适用于沙雷氏菌基因改造的CRISPR-Cas9双载体系统的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种适用于沙雷氏菌基因改造的crispr-cas9双载体系统。

背景技术：

沙雷氏菌是一种具有非常广泛宿主的条件致病菌，能够分泌一系列毒力因子损坏人体细胞和组织。菌体泳动能力和溶血性能是病原菌的主要毒力因子。沙雷氏菌次级代谢产物中的表面活性剂会降低表面张力，从而促进菌体的泳动；其所产生的表面活性剂类物质serrawettinw1和serrawettinw2能够作为溶血素使细胞溶解。因此，沙雷氏菌中表面活性剂的生物合成会直接影响病原菌的致病性。同时，沙雷氏菌所产生的表面活性剂类物质具有全新作用机制以及较好的生物活性，高产菌株的筛选和改造研究也一直是国内外生产研究的热点，但其产量一直受到菌种以及活性物质产生机理等限制。因此对表面活性剂生物合成调控机制进行研究，可以更好的揭示沙雷氏菌株次级代谢产物产生的机制，从而为高产菌株的筛选和改造提供有力的理论支持。

沙雷氏菌中表面活性剂的产生与菌株生长的阶段以及温度具有很强的相关性，这种温度敏感型性状表明，表面活性剂的产生与灵菌红素的产生处于共同的调控系统中。目前，对表面活性剂和灵菌红素共调控机制的研究主要集中在对serrawettinw1和灵菌红素的共调控机制研究中，而对serrawettinw2(或者serrawettinw3)和灵菌红素共调控机制方面的研究尚属空白。

基因编辑技术可以精确的定位到基因组的某一位点上，剪断靶标dna片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变，又修改并编辑了原有的基因组，真正实现了编辑基因。在沙雷氏菌中常用的基因编辑技术有同源重组技术，转座子突变技术和crispr-cas基因编辑技术。但是，同源重组技术重复性差，而且由于筛选标记的局限性很难进行多基因编辑。另外一类是在单交换的基础上再一次使用反向筛选标记消除自杀载体，加大了工作量且耗时；转座子突变技术的局限性在于工作量巨大，筛选得到合适的敲除突变株需耗费大量时间。

根据参与的cas蛋白结构和种类的多样性，可将crispr-cas分为6种类型，包括i型、ii型、iii型、iv型、v型和vi型。其中ii型crispr-cas9系统中只需要一个cas9蛋白的参与，这为其能够广泛应用提供了便利条件。

crispr-cas9技术的原理是crrna(crisprrna)通过碱基配对与tracrrna(trans-activatingrna)结合形成tracrrna/crrna复合物，此复合物引导核酸内切酶cas9蛋白在与crrna配对的序列靶位点剪切双链dna，从而实现对靶向基因的敲除、插入或点突变等修饰。通过人工设计crrna和tracrrna这两种rna，可以改造形成具有引导作用的sgrna(single-guiderna)，以引导cas9对dna的定点切割。

目前只在沙雷氏菌serratiasp.atcc39006中报道含有i型crispr-cas系统，而在其他沙雷氏菌中应用crispr-cas9系统进行基因编辑没有报道。

技术实现要素：

针对上述现有技术，本发明构建了一套适用于沙雷氏菌基因改造的crispr-cas9双载体系统，并利用该载体系统对沙雷氏菌进行了基因luxs的敲除与回补实验，确定了基因luxs对灵菌红素和serrawettinw2合成的正调控作用。基因luxs通过影响ai-2信号分子的合成，进而影响菌株yd25的群体感应系统，从而影响了灵菌红素和serrawettinw2的同时合成。

本发明的第一方面，提供一种适用于沙雷氏菌基因改造的crispr-cas9双载体系统，包括：载体pcas-p15a-sacbδλ-red和载体ptargetf-gm；

所述载体pcas-p15a-sacbδλ-red由如下方法构建而成：

利用引物pcas-overlap-f和pcas-overlap-r进行pcr扩增，得到pcas片段；利用引物p15a-overlap-f和p15a-overlap-r进行pcr扩增，得到p15a片段；利用引物sacb-overlap-f和sacb-overlap-r进行pcr扩增，得到sacb片段；

将pcas片段、p15a片段和sacb片段采用in-fusion连接体系进行连接，构建得到载体pcas-p15a-sacb；

以构建好的载体pcas-p15a-sacb为模板，使用引物δλ-red-f、δλ-red-r进行pcr成环反应，将反应液用q.cutdpni酶切消化去除模板pcas-p15a-sacb，再经菌液pcr筛选及酶切验证，即构建得到载体pcas-p15a-sacbδλ-red；

所述载体ptargetf-gm由如下方法构建而成：

利用引物gm-f和gm-r进行pcr扩增，得到gm片段；使用限制性内切酶mlui和xhoi对gm片段进行双酶切，得到插入片段；

将载体ptargetf用限制性内切酶mlui和xhoi双酶切后，与插入片段进行连接，连接后的产物再经转化、菌液pcr筛选及验证，及构建得到载体ptargetf-gm。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，所述引物pcas-overlap-f和pcas-overlap-r的序列分别如seqidno.1和seqidno.2所示；pcr扩增的条件为：98℃10s，55℃15s，72℃60s，共35个循环。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，所述引物p15a-overlap-f和p15a-overlap-r的序列分别如seqidno.3和seqidno.4所示；pcr扩增的条件为：98℃10s，55℃15s，72℃10s，共35个循环。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，所述引物sacb-overlap-f和sacb-overlap-r的序列分别如seqidno.5和seqidno.6所示；pcr扩增的条件为：98℃10s，55℃15s，72℃10s，共35个循环。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，所述in-fusion连接体系包括：

ddh2o、5×in-fusionhdenzymepreimx、pcas片段、p15a片段和sacb片段。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，采用in-fusion连接体系进行连接的条件为：连接温度50℃、连接时间15min。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，所述引物δλ-red-f、δλ-red-r的序列分别如seqidno.7和seqidno.8所示；所述pcr成环反应的条件为：

98℃10s，55℃15s，72℃60s，共35个循环。

优选的，载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建过程中，q.cutdpni酶切的体系包括：

10×q.cutbuffer5μl、q.cutdpni1μl和反应液44μl；酶切温度为37℃，酶切时间为1h。

优选的，载体ptargetf-gm的构建过程中，所述引物gm-f和gm-r的序列分别如seqidno.9和seqidno.10所示；pcr扩增的条件为：98℃10s，55℃15s，72℃5s，共35个循环。

本发明的第二方面，提供上述crispr-cas9双载体系统在如下1)-3)任一项所述中的应用：

1)沙雷氏菌基因改造；

2)沙雷氏菌基因功能的验证；

3)沙雷氏菌株次级代谢产物产生的机制研究。

本发明的有益效果：

(1)本发明所构建的crispr-cas9双载体系统中，对于载体pcas-p15a-sacbδλ-red，本发明将pcas原有的复制子psc101ori替换为p15aori；在替换复制子的同时添加了反向筛选标记sacb基因，应用sacb基因对蔗糖敏感，含有sacb基因的质粒不能在蔗糖平板上生长这一特性，保证后续消除质粒实验的正常进行；应用pcr成环的原理，成功除去pcas-p15a-sacb中λ-red部分，得到了载体pcas-p15a-sacbδλ-red。本发明构建的载体pcas-p15a-sacbδλ-red非常容易转入至沙雷氏菌中，有效提高了转入的成功率。对于载体ptargetf-gm，本发明将质粒ptargetf中的抗性基因壮观霉素sp替换成了庆大霉素gm，从而具备了对沙雷氏菌菌株的筛选功能。

(2)本发明的crispr-cas9双载体系统弥补了沙雷氏菌基因编辑系统方面的局限性，为沙雷氏菌基因功能的验证和沙雷氏菌株次级代谢产物产生机制的研究提供了平台。

附图说明

图1：质粒pcas、pstv29、psr47s和片段pcas、p15a、sacb的电泳检测；a图中，m1:dl15000marker；1:pcas质粒；2:pstv29质粒；3:psr47sc质粒；b图中，m2:dl5000marker；1:片段pcas；2:片段p15a；3:片段sacb。

