一种融合蛋白及其高效表达方法与应用与流程

文档序号：21407388发布日期：2020-07-07 14:41阅读：460来源：国知局

本发明涉及融合蛋白技术领域，更具体的说是涉及一种融合蛋白及其高效表达方法与应用。

背景技术：

蔗糖合酶(sucrosesynthase,sus)，是蔗糖代谢的关键酶之一，可催化蔗糖和udp生成果糖和udpg的可逆反应，偏向于蔗糖裂解反应方向，如sus1可高效催化蔗糖分解生成udpg。尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(uridinediphosphateglucosyltransferase,ugt)，是催化糖基转移的修饰反应，将糖基从活化的供体分子转移到受体分子上。糖基化修饰通常是天然化合物生物合成的最后一步，能够提高天然产物的水溶性、稳定性和生物活性。ugt是糖基类植物次生代谢产物合成途径中的重要酶，如ugt72b14可催化酪醇和udpg合成红景天苷(及副产物udp)。

融合蛋白是通过dna重组技术将多个原本单独的基因编码的蛋白质实现分子水平的连接而获得的多功能新型蛋白质。如可以利用融合技术获得蔗糖合酶(sus)和尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶(ugt)的催化体系，即建立udpg的循环再生体系。拟南芥蔗糖合酶atsus1可高效催化蔗糖和udp生成果糖和udpg；高山红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶rsugt72b14可高效催化酪醇和udpg生成红景天苷和udp。因此，可以通过构建atsus1-rsugt72b14融合蛋白实现udpg再生，以蔗糖和酪醇为底物合成红景天苷，避免了添加昂贵的udpg作为反应物。

atsus1和rsugt72b14基因均来源于植物，与宿主大肠杆菌的密码子使用偏好存在较大差异，常规方法难以实现其高效表达。

综上，如何提供一种可高效表达的atsus1-rsugt72b14融合蛋白是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种融合蛋白及其高效表达方法与应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种融合蛋白，该融合蛋白为atsus1-rsugt72b14融合蛋白，其基因编码序列如seqidno.1所示。

atsus1-rsugt72b14融合蛋白包含拟南芥蔗糖合酶atsus1和高山红景天尿苷二磷酸葡萄糖基转移酶rsugt72b14的核心片段。根据大肠杆菌密码子偏好性，结合atsus1和rsugt72b14基因序列特点，通过设计酶切位点相连法引入ggsg四个氨基酸连接肽序列，获得了优化后的atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因序列。

与原始序列(genbank登录号：nm_122090.4和kx262844.1)相比，优化前后编码atsus1和rsugt72b14的氨基酸序列不变；atsus1基因的优化序列有406个碱基被替换，g+c含量由45.5％增加至49.5％；rsugt72b14基因优化序列有278个碱基被替换，g+c含量由56.75％降至51.05％；优化后序列中无大肠杆菌e.coli低频密码子。

一种融合蛋白的高效表达方法，包括如下步骤：

(1)atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因的合成；

(2)atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因与表达载体连接，构建重组质粒；

(3)重组质粒转化至宿主大肠杆菌进行表达。

优选的，所述步骤(2)为将atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因连接至大肠杆菌表达载体pet-28a，获得重组载体pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14。

优选的，所述步骤(3)为测序验证测后，将重组质粒利用热激法转化至大肠杆菌bl21感受态细胞，获得重组大肠杆菌e.coli/pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14进行表达。

优选的，所述步骤(3)表达条件为：将重组大肠杆菌e.coli/pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14在lb液体培养基中培养至od600为0.6～0.8，添加0.4～0.6mm诱导剂iptg，在温度16～20℃下继续培养6～10h。

融合蛋白在合成红景天苷中的应用。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：(1)经过优化后的atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因可以实现在大肠杆菌中高效表达，并能构建udpg循环再生体系而催化合成红景天苷；(2)利用本发明提供的atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因所需要的诱导表达条件宽松，可实现高效表达，表达量占菌体总蛋白的60％以上；(3)所表达的atsus1-rsugt72b14融合蛋白可提高催化合成红景天苷的效率：相同反应条件下，使用atsus1-rsugt72b14融合蛋白较单独使用rsugt72b14蛋白，体外酶促反应所得红景天苷产量提高50％以上，全细胞催化所得产量则可提高4倍。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中步骤(1)、(2)合成的atsus1基因、rsugt72b14基因和atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因的琼脂糖凝胶电泳检测结果；其中，图1a为atsus1基因琼脂糖凝胶电泳检测结果；图1b为rsugt72b14基因琼脂糖凝胶电泳检测结果；图1c为atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图2为本发明实施例1中步骤(3)重组载体pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14结构示意图；

图3为本发明实施例1中步骤(4)中重组大肠杆菌表达atsus1-rsugt72b14融合蛋白sds-page检测结果；

图4为本发明实施例1中步骤(6)和实施例2中hplc检测结果，其中，图4a为实施例1红景天苷标准品hplc检测结果，～4min出现红景天苷响应峰；图4b为实施例1atsus1-rsugt72b14融合蛋白催化产物hplc检测结果，～4min有红景天苷产物响应峰，图4c为实施例2中含atsus1-rsugt72b14基因的重组大肠杆菌全细胞催化产物hplc检测结果，～4min有红景天苷产物响应峰；

