蛋白 h3 和 h2b进行乙酰化和去泛素化。saga 复合物主要通过组蛋白乙酰化、去泛素化、tata 结合蛋白作用参与真核生物基因的调控。此外 spt7、adal、spt20 是构成 saga 复合物的结构核心，共同维持 saga 复合物的稳定。这些组分大都含有至少一个保守结构域，参与生物体转录调控。近年来，对 saga 复合物各亚基在基因转录调控及对细胞生长和个体发育影响进行了广泛的研究。已有研究报道，saga中结构调节基因 spt7 在酿酒酵母中的缺失会使菌体的生长延缓。saga 复合物在真核生物中高度保守，酿酒酵母中 saga 复合物各亚基的同源蛋白已在果蝇与人中得到鉴定。虽然 saga 复合物三维结构在酵母与人体细胞中高度相似，但并不意味着其功能相同，却有助于在高等真核生物中功能的研究。
[0004] 目前关于以spt7为核心组分的saga复合物的研究仅集中在酵母、果蝇、人、植物生物体内，而在除酵母之外的其他真菌中未有任何相关报道。本研究中选用柠檬酸发酵工业菌株黑曲霉aspergillus niger cgmcc 10142和代谢赭曲霉毒素黑曲霉aspergillus niger cgmcc 1062分别作为出发菌株，首次在丝状真菌中针对spt7的功能及应用展开基础研究。


技术实现要素：

[0005]
本发明是基于δspt7黑曲霉突变株呈现出了与原始菌株a. niger cgmcc 10142大相径庭的生长形态，菌丝聚缩，生长缓慢，胞外分泌柠檬酸受到抑制，因此黑曲霉中spt7在黑曲霉中发挥至关重要的作用。本研究在a. niger cgmcc 10142中过表达或敲除spt7基因，比较δspt7黑曲霉突变株、oe: spt7黑曲霉突变株和原始菌株之间生长情况、氧化胁
迫、耐高温及高渗等分析，并且研究过表达spt7对菌株产柠檬酸的影响。本发明的目的是确定spt7可应用于提高黑曲霉柠檬酸产量或作为降低代谢赭曲霉毒素的靶向位点。
[0006]
为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：一株过表达spt7基因，其特征是：spt7基因的核酸序列如seq id no .1所示，spt7基因相应的氨基酸序列如seq id no.2所示，spt7基因上游的核酸序列如seq id no .3所示，spt7基因下游的核酸序列如seq id no .4所示，所构载体的启动子pglaa的核酸序列如seq id no.5所示，筛选所用潮霉素抗性标记基因hyg的核酸序列如seq id no.6所示。
[0007]
本发明进一步公开了所述一株过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株，命名为：oe: spt7黑曲霉菌株，其特征是：该工程菌株成功过表达spt7基因。其中所述一株过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株的构建方法，其特征在于所选出发菌株为a. niger cgmcc 10142菌株，通过根瘤农杆菌介导的转化法将过表达spt7基因的质粒随机整合到黑曲霉基因组上进行表达。
[0008]
详细的构建方法包括：spt7基因过表达载体的构建，即p44
‑
pglaa
‑
spt7，spt7基因敲除载体的构建，即p44
‑
δspt7，分别将此表达载体借助农杆菌转化法转入黑曲霉种，筛选黑曲霉重组菌株的方法；其中所述的重组黑曲霉菌的工程构建方法包括如下步骤：(a)pglaa、spt7目的基因、hyg基因、spt7基因上游序列和下游序列的扩增；(b) 分别将pglaa和spt7目的基因的片段及hyg基因、spt7基因上游序列和下游序列通过over
‑
lappcr进行融合，分别获得融合片段pglaa
‑
spt7和δspt7
‑
hgy；(c)对pcam
‑
bia
‑
1300质粒进行ecor i和pst i双酶切线性化处理；(d)利用重组酶分别将(b)中片段与（c）中线性化质粒进行连接，构建重组质粒poe:spt7和pδspt7；(e) 通过农杆菌转化法将（d）中的两个重组质粒转化黑曲霉，筛选目的基因整合到基因组的黑曲霉工程菌株和目的基因被敲除的工程菌株。
[0009]