图2：菌液pcr的电泳检测；m:dl5000；1-10:p15afragment；11-20:sacbfragment。

图3：pcas-p15a-sacb质粒图谱。

图4：pcas-p15a-sacbδλ-redpcr产物的电泳图；m:dl15000marker；1:pcas-p15a-sacbδλ-red的pcr产物。

图5：菌液pcr和酶切产物电泳检测；左图中，m1:dl5000marker；1、2、3、4、5:菌液pcr电泳图；右图中，m2:dl15000marker；6、7、8、9、10:酶切产物电泳图。

图6：pcas-p15a-sacbδλ-red质粒图谱。

图7：质粒ptargetf、pbbr1mcs-5和片段gm的电泳检测；a图中，m:dl5000marker；1:ptargetf质粒；2:pbbr1mcs-5质粒；b图中，m:dl5000marker；1:片段gm。

图8：菌液pcr和载体ptargetf-gm的电泳检测；a图中，m:dl5000marker；1-5:gm片段；b图中，m:dl5000marker；1:ptargetf-gm载体。

图9：ptargetf-gm质粒图谱。

图10：片段luxs1、luxs2和luxs-overlap的电泳图；a图中，m:dl5000marker；1:片段luxs1；2:片段luxs2；b图中，m:dl5000marker；1:片段luxs-overlap。

图11：菌液pcr和载体ptargetf-gm-luxs的电泳检测；a图中，m:dl5000marker；1-3:luxs-grna片段；b图中，m:dl5000marker；1:ptargetf-gm-luxs载体。

图12：片段luxs1-luxs2的电泳检测；m:dl5000marker；1-8:luxs1-luxs2片段；9:阴性对照；10:阳性对照。

图13：yd25δluxs消除质粒ptargetf-gm-luxs在lb固体平板生长情况。

图14：yd25δluxs消除质粒pcas-p15a-sacbδλ-red在lb固体平板生长情况。

图15：菌液pcr和载体pstv29-pmb1的电泳检测；a图中，m:dl5000marker；1:阴性对照；2-5:pmb1片段；b图中，m:dl5000marker；1:pstv29-pmb1载体。

图16：菌液pcr和载体pstv29-pmb1-luxs的电泳检测；a图中，m:dl5000marker；1:阴性对照；2-7:luxs片段；b图中，m:dl5000marker；1:pstv29-pmb1-luxs载体。

图17：c-yd25δluxs回补株。

图18：菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中ai-2信号分子的检测。

图19：菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中丛动的检测。

图20：菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中泳动的检测。

图21：菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中灵菌红素的检测。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分所介绍的，沙雷氏菌是一种具有广泛宿主的条件致病性菌，能够引起一系列的医院中常见的感染症状。沙雷氏菌的主要次级代谢产物灵菌红素和表面活性剂类物质具有较好的生物活性，但由于其分子结构相对复杂，采用化学全合成手段很难实现产物的大量制备。

发明人在前期的研究中分离纯化得到一株可以同时产生serrawettinw2和灵菌红素的菌株s.marcescensyd25(suc,liuy,suny,etal.completegenomesequenceofserratiasp.yd25(kctc42987)presentingstrongantagonisticactivitiestovariouspathogenicfungiandbacteria[j].journalofbiotechnology,2017,245:9-13.)，因此以菌株s.surfactantfaciensyd25为研究对象，对其次级代谢产物中serrawettinw2与灵菌红素的生物合成共调控机制进行研究，不仅可以更好的补充与完善沙雷氏菌中表面活性剂与灵菌红素的共调控机制，为下游代谢工程改造提供新的靶点；还能进一步为沙雷氏菌条件致病性找到理论解释。

crispr-cas9系统是一种热门的基因组定点编辑工具，具有构建简单、适用范围广等优点，并且该技术已成功在细菌的模式菌株大肠杆菌中实现了基因组的定点编辑。但目前还未见有利用crispr-cas9系统对沙雷氏菌进行基因编辑的报道。

基于此，本发明的目的是提供一种适用于沙雷氏菌基因改造的crispr-cas9双载体系统。

本发明首先尝试使用大肠杆菌的crispr-cas9两质粒pcas和ptargetf系统，但是发现，质粒pcas的复制子为psc101ori，多次尝试电转入沙雷氏菌yd25中，但都未成功。因此，本发明考虑将复制子替换成p15aori。psc101ori为温敏型复制子，在30℃质粒可以正常复制，而在37℃或高于37℃质粒会逐渐消失，原系统应用这一特征保证了后续消除质粒pcas的正常进行。替换为p15aori的质粒不具有这一特征，因此在替换复制子的同时添加了反向筛选标记sacb基因，应用sacb基因对蔗糖敏感，含有sacb基因的质粒不能在蔗糖平板上生长这一特性，保证后续消除质粒实验的正常进行。应用in-fusion的克隆方法将片段pcas、p15a(片段序列如seqidno.11所示)、sacb(片段序列如seqidno.12所示)进行连接，得到改造后的载体pcas-p15a-sacb，大小为14456bp。但是，改造后的载体pcas-p15a-sacb仍然无法成功转入至沙雷氏菌yd25中。本发明基于细菌中本身含有同源修复系统的考虑，尝试将λ-red系统去除，以减小质粒长度，以便能有利于转入菌株yd25中。本发明应用pcr成环的原理，成功去除了质粒pcas-p15a-sacb中λ-red部分，得到了质粒pcas-p15a-sacbδλ-red，大小为11093bp，结果发现，pcas-p15a-sacbδλ-red非常容易能够电转入菌株yd25中，转化成功率在85％以上，取得了预料不到的效果。另外，由于筛选标记壮观霉素sp对菌株yd25没有筛选功能，因此本发明将质粒ptargetf中的抗性基因壮观霉素sp替换成了庆大霉素gm，获得载体ptargetf-gm。

综上，本发明成功构建了适用于沙雷氏菌yd25的crispr-cas9pcas-p15a-sacbδλ-red和ptargetf-gm双载体系统，为菌株yd25的定点基因敲除提供了技术平台。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：菌株serratiasp.yd25的保藏号为cctccab2015384；质粒pcas、质粒ptargetf都购自addgene官网，项目号分别为62225，62226；质粒pstv29购自takara公司；质粒psr47s为陕西师范大学提供；pmbbr1mcs-5购自武汉淼灵生物科技有限公司。mlui、xhoi、q.cutdpni、in-fusionhdcloningplus638910clotech等均购自takara。

实施例1：载体pcas-p15a-sacbδλ-red的构建

1.试验方法：

1.1片段pcas、p15a和sacb的获得：

以质粒pcas为模板，使用引物pcas-overlap-f、pcas-overlap-r，使用takara高保真酶primestarmaxdnapolymeraser045a进行pcr扩增pcas片段，记为pcas。pcas片段的pcr反应体系(50μl)包括：2×primestarmaxpremix25μl、template(pcas)(100ng/ul)1μl、pcas-overlap-f(10μm)1μl、pcas-overlap-r(10μm)1μl、ddh2o22μl。pcas片段的pcr反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃60s，共35个循环。

以质粒pstv29为模板，使用引物p15a-overlap-f、p15a-overlap-r，进行pcr扩增p15a片段，记为p15a。p15a片段的pcr反应体系(50μl)包括：2×primestarmaxpremix25μl、template(pstv29)(100ng/ul)1μl、p15a-overlap-f(10μm)1μl、p15a-overlap-r(10μm)1μl、ddh2o22μl。p15a片段的pcr反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃10s，共35个循环。