图5为本发明实施例2中重组大肠杆菌全细胞催化合成红景天苷结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明所需药剂为常规实验药剂，采购自市售渠道；未提及的实验方法为常规实验方法，在此不再一一赘述。

实施例1

融合蛋白基因重组大肠杆菌的构建、表达及体外酶促催化与检测，具体实施步骤为：

(1)atsus1及rsugt72b14基因优化：在不改变氨基酸序列的前提下，使用大肠杆菌偏爱型的密码子优化序列。

优化后atsus1核苷酸序列如seqidno.2所示；

优化后rsugt72b14核苷酸序列如seqidno.3所示，genbank号为ku523897.1。

(2)atsus1-rsugt72b14融合基因构建：在atsus1和rsugt72b14优化基因序列之间，设计包含酶切位点bamhi(ggatcc)且编码ggsg四个氨基酸的连接肽序列ggtggatccggt；seqidno.4。按照序列seqidno.1合成atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因。

对步骤(1)、(2)合成的atsus1基因、rsugt72b14基因和atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。由图1结果可知，atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因琼脂糖凝胶电泳检测结果与理论预测3858bp相符。

(3)重组大肠杆菌构建：将合成的atsus1-rsugt72b14融合蛋白基因利用t4dna连接酶连接至大肠杆菌表达载体pet-28a的酶切位点nheⅰ和xhoⅰ之间，获得重组载体pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14。重组载体pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14结构示意图如图2所示。测序验证后，将连接产物(即重组载体pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14)利用热激法转化至大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，挑取阳性克隆菌株通过菌液pcr鉴定，获得重组大肠杆菌e.coli/pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14，同样的方法构建pet-28a空载体的重组大肠杆菌e.coli/pet28a设置为阴性对照。

(4)atsus1-rsugt72b14融合蛋白表达与检测：将重组大肠杆菌在lb液体培养基中培养至od600为0.6，添加0.6mm诱导剂iptg，在20℃条件下继续培养6h。收集诱导培养液进行sds-page检测，结果如图3所示。由图3可知，e.coli/pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14检测结果为141.4kda处有目标条带，而阴性对照e.coli/pet28a无。经bandscan软件分析atsus1-rsugt72b14融合蛋白表达量占菌体总蛋白的60％以上。

(5)atsus1-rsugt72b14融合蛋白体外催化反应与结果检测：将重组e.coli/pet28a-atsus1-4a-rsugt72b14菌体收集进行超声波破碎(400w，每工作5s间歇1s，共破碎10min，冰浴操作)，破碎液过ni柱并用不同浓度(100、200、300、500和1000mm)的咪唑梯度洗脱，收集洗脱液透析3次除盐，利用1mdtt超滤浓缩至od280约为20mg/ml，获得atsus1-rsugt72b14融合蛋白。

将atsus1-rsugt72b14融合蛋白2μg、酪醇200μm、蔗糖200μm、10μmudp、750μm氯化镁和0.1m磷酸钾缓冲液(ph＝7)混合得250μl的反应体系，30℃反应1h后，加等体积甲醇终止反应获得反应液。

(6)催化产物hplc检测：将反应液冻干除杂后用等体积色谱纯甲醇溶解，用hplc检测：检测波长为275nm；

流动相为甲醇(a)和水(b)，流速为0.6ml/min，梯度洗脱；梯度洗脱条件为30％(v/v)a5min，0→70％a20min，80→95％a3min，95％a5min。同样的条件hplc检测红景天苷标准品，结果如图4所示。

由图4结果可知，红景天苷标准品～4min出峰(如图4a)。而反应液也在～4min出峰(如图4b)，表明atsus1-rsugt72b14融合蛋白可催化酪醇、蔗糖(辅以udp)合成红景天苷。

实施例2

融合蛋白基因重组大肠杆菌的构建、表达及全细胞催化与检测，具体实施步骤为：

同实施例1的步骤(1)-(3)进行获得重组大肠杆菌，然后诱导表达6h后，温度调整为30℃反应，添加酪醇200μm、蔗糖200μm、10μmudp后继续培养8～12h，收集培养液超声破碎后冻干处理，冻干粉用等体积甲醇萃取，过膜除杂后同实施例1的步骤(6)进行hplc检测，结果～4min出峰(如图4c所示)，表明atsus1-rsugt72b14融合蛋白在大肠杆菌细胞内亦可催化合成红景天苷。同时在相同反应条件下，单独使用只含rsugt72b14基因的重组大肠杆菌合成红景天苷，结果如图5所示。

由图5结果可知，重组大肠杆菌全细胞催化合成红景天苷，含atsus1-rsugt72b14基因的重组大肠杆菌红景天苷产量为16.65mg/l，优于只含rsugt72b14基因的重组大肠杆菌红景天苷产量为4.15mg/l。相同反应条件下，atsus1-rsugt72b14融合蛋白较单独使用rsugt72b14蛋白，其重组大肠杆菌全细胞催化所得产量可提高4倍。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>北京农学院

<120>一种融合蛋白及其高效表达方法与应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>3858

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

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gctatttgcgttgacggtgcatctactaaggctattgctgaactggccaagaaatggcgt3840

agctctgtcaagcattaa3858

<210>2

<211>2424

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2