本发明更进一步公开了所述一株过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株在提高重组黑曲霉菌株高产柠檬酸产量方面的应用。特别是过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株在提高菌株抗氧化胁迫及耐高渗方面的应用；所述的抗氧化胁迫及耐高渗指的是菌株可以在高浓度h2o2、nacl及葡萄糖条件下生长。实验结果显示：过表达spt7基因的黑曲霉工程菌株柠檬酸的产量提高了30%，在30mm h2o2、42℃、10% nacl和20%葡萄糖条件下可以正常生长。
[0010]
atgtcgctcggacaccaccacgcctggctccccccaggtcatctgcgcccgccggatgatttccatgatgcgcggtctgtcaatggctatcccaaatctttttccggttcgcgaaccccccagatgcgcgcttcggccgacgccgacgggtctcacgcgggcggtctgatatcagatgccgatattgcaggcgacgaggacccgcgcatcgccatgttccgggatctgtacaaacgcagtgaggcgcaaataaattccctctttgccaaccagaaagctgccgaggatgcccgccctgccatcgactccgacgagtcccaagccgagagccaacgcgccgacgaacccgctccgcccccggcgccccccaagaagcccgccaggaagttagatgacgatgactacgatgagtatgacgacgaagatgacgctgaggataccgaagccacatctcctcccaagcccaaatctctcgctgcgtctcaactacctagtagtttcccatcgcccagccgaccgcccagcggctccgtgtcggtcgggcccgatgcgcagaaggagaccaagaaagagacattggaggatatccgcaagaagctagaggaagataagaaggcgactgaggaagctgccagaagaagctttcacacactcttttatactttagagaatgatagagatgccatgctggaccagcagcgcctagaagagtcggagcgacaggtggaagcggaaatgtcaggccaggcgaacgccggcaacaatgcgaatccaacctccaatggatatgggtcgctgagtagcgcgaacctgggcgcctcgagcctgaccctcaagaa
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[0011]
（2） 本发明所述黑曲霉菌株，其特征在于：该工程菌株成功过表达或敲除spt7基因。
[0012]
（3）本发明（2）所述的工程菌株，其特征是：spt7基因的核酸序列如seq id no .1所示，spt7基因相应的氨基酸序列如seq id no.2所示，spt7基因上游的核酸序列如seq id no .3所示，spt7基因下游的核酸序列如seq id no .4所示，所构载体的启动子pglaa的核酸序列如seq id no.5所示，筛选所用潮霉素抗性标记基因hyg的核酸序列如seq id no.6所示。所选出发菌株为a. niger cgmcc 10142菌株，通过根瘤农杆菌介导的转化法将过表达spt7基因的质粒随机整合到黑曲霉基因组上进行表达。
[0013]
（4） 本发明所述的过表达spt7基因黑曲霉工程菌株的构建方法，其特征是包括：spt7基因过表达载体的构建，即p44
‑
pglaa
‑
spt7，spt7基因敲除载体的构建，即p44
‑
δspt7，分别将此表达载体借助农杆菌转化法转入黑曲霉种，筛选黑曲霉重组菌株的方法。
[0014]
（5）重组黑曲霉菌的工程构建方法包括如下步骤：(a)pglaa、spt7目的基因、hyg基因、spt7基因上游序列和下游序列的扩增；(b) 分别将pglaa和spt7目的基因的片段及hyg基因、spt7基因上游序列和下游序列通过over
‑
lappcr进行融合，分别获得融合片段pglaa
‑
spt7和δspt7
‑
hgy；(c)对pcam
‑
bia
‑
1300质粒进行ecor i和pst i双酶切线性化处理；(d) 利用重组酶分别将(b)中片段与（c）中线性化质粒进行连接，构建重组质粒poe:spt7和pδspt7；(e) 通过农杆菌转化法将（d）中的两个重组质粒转化黑曲霉，筛选目的基因整合到基因组的黑曲霉工程菌株和目的基因被敲除的工程菌株。
[0015]
（7）技术内容涉及过表达spt7的黑曲霉菌株，其特征：重组黑曲霉菌株柠檬酸的产量较原始菌株提高30 %及其在制备提高柠檬酸产量减少杂酸生成方面的应用。