以质粒psr47s为模板，使用引物sacb-overlap-f、sacb-overlap-r进行pcr扩增sacb片段，记为sacb。sacb片段的pcr反应体系(50μl)包括：2×primestarmaxpremix25μl、template(psr47s)(100ng/ul)1μl、sacb-overlap-f(10μm)1μl、sacb-overlap-r(10μm)1μl、ddh2o22μl。sacb片段的pcr反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃10s，共35个循环。

1.2片段pcas、p15a和sacb的胶回收：

将500μl的pcas片段在0.7％的琼脂糖凝胶上90v电泳2h，同时，分别将300μl的p15a、sacb片段在1％的琼脂糖凝胶上90v电泳2h，在245nm的紫外光下，分别将目的条带切割下来，装入已称重好的1.5mlep管中，严格按照takaraminibestagarosegeldnaextractionkitver.4.09762试剂盒的操作步骤进行胶回收。分别对回收的片段pcas、p15a、sacb进行定量，置于-20℃冰箱备用。

1.3片段pcas、p15a和sacb的in-fusion连接与转化：

片段p15a、sacb、pcas的摩尔比为2:2:1，通过计算，在10μl的体系里片段pcas的加入量为145ng，p15a的加入量为33ng，sacb的加入量为48.6ng。10μl的in-fusion连接体系包括：ddh2o3.1μl、5×in-fusionhdenzymepreimx2μl、pcas1μl、p15a1.5μl、sacb2.4μl。连接温度为50℃，连接时间为15min。

从-80℃冰箱中取出一支大肠杆菌dh5α感受态细胞迅速置于冰上，在超净工作台中向100ul感受态细胞中加入10ul连接产物，轻轻混匀后，迅速置于冰上冰浴30min，在42℃恒温水浴锅中热激90s，立即放置冰上2-3min，加入900ulsoc培养基，置于37℃恒温摇床200rpm，孵育1h后，6000rpm离心3min，弃上清800ul，将剩余培养基与菌体重悬混匀，全部涂布至含有kan50ug/ml的lb固体平板上，置于37℃恒温培养箱过夜培养12-16h。

1.4菌液pcr筛选与菌液测序：

从上述平板上随机挑取10个单克隆，加入3ml含有kan50ug/ml液体lb培养基的摇菌管中，置于37℃恒温摇床220rpm，培养8h后，分别取1ul菌液作为模板，并分别使用引物p15a-overlap-f、p15a-overlap-r，sacb-overlap-f、sacb-overlap-r进行菌液pcr。菌液pcr的反应体系均为10ul，包括：template(菌液)1ul、正反向引物各0.4ul、ddh2o8.2ul。反应程序均为98℃10s,55℃15s,72℃10s，共35个循环。菌液pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段p15a和sacb。取阳性克隆菌液与30％甘油1:1混合保菌置于-20℃冰箱保存，并取1支保好的菌液送至西安擎科泽西生物有限责任公司进行测序。

1.5新建载体pcas-p15a-sacb的制备：

取一支菌液pcr验证正确且测序正确的阳性菌液，置于冰上融化后，加入到含有50ml浓度为kan50ug/ml的lb液体培养基的锥形瓶中，置于37℃恒温摇床220rpm过夜摇菌。次日，严格按照天根生物有限责任公司质粒dna小量中提试剂盒提取质粒后，使用thermond2000微量分光光度计检测质粒的纯度，置于-20℃冰箱保存备用。

1.6pcas-p15a-sacb载体λ-red的改造：

以构建好的载体pcas-p15a-sacb为模板，使用引物δλ-red-f、r进行pcr成环反应，记为pcas-p15a-sacbδλ-red。pcr反应体系(50μl)包括：2×primestarmaxpremix25μl、template(pcas-p15a-sacb)(100ng/ul)1μl、δλ-red-f(10um)1μl、δλ-red-r(10um)1μl、ddh2o22μl。pcr反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃60s，共35个循环。

1.7载体pcas-p15a-sacbδλ-red的纯化、转化：

pcr反应结束后，取5ulpcr反应液通过0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测成环反应是否成功。剩余的44ul反应液用q.cutdpni酶切1h消化去除模板pcas-p15a-sacb后，严格按照天根dna回收纯化试剂盒的操作步骤进行酶切产物纯化。酶切体系如下：

取10ul纯化后的dna，按照1.3的操作步骤进行转化，涂布在含有kan50ug/ml的lb固体平板上，置于37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。

1.8菌液pcr筛选及酶切验证：

从上述1.7的平板上随机挑取5个单克隆置于含有3ml浓度为kan50ug/ml的lb液体培养基的摇菌管中，置于37℃恒温摇床220rpm培养8h后，各取500ul菌液与30％甘油1:1混合均匀，置于-80℃冰箱保存。从剩余菌液中各取1ul作为菌液pcr的模板，使用引物sacb-overlap-f、sacb-overlap-r进行菌液pcr，菌液pcr的反应体系为10ul，包括：template(菌液)1ul、正反向引物各0.4ul、ddh2o8.2ul。反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃10s，共35个循环。菌液pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段sacb。剩余菌液严格按照西安擎科泽西生物有限公司质粒dna小量小提试剂盒的操作步骤提取质粒。质粒提取结束后，使用thermond2000微量分光光度计检测质粒的纯度，置于-20℃冰箱保存备用。取适量质粒，用限制性内切酶q.cutmlui对质粒进行酶切鉴定。酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测质粒正确与否。

1.9新建载体pcas-p15a-sacbδλ-red的制备、浓缩：

新建载体pcas-p15a-sacbδλ-red的制备步骤同1.5。

将制备的质粒pcas-p15a-sacbδλ-red置于冰上融化后，加入1/10体积的3m醋酸钠溶液，充分混匀后，加入1ml预冷的无水乙醇，放置于-80℃冰箱静置30min。取出后，于4℃冷冻离心机12000rpm离心15min。弃上清，加入300ul预冷的75％乙醇，于4℃冷冻离心机12000rpm离心15min，重复上述步骤一次。弃上清，室温静置20min挥发乙醇，加入20ulddh2o溶解质粒dna。将浓缩后的质粒dna使用thermond2000微量分光光度计检测质粒的纯度，置于-20℃冰箱保存备用。

2.试验结果：

2.1pcas-p15a-sacb载体的获得：

片段pcas为载体pcas中除去psc101ori和rep101的部分，因此获得的pcas片段大小为11324bp。电泳结果显示，片段pcas条带单一且正确，可用于胶回收(图1)。

载体pstv29上的p15a片段大小为545bp。pcr扩增时，上下游分别延伸了495bp、216bp，并且在引物的5’端添加了10bp与sacb同源的序列，在引物的3’端添加了20bp与片段pcas同源的序列，因此获得的含有p15a片段大小为1294bp。电泳结果显示，片段p15a下有一条大约300bp的非特异性条带，但与p15a主条带1294bp相差很大，因此可用于胶回收(图1)。

载体psr47s上的sacb片段大小为1868bp。pcr扩增时，在引物的5’端添加了10bp与片段p15a3’端同源的序列，在引物的3’端添加了20bp与片段pcas同源的序列，因此获得的含有sacb片段大小为1898bp。电泳结果显示，片段sacb下有一条大约300bp的非特异性条带，但与sacb主条带1898bp相差很大，因此可用于胶回收(图1)。

随机挑取10个单克隆进行菌液pcr，同时pcr检测片段p15a和片段sacb，电泳结果如图2所示，泳道3-6和泳道13-16的单克隆是正确的。选择泳道3(13)的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中的seqidno.11和seqidno.12。blast比对后，结果显示片段p15a、片段sacb无碱基突变和移码突变，表明载体构建成功，命名为pcas-p15a-sacb。使用软件snapgene2.3.2对新建载体pcas-p15a-sacb作图，结果见图3。

2.2pcas-p15a-sacbδλ-red载体的获得：

载体pcas-p15a-sacbδλ-red为载体pcas-p15a-sacb除去λ-red重组系统的部分，因此pcr成环反应获得的pcas-p15a-sacbδλ-red大小为11093bp。电泳结果如图4所示，pcr成环反应中pcas-p15a-sacbδλ-red大小正确且条带单一，可以直接进行后续的酶切纯化步骤。

选取挑取5个单克隆菌液进行菌液pcr检测片段sacb，片段sacb的大小为1898bp。同时将剩余菌液提取质粒后，分别标记为pcas-p15a-sacbδλ-red-1、pcas-p15a-sacbδλ-red-2、pcas-p15a-sacbδλ-red-3、pcas-p15a-sacbδλ-red-4和pcas-p15a-sacbδλ-red-5，使用thermond2000微量分光光度计对提取的质粒进行定量检测，浓度分别为38ng/ul、40ng/ul、30ng/ul、39ng/ul和34ng/ul。使用限制性内切酶q.cutmlui酶切，条带大小应该为2825bp和8268bp，酶切结束后进行琼脂糖凝胶电泳，结果如图5所示。可以看出，标记为pcas-p15a-sacbδλ-red-3和pcas-p15a-sacbδλ-red-5的菌液pcr和酶切结果均正确，表明载体构建成功，命名为pcas-p15a-sacbδλ-red。使用软件snapgene2.3.2对新建载体pcas-p15a-sacbδλ-red作图，结果见图6。

经定量检测，制备的载体pcas-p15a-sacbδλ-red浓度为52ng/ul，总体积为800ul。经浓缩后重新进行定量检测，载体pcas-p15a-sacbδλ-red浓度为842ng/ul，可以用于后续实验。

实施例2：载体ptargetf-gm的构建

1.试验方法：

1.1片段gm的获得：

以质粒pbbr1mcs-5为模板，使用引物gm-f、gm-f进行pcr扩增gm片段，记为gm。pcr反应体系(50μl)包括：2×primestarmaxpremix25μl、template(pbbr1mcs-5)(100ng/ul)1μl、gm-f(10μm)1μl、gm-f(10μm)1μl、ddh2o22μl。pcr反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃10s，共35个循环。

1.2片段gm的胶回收：方法步骤同实施例1中的1.2。

1.3片段gm的酶切及纯化：

依据回收片段gm的浓度，使用限制性内切酶mlui和xhoi对片段进行双酶切，酶切结束后，严格按照天根dna纯化回收试剂盒的操作步骤进行pcr产物纯化。纯化后的dna，使用thermond2000微量分光光度计进行定量检测，置于-20℃冰箱保存备用。

1.4载体ptargetf的酶切及胶回收：

质粒ptargetf用限制性内切酶mlui和xhoi双酶切，酶切结束后，将酶切后载体进行胶回收。胶回收纯化后，使用thermond2000微量分光光度计对酶切纯化后的载体ptargetf进行定量检测，置于-20℃冰箱保存备用。

1.5插入片段gm与ptargetf双酶切片段的连接、转化：

插入片段gm与ptargetf双酶切载体的摩尔比为5:1，通过计算，在10ul的体系里双酶切载体的加入量为143ng，pcr产物的加入量为330ng。连接后的产物进行转化，涂布在含有gm50ug/ml的lb固体平板上，置于37℃恒温培养箱倒置培养12-16h。

1.6菌液pcr筛选阳性克隆与菌液送样测序：

平板上随机挑取5个单克隆，置于含有3ml浓度为gm50ug/ml的液体lb培养基的摇菌管中，在37℃恒温摇床220rpm培养8h，各取500ul菌液置于含有500ul30％甘油的ep管中，充分混匀，置于-80℃冰箱保存。各取1ul菌液作为模板，使用引物gm-f、gm-r进行菌液pcr。菌液pcr的反应体系为10ul，包括：template(菌液)1ul、正反向引物各0.4ul、ddh2o8.2ul。反应程序为：98℃10s,55℃15s,72℃5s，共35个循环。菌液pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测目的片段gm，并取1支阳性克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限责任公司进行测序。

1.7新建载体ptargetf-gm的制备：方法步骤同实施例1中的1.5。

2.试验结果：

载体pbbr1mcs-5上gm片段的大小为534bp。pcr扩增时，在引物的5’和3’端分别引入了xhoi和mlui酶切位点以及相应的保护碱基，因此获得的gm片段大小为554bp。电泳结果显示，片段gm虽有非特异性条带，但很微弱，而主条带亮度较高，可用于胶回收纯化(图7)。

随机挑取5个单克隆进行菌液pcr检测片段gm，电泳结果如图8所示。电泳结果显示，5个单克隆全部正确，菌液pcr可以得到片段gm且大小正确，选择泳道1的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中seqidno.13。blast比对后，结果显示片段gm无碱基突变和移码突变，表明载体构建成功，命名为ptargetf-gm。使用软件snapgene2.3.2对新建载体ptargetf-gm作图，结果见图9。

经定量检测，载体ptargetf-gm的浓度为858ng/ul。通过琼脂糖凝胶电泳检测，载体ptargetf-gm的质量比较高，可以用于后续实验。

实施例3：载体pcas-p15a-sacbδλ-red转化沙雷氏菌yd25的考察

1.试验方法：

1.1沙雷氏菌yd25感受态细胞的制备：

取-80℃冰箱保存的沙雷氏菌yd25甘油菌置于冰上融化，蘸取少量菌液划线于lb固体平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养。16h后挑取单克隆接种于3ml的lb液体培养基中，置于30℃恒温摇床220rpm过夜培养。

次日，1％转接，取1ml培养好的yd25菌液加入到含100mllb液体培养基的锥形瓶中，30℃，220rpm，振荡培养至od600为0.4-0.6。将菌液转移至两个50ml的离心管中，置于冰上放置5min后，在4℃冷冻离心机中离心，2000g，15min，4℃。弃上清，分别向两个离心管中加入20ml预冷的超纯水重悬，沿着离心管的管壁，将移液管伸到管底，缓慢加入已量取好的10ml1.5％甘露醇/20％甘油溶液，在4℃冷冻离心机中离心，2000g，15min，4℃。用移液管将上清全部缓慢吸走，分别向两个50ml离心管中加入400ul甘露醇/甘油溶液轻轻重悬，取80ul感受态细胞直接用于电击转化，剩余感受态细胞分装，置于-80℃备用。

1.2新建载体pcas-p15a-sacbδλ-red转化：

向含有80ulyd25感受态细胞的ep管中加入1ul质粒pcas-p15a-sacbδλ-red，轻轻混匀，转移至预冷的1mm电击杯中，迅速置于电穿孔仪中进行电击，电击程序为1800v，10uf，200ω，电击时间持续大约5ms。取1mllb加入到电极杯中充分吹吸后，全部转移至灭过菌的1.5mlep管中，置于30℃培养箱中静置培养2h后，6000rpm离心3min，弃部分上清，剩余上清重悬，全部涂布至含kan150ug/ml的lb平板上，30℃过夜静置培养。

2.试验结果：

通过在浓度为kan150ug/ml的固体lb平板上筛选获得转入质粒的菌株yd25(pcas-p15a-sacbδλ-red)，转化率为85％以上。

实施例4：crispr-cas9敲除沙雷氏菌yd25基因luxs的研究

1.试验方法：

1.1luxs基因同源片段的获取：

以菌株yd25基因组为模板，分别使用引物luxs1-f、r和luxs2-f、r进行pcr扩增基因luxs上下游片段，分别记为luxs1、luxs2。

以胶回收后的片段luxs1和luxs2为模板，使用引物luxs1-f和luxs2-r进行pcr扩增基因luxs上下游片段，记为luxs-overlap。

1.2crispr/cas9敲除luxs基因载体的构建：

1.2.1敲除基因luxs的sgrna的筛选：

使用软件sgrnacas9_v3.0_gui对菌株yd25靶向luxs的sgrna进行分析，筛选去除有风险提示和错配位点的sgrna，将剩余结果与yd25基因组序列进行比对，选择比对结果只有一个序列的sgrna，即得靶向基因luxs的sgrna序列。