[0016]
本发明主要考察了能否在柠檬酸高产黑曲霉工业菌株中高效过表达内源spt7基因以及提高柠檬酸产量，重点是解决目前提高柠檬酸产量的方法无效性的问题，发明的难点在于黑曲霉工业菌株遗传操作较模式菌株困难，本发明的创新点在于在黑曲霉工业菌株中通过探索转录激活因子spt7未知的功能及过表达从而提高柠檬酸产量方面的应用。
[0017]
本发明试验效果如下：(1)本发明构建的敲除spt7基因的黑曲霉菌株，与原始菌株相比其菌丝成聚缩状态，生长缓慢，且产柠檬酸受到抑制。
[0018]
(2)本发明构建的过表达spt7基因的黑曲霉菌株与原始菌株相比，在30mm h2o2、42℃、10% nacl和20%葡萄糖条件下可以正常生长。
[0019]
(3)本发明构建的过表达spt7基因的黑曲霉菌株与原始菌株相比，其柠檬酸的产量提高了30%。
[0020]
(4)附图说明图1为phs、pcs质粒图谱；其中a为用于敲除spt7基因的质粒phs，b为过表达spt7基因的质粒pcs；图2为 原始菌株与δspt7、oe:spt7菌株的菌落形态；图3为 氧化胁迫对oe:spt7菌株和a. niger 10142生长情况分析；图4为 高温、高渗条件对oe:spt7
‑
35菌株和a. niger 10142生长情况；图5为 dct基因过表达质粒构建。
具体实施方式
[0021]
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。本发明所用原料及试剂均有市售。a. niger cgmcc 10142菌株在国家保藏中心有保藏。
[0022]
实施例11.主要试剂本实验用rtaq酶、primestar高保真酶、限制性内切酶bamhi、psti、xbai、ecori、hindⅲ和kpni、t4连接酶、rna酶及所用dl10000 dna marker、dl5000 dna marker均购于takara公司；clonexpress multis one step cloning kit、2
×
rapid taq master mix购于南京诺唯赞生物科技有限公司;本实验所用marker iii，质粒小提试剂盒和普通琼脂糖凝胶dna回收试剂盒购于天根生化科技有限公司；高效感受态细胞制备试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司。本论文所有合成序列及引物由金唯智生物科技有限公司合成，其中正向引物为f，反向引物为r，实验所用到的引物见表1
‑
2：表1 本实验中用到的菌株和质粒 表2 本实验中用到引物
2.过表达oe: spt7和敲除δspt7载体的构建（1）目的片段的扩增pcs质粒构建过程相关目的片段的扩增，具有步骤：以a. niger 10142基因组dna为模板，分别通过引物spt7
‑
f和spt7
‑
r(含终止子）、引物pgla
‑
f和pgla
‑
r扩增片段片段spt7（seq id no .1）和pgla（seq id no.5）；将片段pgla和片段spt7通过over
‑
lap pcr的方法融合成一个片段pgla
‑
spt7。
[0023]
phs质粒构建过程相关目的片段的扩增，具有步骤：以a. niger 10142基因组dna为模板，通过上游引物为spt7
‑
f
‑
l
‑
kpn i和下游引物为spt7
‑
r
‑
l
‑
bamh i扩增spt7同源左臂片段l
‑
spt7（seq id no .3），通过上游引物hyg
‑
f和下游引物hyg
‑
r扩增潮霉素片段hyg（seq id no .6），通过上游引物spt7
‑
f
‑
r
‑
pst i和下游引物为spt7
‑
r
‑
r
‑
hind iii扩增spt7同源右臂片段r
‑
spt7（seq id no .4）；将片段l
‑
spt7、片段hyg和片段r
‑
spt7通过over
‑
lap pcr的方法融合成片段l
‑
spt7
‑
hyg
‑
r
‑
spt7。
[0024]
（2）质粒和相关片段的线性化分别将p44质粒和片段pgla
‑
spt7选用bamh i进行单酶切线性化；分别将phb质粒和片段l
‑
spt7
‑
hyg
‑
r
‑
spt7进行hindiii、psti双酶切线性化。
[0025]
（3）胶回收将上述(2)中的酶切产物进行琼脂糖 dna 凝胶（1 %tae缓冲液）电泳检测，并将目的片段进行切胶回收。
[0026]
（4）重组质粒的构建将上述（3）中回收的片段l
‑
spt7
‑
hyg
‑
r
‑
spt7及线性化的phb质粒通过t4 dna ligase进行连接，将连接产物转化至e. coli dh5α，挑取阳性转化子以spt7
‑
f
‑
det、spt7
‑
r
‑
det引物进行pcr验证，成功构建质粒phs，质粒图谱如图1a所示。
[0027]
将上述（3）中回收的片段pgla
‑
spt7及线性化的p44质粒通过t4 dna ligase进行连接，将连接产物转化至e. coli dh5α，挑取阳性转化子选用引物1
‑
yz
‑
ku70ll
‑
f，1
‑
yz
‑
spt7
‑
5r进行pcr验证，扩增片段长度约为1000bp；选用引物1
‑
yz
‑
spt7
‑
3r，1
‑
yz
‑
ku70rr
‑
r扩增片段长度约为1000bp，成功构建质粒pcs，质粒图谱如图1b所示。
[0028]
3.根瘤农杆菌介导转化黑曲霉（1）黑曲霉新鲜孢子的准备将黑曲霉cgmcc no .10142孢子转接到cm斜面上，在37℃下培养5
‑
7天，选用0.9%无菌生理盐水洗斜面后，经两层滤布过滤得到新鲜的孢子悬液。
[0029]
（2） 重组质粒转化农杆菌及验证将构建的pcs，phs质粒电转化入a. tumefaciens agl1中，涂布到含有kana的cm培养基上，挑取阳性转化子进行pcr验证。
[0030]
（3） 根癌农杆菌侵染黑曲霉将250 μl 诱导后的 od600 为0.8的农杆菌细胞和 250 μl 浓度为 1
×
107/ml 的黑曲霉孢子悬液，以 1：1 的比例混合，置于24 ℃避光培养2d。
[0031]
（4）阳性转化子的筛选用无菌镊子将附着菌体的微孔滤膜转移到无菌平板中，加入3ml生理盐水，用涂布器缓慢摩擦微孔滤膜，将菌体洗涤下来；将菌液转移至含有100 μg/ml氨苄霉素、 100 μg/ml链霉素、200 μm头孢噻肟钠、200 μg/ml潮霉素b的cm平板上；将平板置于35℃下，培养 4 d，直到菌落出现；挑取阳性转化子进行提基因组验证。
[0032]
实施例21.δspt7黑曲霉菌株的菌落生长形态较原始菌株相比，δspt7菌株菌体生长缓慢，菌丝松散且受到严重影响，生长前期有短小的气生菌丝生成，但生长至后期，菌丝严重聚缩成团，菌丝短小，并且最为明显的特征是菌体不产分生孢子，以菌丝繁殖，菌落呈脐状，表面形态不规则，如图2所示。
[0033]
2.oe: spt7黑曲霉菌株抗氧化胁迫、耐高温及高渗条件分析（1）oe: spt7黑曲霉菌株抗氧化胁迫分析将spt7过表达菌株分别点中在含有20mm h2o2的cm培养基上，37℃培养72h，进行两株菌的形态观察，结果如图3所示，与对照组a. niger 10142相比较，oe:spt7
‑
35，39，36菌株均可以在20 mm h2o2条件下生长，说明了过表达spt7可以提高菌株的抗氧化胁迫。
[0034]
（2）oe: spt7黑曲霉菌株耐高温及高渗条件分析将spt7过表达菌株点中在cm培养基上，42℃培养72h，进行两株菌的形态观察；将spt7过表达菌株分别点中在含有10% nacl和20%葡萄糖的cm培养基上，37℃培养72h，进行
两株菌的形态观察，结果如图4所示，对照组a. niger 10142能在20%葡萄糖条件下生长，但42℃和10%nacl条件下则无法生长，而oe:spt7
‑
35菌株则可以，说明了过表达spt7可以提高菌株的高温、高盐耐受性。
[0035]
3.oe: spt7黑曲霉菌株摇瓶发酵（1）孢悬的制备：培养斜面5
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7天，用0.9%无菌生理盐水洗斜面，血球计数板计数，制备孢子浓度为107/ml的孢子悬液。
[0036]
（2）发酵培养基：配置含糖量16%的玉米液化液50ml置于500ml三角瓶中。
[0037]
（3）发酵条件：转速290rpm,发酵温度35℃，发酵天数72h。
[0038]
发酵结果如图5所示，oe:spt7
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35菌株在各个时间段柠檬酸的产量相对于对照组都明显提高，在72h时oe:spt7
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35菌株产酸量已达到了34.41g/l，较对照组提高了39.54%，说明了过表达spt7可以提高菌株的柠檬酸产量。