1.2.2片段luxs-grna的获得：

以质粒ptargetf-gm为模板，使用引物luxs-grna-f、r进行pcr扩增luxs-grna片段，记为luxs-grna。

1.2.3片段luxs-grna与ptargetf-gm双酶切载体的连接、转化：

将片段luxs-grna胶回收后进行spei和hindiii酶切及纯化，得到插入片段luxs-grna；将载体ptargetf-gm进行spei和hindiii酶切，得到ptargetf-gm双酶切载体。

插入片段luxs-grna与ptargetf-gm双酶切载体的摩尔比为10:1，通过计算，在10ul的体系里双酶切载体ptargetf-gm的加入量为129ng，插入片段luxs-grna的加入量为101ng。

1.2.4菌液pcr筛选阳性克隆与菌液送样测序：方法步骤同实施例2中的1.6。

1.2.5新建载体ptargetf-gm-luxs的制备：方法步骤同实施例1中的1.5。

1.3luxs基因敲除及敲除株筛选：

1.3.1yd25(pcas-p15a-sacbδλ-red)感受态细胞的制备：方法步骤同实施例3。

1.3.2新建载体ptargetf-gm-luxs和片段luxs-overlap的转化：

向含有80ulyd25(pcas-p15a-sacbδλ-red)感受态细胞的ep管中加入1ul质粒ptargetf-gm-luxs和4ul片段luxs-overlap，轻轻混匀，转移至预冷的1mm电击杯中，迅速置于电穿孔仪中进行电击，电击程序为1800v，10uf，200ω，电击时间持续大约5ms。取1mllb加入到电极杯中充分吹吸后，全部转移至灭过菌的1.5mlep管中，置于30℃培养箱中静置培养2h后，6000rpm离心3min，弃部分上清，剩余上清重悬，全部涂布至含浓度为kan150ug/ml和gm50ug/ml的lb平板上，30℃过夜静置培养。

1.3.3菌液pcr筛选阳性克隆与菌液送样测序：

将上述1.3.2中平板上长出的单克隆全部挑出，置于3ml含有浓度为kan150ug/ml和gm50ug/ml的lb液体培养基的摇菌管中，在30℃恒温摇床220rpm过夜培养。次日，分别取500ul菌液与500ul30％甘油充分混合，置于-80℃冰箱保存。从剩余菌液中分别取1ml，严格按照takara细菌基因组dna纯化试剂盒的操作步骤提取基因组yd25δluxs。以提取的基因组为模板，使用引物luxs1-f和luxs2-r进行pcr扩增luxs1-luxs2。pcr反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否成功敲除基因luxs，并取1支阳性克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限责任公司进行测序。

1.4pcas-p15a-sacbδλ-red、ptargetf-gm-luxs质粒的消除：

1.4.1菌株活化：

取-80℃冰箱保存的yd25δluxs甘油菌置于冰上融化，蘸取少量菌液划线于含有浓度为kan150ug/ml和gm50ug/ml的lb固体平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养16h。

1.4.2ptargetf-gm-luxs质粒的消除：

①从上述1.4.1的平板上挑取一个yd25δluxs敲除株单克隆，在含浓度为10mmiptg的lb液体培养基的摇菌管中振荡摇菌，30℃，220rpm，过夜摇菌后，划线于含有浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上于30℃静置培养24h；

②挑取73个左右单克隆分别依次划线在浓度为kan300ug/ml和gm150ug/ml、kan300ug/ml的lb固体平板上，于30℃静置培养12h后，进行二次传代；

③挑取在含浓度为kan300ug/ml和gm150ug/ml的lb固体平板上不能生长，在浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上可以生长的菌落再次划线于含浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养24h。

1.4.3pcas-p15a-sacbδλ-red质粒的消除：

①从上述1.4.2③平板上挑取一个单克隆置于含浓度为30％蔗糖lb液体培养基的摇菌管中振荡摇菌，30℃，220rpm，过夜摇菌后，划线于30％蔗糖lb固体平板上于30℃恒温培养箱静置培养24h；

②挑取42个左右单克隆分别依次划线在含浓度为kan300ug/ml、lb的固体平板上，于30℃恒温培养箱静置培养12h后，进行二次传代；

③挑取在含浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上不能生长，在lb固体平板正常生长的菌落再次划线于lb固体平板上，置于30℃恒温培养箱倒置培养24h。

上述方法中所用到的引物如下：

2.试验结果：

2.1luxs基因同源片段的获得：

基因luxs上游片段luxs1的大小为500bp。基因luxs下游片段luxs2的大小为500bp，pcr扩增时，在引物的5’端方向添加了20bp与片段luxs1下游引物同源的序列，因此获得的luxs2大小为520bp。电泳结果如图10，片段luxs1和片段luxs2虽有非特异性条带，但并不影响通过胶回收纯化片段luxs1和luxs2，可以进行后续实验步骤。

片段luxs-overlap的大小为1000bp，电泳结果如图10，片段luxs-overlap虽有非特异性条带，但主条带亮度较高，可以通过胶回收实验获得纯化的片段luxs-overlap，进行后续的实验步骤。

经检测，片段luxs-overlap的浓度为102ng/ul，可以用于后续的转化实验。

2.2crispr/cas9敲除luxs基因载体的构建：

应用软件sgrnacas9_v3.0_gui对基因luxs的sgrna进行分析，共得到如下所示的靶向基因luxs的sgrna：

筛选去掉含有错配位点的sgrna共得到5条可用的sgrna序列，最终选用luxs_s_21作为基因luxs的sgrna序列。

随机挑取3个单克隆进行菌液pcr检测片段luxs-grna，电泳结果如图11所示。3个单克隆全部正确，菌液pcr可以得到片段luxs-grna且大小正确，选择泳道1的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中seqidno.14。blast比对后，结果显示片段luxs-grna无碱基突变和移码突变，表明载体构建成功，命名为ptargetf-gm-luxs。

2.3luxs基因敲除株筛选：

涂布后过夜培养，共长出8个单克隆。挑取8个单克隆全部提取基因组后，以yd25基因组为阳性对照，使用引物luxs1-f和luxs2-r进行pcr检测是否成功敲除基因luxs(516bp)，记为luxs1-luxs2，电泳结果如图12所示。有6个单克隆成功敲除基因luxs，2个单克隆没有敲除基因luxs，选择泳道1的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中seqidno.15。blast比对后，结果显示成功敲除基因luxs。

2.4pcas-p15a-sacbδλ-red、ptargetf-gm-luxs质粒的消除：

2.4.1ptargetf-gm-luxs质粒的消除：

使用10mmiptg过夜诱导且二次传代后，结果显示72个单克隆中有6个单克隆在浓度为kan300ug/ml和gm150ug/ml的lb固体平板上不能生长，在浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上可以生长(图13)。表明这6个单克隆成功消除了质粒ptargetf-gm-luxs，由此得到了只含质粒pcas-p15a-sacbδλ-red的yd25δluxs。

2.4.2pcas-p15a-sacbδλ-red质粒的消除：

使用30％蔗糖培养基过夜诱导且二次传代后，结果显示42个单克隆中有15个单克隆在浓度为kan300ug/ml的lb固体平板上不能生长，在lb固体平板上正常生长(图14)。表明这15个单克隆成功消除了质粒pcas-p15a-sacbδλ-red，由此得到了不含质粒的yd25δluxs，即为δluxs突变株。

实施例5：δluxs突变株中luxs基因回补的研究

1.试验方法：

1.1载体pstv29复制子的改造：

以质粒ptargetf-gm-luxs为模板，使用引物pmb1-f、r进行pcr扩增pmb1片段，记为pmb1。将片段pmb1进行胶回收、酶切及纯化，得到插入片段pmb1；酶切采用的酶为xbai和nhei。

将载体pstv29进行酶切及胶回收，酶切采用的酶为xbai和nhei。

插入片段pmb1与pstv29双酶切载体的摩尔比为5:1，通过计算，在10ul的体系里双酶切载体pstv29的加入量为120ng，插入片段pmb1的加入量为133ng。

菌液pcr筛选阳性克隆与菌液送样测序：方法步骤同实施例2中的1.6。

新建载体pstv29-pmb1的制备：方法步骤同实施例1中的1.5。

1.2luxs基因回补载体pstv29-pmb1-luxs的构建：

1.2.1片段luxs的获得：

以yd25基因组为模板，使用引物luxs-f、r进行pcr扩增luxs片段，记为luxs。将片段luxs进行胶回收、酶切及纯化，得到插入片段luxs；酶切采用的酶为ecori和sphi。

将载体pstv29-pmb1进行酶切及胶回收，酶切采用的酶为ecori和sphi。

插入片段luxs与pstv29-pmb1双酶切载体的摩尔比为5:1，通过计算，在20ul的体系里双酶切载体pstv29-pmb1的加入量为100ng，插入片段luxs的加入量为89ng。

菌液pcr筛选阳性克隆与菌液送样测序：方法步骤同实施例2中的1.6。

新建载体pstv29-pmb1-luxs的制备：方法步骤同实施例1中的1.5。

1.3luxs基因回补载体pstv29-pmb1-lux转化及回补株的筛选

1.3.1yd25感受态细胞的制备：方法步骤同实施例3中的1.1。

1.3.2luxs基因回补载体pstv29-pmb1-luxs转化：

方法步骤同实施例3中的1.2，涂布至含浓度为cm170ug/ml的固体lb平板上，倒置于30℃恒温培养箱过夜培养。

1.3.3基因luxs回补株的获得：

从上述1.3.2中的平板上挑取1个单克隆置于含浓度为10mmiptg的lb液体培养基的摇菌管中，置于30℃恒温摇床220rpm，振荡过夜培养。次日，蘸取少量菌液划线于含浓度为10mmiptg的lb固体培养基的平板上，置于30℃恒温培养箱静置培养24h后，保存于4℃冰箱备用。

上述方法中所用到的引物如下：

2.试验结果：

2.1载体pstv29复制子的改造：

随机挑取4个单克隆进行菌液pcr检测片段pmb1，电泳结果如图15所示。4个单克隆全部正确，菌液pcr可以得到片段pmb1且大小正确，选择泳道1的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中seqidno.16。blast比对后，结果显示片段pmb1无碱基突变和移码突变，表明载体构建成功，命名为pstv29-pmb1。

2.2luxs基因回补载体pstv29-pmb1-luxs的构建：

随机挑取6个单克隆进行菌液pcr检测片段luxs，电泳结果如图16所示。6个单克隆全部正确，菌液pcr可以得到片段luxs且大小正确，选择泳道1的单克隆菌液送至西安擎科泽西生物有限公司测序，测序结果见序列表中seqidno.17。blast比对后，结果显示片段luxs无碱基突变和移码突变，表明载体构建成功，命名为pstv29-pmb1-luxs。

2.3luxs基因回补株的获得：

将载体pstv29-pmb1-luxs转入yd25δluxs中，经10mmiptg过夜诱导后，划线于含有浓度为cm34ug/ml的lb固体平板上，30℃过夜培养，成功获得c-yd25δluxs回补株，如图17所示。

实施例6：yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs性状变化研究

1.试验方法：

1.1yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中ai-2信号分子的检测：

1.1.1菌株活化：

将菌株yd25、yd25δluxs(实施例4制备)、c-yd25δluxs(实施例5制备)按照实施例3中1.1的方法进行活化，但使用kb培养基摇菌。

1.1.2yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中ai-2信号分子的检测：

分别取100ul过夜培养的yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs菌液，6000rpm离心3min后，加入到含有100ul10mm1,10邻二氮杂菲/3.32mm硫酸铁铵溶液的ep管中，静置5min后，加入300ul灭过菌的超纯水，静置5min。分别取200ul反应液置于96孔板中，使用超微量微孔板分光光度计分别测量反应液中400-600nm的吸光值后，绘制折线图。阴性对照为kb培养基，阳性对照为抗坏血酸溶液。

1.2yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中丛动、泳动的检测：

取5ul上述活化好的yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs菌液分别接种于0.5％固体lb平板和0.3％固体lb平板上，正置于30℃培养箱培养12h，观察结果。

1.3yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中灵菌红素的检测：

取1ml上述活化好的yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs菌液，12000rpm离心5min，弃上清，分别加入1ml4％酸化的无水乙醇溶液，用枪头轻轻吹吸重悬，12000rpm离心5min，分别取200ul上清置于96孔板中，使用超微量微孔板分光光度计分别测量反应液中500-600nm的吸光值，绘制折线图。阴性对照为kb培养基。

1.4yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中serrawettinw2的检测：

取上述活化好的yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs菌液按1％的比例加入到含有200mlkb液体培养基的1l的锥形瓶中，200rpm，30℃，振荡培养60h。发酵液分别装于离心瓶中，4℃，10000rpm离心30min，弃上清，分别向菌体中加入50ml无水乙醇重悬后转移至250ml锥形瓶中，置于30℃恒温摇床220rpm振荡萃取3h，使胞内的代谢产物抽提出来并溶于无水乙醇中，分别将萃取液转移至50ml离心管中，置于冷冻离心机4℃，5000rpm离心30min，收集上清。同样的方法萃取两次，将上清液合并。分别取合并后的上清液置于旋转蒸发仪去除溶剂无水乙醇，即得菌株yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs的发酵粗品。

称量上述所得的菌株yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs的发酵粗品，加入1ml色谱甲醇使其全部溶解后，稀释至0.2mg/ml，使用0.22um有机滤膜过滤即得hplc分析样品。使用分析柱syncronisc18(4.6mm*250mm，5μm)，使用高效液相色谱仪检测菌株yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中的次级代谢产物serrawetinw2。检测条件如下：

2.试验结果：

2.1yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中ai-2信号分子的检测结果：

检测结果如图18所示，结果表明：菌株yd25和c-yd25δluxs的反应液在510nm有最高吸收峰，与阳性对照抗坏血酸溶液反应结果一致，说明两者都产生ai-2信号分子，而菌株yd25δluxs的反应液与阴性对照kb培养基结果一致，说明yd25δluxs不产生ai-2信号分子。

2.2yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中丛动、泳动的检测结果：

菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs的丛动实验结果如图19所示，泳动结果如图20所示。菌株yd25和回补株c-yd25δluxs在0.5％lb固体平板上可以产生分支状的菌体，说明两者丛动能力强；而敲除株yd25δluxs没有上述现象，说明敲除株yd25δluxs丛动能力大大减弱。菌株yd25和回补株c-yd25δluxs在0.3％lb固体平板上可以产生很大的圆形菌体，说明两者游动能力强；而敲除株yd25δluxs没有上述现象，说明敲除株yd25δluxs游动能力大大减弱。

2.3yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中灵菌红素的检测结果：

使用4％酸化的无水乙醇溶液从菌株yd25、yd25δluxs、c-yd25δluxs中抽提出灵菌红素，其在534nm处有最高吸收峰，结果如图21所示。菌株yd25和c-yd25δluxs反应结果显示在534nm处有最高吸收峰，说明yd25和c-yd25δluxs都可以产生灵菌红素，而yd25δluxs在534nm处没有最高吸收峰，说明yd25δluxs不产生灵菌红素。

2.4yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中serrawettinw2的检测结果：

称量菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs的发酵粗品，重量分别为183mg、40mg和101mg，用1ml色谱甲醇溶解后浓度分别为183mg/ml、40mg/ml和101mg/ml，分别稀释至0.2mg/ml。通过hplc检测次级代谢产物serrawettinw2，检测波长为215nm。菌株yd25和c-yd25δluxs分别在22.5min和23min显示有serrawettinw2的出峰，说明菌株yd25和回补株c-yd25δluxs都产生serrawettinw2；而yd25δluxs没有serrawettinw2的出峰，说明yd25δluxs不产生serrawettinw2。

通过对菌株yd25、yd25δluxs和c-yd25δluxs中ai-2信号分子、丛动、泳动能力、灵菌红素以及serrawettinw2的检测，发现野生株yd25会产生ai-2信号分子、灵菌红素和serrawettinw2，且丛动、泳动能力很强。当敲除基因luxs获得yd25δluxs后，发现yd25δluxs并不产生ai-2信号分子、灵菌红素和serrawettinw2，且丛动、泳动能力大大减弱。当回补基因luxs获得回补株和c-yd25δluxs后，发现c-yd25δluxs会重新产生ai-2信号分子，灵菌红素和serrawettinw2。与野生株yd25相比，c-yd25δluxs中ai-2信号分子，灵菌红素和serrawettinw2的产生量均有所增加。与yd25δluxs相比，c-yd25δluxs的丛动、泳动能力均有所增强。

从上述实验结果可以看出，灵菌红素和serrawettinw2的产生具有一致性，即要么同时产生，要么都不产生。因此，菌株yd25的次级代谢产物灵菌红素和serrawettinw2存在共调控通路。敲除基因luxs导致灵菌红素和serrawettinw2均不产生，回补基因luxs后灵菌红素和serrawettinw2同时重新产生。因此基因luxs是菌株yd25灵菌红素和serrawettinw2共调控通路上的一个正调控因子。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

序列表

<110>陕西师范大学

<120>适用于沙雷氏菌基因改造的crispr-cas9双载体系统

<130>2020

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

actactttagtcagttccgcagtattacaaa31

<210>2

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ggttcttatggctcttgtatctatcagtgaa31

<210>3

<211>43

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taacaaataatatcaacagggacaccaggatttatttattctg43

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

atacaagagccataagaacctcgccttgcagcacatccc39

<210>5

<211>47

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cctgttgatattatttgttaactgttaattgtccttgttcaaggatg47

<210>6

<211>59

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gcggaactgactaaagtagtcacatatacctgccgttcactattatttagtgaaatgag59

<210>7

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

aaacagacgaagaatccatgggtatggacagatctcaaaaaaag44

<210>8

<211>50

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

tgtccatacccatggattcttcgtctgttttaaatcgatgcaggtggcac50

<210>9

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

accctgttatccctactcgaatgttacgcagcagcaacgat41

<210>10

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

cacctagatcctttacgcgtttaggtggcggtacttggg39

<210>11

<211>1207

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

tcttccgtcacaggtaaatattcggcgcaaagtgcgtcgggtgatgctgccaacttactg60

atttagtgtatgatggtgtttttgaggtgctccagtggcttctgtttctatcagctgtcc120

ctcctgttcagctactgacggggtggtgcgtaacggcaaaagcaccgccggacatcagcg180

ctagcggagtgtatactggcttactatgttggcactgatgagggtgtcagtgaagtgctt240

catgtggcaggagaaaaaaggctgcaccggtgcgtcagcagaatatgtgatacaggatat300

attccgcttcctcgctcactgactcgctacgctcggtcgttcgactgcggcgagcggaaa360

tggcttacgaacggggcggagatttcctggaagatgccaggaagatacttaacagggaag420

tgagagggccgcggcaaagccgtttttccataggctccgcccccctgacaagcatcacga480

aatctgacgctcaaatcagtggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtt540

tccccctggcggctccctcgtgcgctctcctgttcctgcctttcggtttaccggtgtcat600

tccgctgttatggccgcgtttgtctcattccacgcctgacactcagttccgggtaggcag660

ttcgctccaagctggactgtatgcacgaaccccccgttcagtccgaccgctgcgccttat720

ccggtaactatcgtcttgagtccaacccggaaagacatgcaaaagcaccactggcagcag780

ccactggtaattgatttagaggagttagtcttgaagtcatgcgccggttaaggctaaact840

gaaaggacaagttttggtgactgcgctcctccaagccagttacctcggttcaaagagttg900

gtagctcagagaaccttcgaaaaaccgccctgcaaggcggttttttcgttttcagagcaa960

gagattacgcgcagaccaaaacgatctcaagaagatcatcttattaatcagataaaatat1020

ttctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgtagcacctgaagtcagccccatacga1080

tataagttgtaattctcatgtttgacagcttatcatcgataagctcattcgccattcagg1140

ctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctatacgccagctcgaaa1200

tgttagc1207

<210>12

<211>1793

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>12

atatgtatagatattttctgaattgtgattaaaaaggcaactttatgcccatgcaacaga60

aactataaaaaatacagagaatgaaaagaaacagatagattttttagttctttaggcccg120

tagtctgcaaatccttttatgattttctatcaaacaaaagaggaaaatagaccagttgca180

atccaaacgagagtctaatagaatgaggtcgaaaagtaaatcgcgcgggtttgttactga240

taaagcaggcaagacctaaaatgtgtaaagggcaaagtgtatactttggcgtcacccctt300

acatattttaggtctttttttattgtgcgtaactaacttgccatcttcaaacaggagggc360

tggaagaagcagaccgctaacacagtacataaaaaaggagacatgaacgatgaacatcaa420

aaagtttgcaaaacaagcaacagtattaacctttactaccgcactgctggcaggaggcgc480

aactcaagcgtttgcgaaagaaacgaaccaaaagccatataaggaaacatacggcatttc540

ccatattacacgccatgatatgctgcaaatccctgaacagcaaaaaaatgaaaaatatca600

agttcctgagttcgattcgtccacaattaaaaatatctcttctgcaaaaggcctggacgt660

ttgggacagctggccattacaaaacgctgacggcactgtcgcaaactatcacggctacca720

catcgtctttgcattagccggagatcctaaaaatgcggatgacacatcgatttacatgtt780

ctatcaaaaagtcggcgaaacttctattgacagctggaaaaacgctggccgcgtctttaa840

agacagcgacaaattcgatgcaaatgattctatcctaaaagaccaaacacaagaatggtc900

aggttcagccacatttacatctgacggaaaaatccgtttattctacactgatttctccgg960

taaacattacggcaaacaaacactgacaactgcacaagttaacgtatcagcatcagacag1020

ctctttgaacatcaacggtgtagaggattataaatcaatctttgacggtgacggaaaaac1080

gtatcaaaatgtacagcagttcatcgatgaaggcaactacagctcaggcgacaaccatac1140

gctgagagatcctcactacgtagaagataaaggccacaaatacttagtatttgaagcaaa1200

cactggaactgaagatggctaccaaggcgaagaatctttatttaacaaagcatactatgg1260

caaaagcacatcattcttccgtcaagaaagtcaaaaacttctgcaaagcgataaaaaacg1320

cacggctgagttagcaaacggcgctctcggtatgattgagctaaacgatgattacacact1380

gaaaaaagtgatgaaaccgctgattgcatctaacacagtaacagatgaaattgaacgcgc1440

gaacgtctttaaaatgaacggcaaatggtatctgttcactgactcccgcggatcaaaaat1500

gacgattgacggcattacgtctaacgatatttacatgcttggttatgtttctaattcttt1560

aactggcccatacaagccgctgaacaaaactggccttgtgttaaaaatggatcttgatcc1620

taacgatgtaacctttacttactcacacttcgctgtacctcaagcgaaaggaaacaatgt1680

cgtgattacaagctatatgacaaacagaggattctacgcagacaaacaatcaacgtttgc1740

gcctagcttcctgctgaacatcaaaggcaagaaaacatctgtgtcaaagacag1793

<210>13

<211>1273

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>13

tgggaatctcaaagcgcgttgagacgccggaagccgtggccgaccggctgacaaaagcgg60

ttcggcaggggtatgagcctgccctacaggccgccgcaggagcgcgtgagatgcgcaaga120

aggccgatcaagcccaagagacggcccgagaccttcgggagcgcctgaagcccgttctgg180

acgccctggggccgttgaatcgggatatgcaggccaaggccgccgcgatcatcaaggccg240

tgggcgaaaagctgctgacggaacagcgggaagtccagcgccagaaacaggcccagcgcc300

agcaggaacgcgggcgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgcggcgttgtgacaatt360

taccgaacaactccgcggccgggaagccgatctcggcttgaacgaattgttaggtggcgg420

tacttgggtcgatatcaaagtgcatcacttcttcccgtatgcccaactttgtatagagag480

ccactgcgggatcgtcaccgtaatctgcttgcacgtagatcacataagcaccaagcgcgt540

tggcctcatgcttgaggagattgatgagcgcggtggcaatgccctgcctccggtgctctc600

cggagactgcgagatcatagatatagatctcactacgcggctgctcaaacttgggcagaa660

cgtaagccgcgagagcgccaacaaccgcttcttggtcgaaggcagcaagcgcgatgaatg720

tcttactacggagcaagttcccgaggtaatcggagtccggctgatgttgggagtaggtgg780

ctacgtctccgaactcacgaccgaaaagatcaagagcagcccgcatggatttgacttggt840

cagggccgagcctacatgtgcgaatgatgcccatacttgagccacctaactttgttttag900

ggcgactgccctgctgcgtaacatcgttgctgctgcgtaacatcgttgctgctccataac960

atcaaacatcgacccacggcgtaacgcgcttgctgcttggatgcccgaggcatagactgt1020

acaaaaaaacagtcataacaagccatgaaaaccgccactgcgccgttaccaccgctgcgt1080

tcggtcaaggttctggaccagttgcgtgagcgcatacgctacttgcattacagtttacga1140

accgaacaggcttatgtcaactgggttcgtgccttcatccgtttccacggtgtgcgtcca1200

tgggcaaatattatacgcaaggcgacaaggtgctgatgccgctggcgattcaggttcatc1260

atgccgtttgtga1273

<210>14

<211>999

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>14

actacaggaccgactcggtgccactttttcagttgataacggactagccttattttaact60

tgctatttctagctctaaaacgcgagtgcatatggtaagtgactagtattatacctagga120

ctgagctagctgtcaaggatccagcatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaagg180

agaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtc240

gttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaa300

tcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgt360

aaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaa420

aatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgttt480

ccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctg540

tccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctc600

agttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagccc660

gaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgactta720

tcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgct780

acagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatc840

tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaa900

caaaccaccgctggtagcggggggtttttttgtttgcaagcagcatattacgcgcagaaa960

aaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacgggg999

<210>15

<211>995

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>15

ccccccccatgggaattccagcgcaacaaagagaaggtcggcatcgtggtcgacgagtac60

ggcgacattcaggggctggtcacggtggaagacatcctcgaagagatcgtcggcgacttc120

accacctcgatgttgccgacgctggcggaagaagtcacgccgcagagcgacggctcggtc180

ttgatcgacggtaccgccaacgtgcgcgagctgaacaaggccttcaactggactctgccg240

gccaacgaggcgcgcaccgtcaacggcatgctgctggaagagctggaagagatccccgaa300

accggcactcgagtgcgcatcggccattacgatatcgacattctcgacgtacagggcaac360

atgatcaaacaggtgcgggtcacgccaatcacctcgctgcaggccagcgtcggtcatcac420

tgaccgtcggcctgaacgtaaaaaagatgcgaaatcgcgtctttttttatctctgcgggc480

cacgtacgattcgctacctcctcgtaaaagagcatttatttcgaaactttttttcctaac540

cgggaaaccttttccaaccctgcgagtctgagtatgtgaaagacgcgcatttgttatcat600

catccctgtcatcagagatgcatatttggccacattgatgtggcctttttctttttcagc660

ttccgccgttttgcttcaggaacgcttcaaagcttagcgtatcattggcttctatgtcgc720

gttggcgctgccacgaagcctcgcgctctttatccagctcagcttcgttcagaatttcca780

acggctcttccagcagcatctcgcgatagcgttcagccaactgcagaccgacgcgcccgg840

tgccttccgccttcatcgccttcagaatgcgtgcggagaaagtcagttccggatcgtcga900

acgcggcgaccaactcatcgcacacctgctggtattgacgattgccggcttcgccgtcca960

gccttcgtcgcagagaaaaaaaaaagaggggggga995

<210>16

<211>1086

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>16

tatggagagctccaaaatcgacgctcagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaa60

gataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgc120

ttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcac180

gctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaac240

cccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccgg300

taagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggt360

atgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaagga420

cagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagct480

cttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcaga540

ttacgcgcagaaaaaaaggatctcaagctagatttcagtgcaatttatctcttcaaatgt600

agcacctgaagtcagccccatacgatataagttgtaattctcatgtttgacagcttatca660

tcgataagctcattcgccattcaggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggc720

ctcttcgctattacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggt780

aacgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaattcctagatat840

gcagttcctgcagcttctctttcggcagcgccagctcgtcgttgtggttcaccaccacat900

cgttatccagaatgtgcttggcgatctcctgggcttcttccagcgagtgcatatggtaag960

tgccgcattgatactcgttcagctcagggatcttgcgctgatcggtcactttcagcacgt1020

cgggcatcgccgcttttcaaggaatcgggaaacggggtggtctttcagggaccgccgaat1080

aaggtt1086

<210>17

<211>1962

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>17

aaaggccggaggcccagtttgttccaggttctccccgtgggaggtaataattgacggata60

tgatccttttattttgccttcccagaaccctgttaaaaacggttagcgcttcgttaaatc120

cagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataa180

tggtgcagggcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggacttt240

tgggcgctgccggcacctgtcttacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcgg300

cgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctaccggcagcggtgcggactgttg360

taactcagaataagaaatgaggccgctcatggcgttccaatacgcaaaccgcctctcccc420

gcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggc480

agtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacac540

tttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacagga600

aacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgccattgctggatagctttaccgtcg660

atcatacccgtatggcagctccggctgtccgcgttgcaaaaaccatgaaaacgcctcatg720

gcgataccatcacggtgtttgacctgcgcttttgccgcccgaacctggaagtgatgcccg780

agcgcggcattcacacgctggagcacctgttcgccggctttatgcgtgaccatctgaacg840

gccagggcgtggaaattatcgacatctctccgatgggctgtcgcaccggtttctacatga900

gcctgatcggcgtgcctgaagagcagcgcgttgccgatgcctggaaagcggcgatggccg960

acgtgctgaaagtgaccgatcagcgcaagatccctgagctgaacgagtatcaatgcggca1020

cttaccatatgcactcgctggaagaagcgcaggagatcgccaagcacattctggataacg1080

atgtggtggtgaaccacaacgacgagctggcgctgccgaaagagaagctgcaggaactgc1140

atatctaggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgtt1200

acccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagag1260

gcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatgagcttatcga1320

tgataagctgtcaaacatgagaattacaacttatatcgtatggggctgacttcaggtgct1380

acatttgaagagataaattgcactgaaatctagaaatattttatctgattaataagatga1440

tcttcttgagatcgttttggtctgcgcgtaatctcttgctctgaaaacgaaaaaaccgcc1500

ttgcagggcggtttttcgaaggttctctgagctaccaactctttgaaccgaggtaactgg1560

cttggaggagcgcagtcaccaaaacttgtcctttcagtttagccttaaccggcgcatgac1620

ttcaagactaactcctctaaatcaattaccagtggctgctgccagtggtgcttttgcatg1680

tctttccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcggactgaac1740

ggggggttcgtgcatacagtccagcttggagcgaactgcctacccggaactgattgtcag1800

gcgtggaatgaaacaaacgcggccataacagcggaatgaccccggtaaaccgaaaggcag1860

gaacgggaaaacccccgagggaacccccagggggaaacgcctgggatcttttaaagccct1920

ggcgggtttccccccacctggttttaaacgccaaatttctgg1962