一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用与流程

本发明涉及生物领域，具体涉及一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。

背景技术：

布鲁氏菌又称布鲁菌或布氏杆菌，属于革兰阴性胞内寄生菌，能够引起布鲁氏菌病，简称布病。布鲁氏菌主要感染反刍动物，如牛、羊和猪，但仍然可以感染野生动物和海洋动物，乃至人类。布鲁氏菌感染家畜主要症状为怀孕母畜的妊娠后期流产和公畜的睾丸炎。人类感染布鲁氏菌的主要症状与家畜不同，临床上主要表现为反复发热、无力、关节炎和睾丸炎等。布鲁氏菌在全球的不断肆虐，造成严重的经济损失。每年，全球约超过50万人感染布鲁氏菌病。此外，由于人类缺乏典型的临床症状，真实的每年新感染人数可能更高。人类感染布鲁氏菌病主要通过直接接触患病动物或食用受污染的奶制品，并且人类感染布鲁氏菌具有职业倾向性，如牧民和兽医为高风险感染人群。

布鲁氏菌外膜蛋白具有重要的免疫炎性和保护原性，并且也有相关试验表明布鲁氏菌外膜蛋白与其毒力密切相关。omp22，omp25和omp31作为布鲁氏菌重要的细胞壁成分和主要毒力因子有利于布鲁氏菌的胞内生存和慢性感染的建立，并且其突变株在自然宿主中有具有减毒的效应。相关试验揭示布鲁氏菌omp25通过调控不同micrornas的调控抑制tnf-a的分泌。但是，布鲁氏菌omp10、omp19、sp41和bepc的外膜蛋白突变体并不影响布鲁氏菌在巨噬细胞中的毒力。布鲁氏菌omp16是肽聚糖相关脂蛋白的同源物，作为布鲁氏菌的病原体相关分子模式能够活化树突状细胞及介导th1免疫反应。此外，布鲁氏菌omp16具有高度保守性，表明其在布鲁氏菌的胞内生存和持续性感染过程中发挥重要的作用。

目前为止，兽用布鲁氏菌疫苗仍然存在许多缺陷，如干扰诊断测试、对人类具有致病性，引起怀孕动物的流产等等，并且人类没有可用的布鲁氏菌疫苗。布鲁氏菌omp16基因作为重要的毒力因子，仍然未被成功缺失，对于研究omp16的功能具有一定的局限性。布鲁氏菌omp16不能被成功缺失可能是由于其是布鲁氏菌生存的必须基因，对于布鲁氏菌的生长和感染的建立至关重要。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供了一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因条件性诱导缺失菌株，该菌株为猪种布鲁氏菌(brucellasuisbv.1.str.)s2omp16△omp16，于2019年12月2日保藏在中国典型培养物保藏中心,地址：中国，武汉，武汉大学；其保藏号为cctccno：m2019991。

所述菌株为敲除omp16基因的布鲁氏菌s2疫苗株，通过如下步骤构建：

s1、引物设计

利用primierprimier5设计omp16基因扩增引物、omp16上下游扩增引物、骨架载体扩增引物、四环素诱导启动子扩增引物、氨苄霉素抗性基因扩增引物、筛选缺失omp16基因鉴定引物和定量引物，引物序列如下：

pbbr1mcs5骨架载体扩增引物：

f1(5’-ttgacataagcctgttcggttcgta-3’)

r1(5’-cctcccagagcctgataaaaacg-3’)

四环素诱导启动子扩增引物：

f2(5’-gctctgggaggctgcagcggccgtttccatttaggtgggtac-3’)

r2

(5’-cttatgtcaactcgagttttaagcttgcatgcggatccccgggtaccgagctctttctcctctttaatgaattc-3’)

布鲁氏菌omp16基因扩增引物：

f3(5’-ggtaccatgcgccgtatccagtcgattgcac-3’)

r3(5’-

aagcttttacttatcgtcgtcatccttgtaatcccgtccggccccgttgagaa-3’)

omp16上游同源臂

f4(5’-ctgcagttcgcagattgtcttcacatc-3’)

r4(5’-tctagatcatattgaggttaaaacaggct-3’)

omp16下游同源臂

f5(5’-ggtaccatgcgccgtatccagtcgattg-3’)

r5(5’-gaattctacccgatagccgaccgaccct-3’)

氨苄霉素抗性基因鉴定引物：

f6(5’-tctagacgcggaacccctatttgtttatttt-3’)

r6(5’-gtcaccttaccaatgcttaatcagtgaggc-3’)

突变子鉴定引物：

f7(5’-tgctgcaacttgaaaccgg-3’)

r7(5’-ctgggttttttgcaactggtt-3’)

omp16qrt-pcr引物：

f8(5’-tcgatctcgattcgtcgctg-3’)

r8(5’-caagggcgaggttgtactca-3’)

s2、目的基因的pcr扩增及胶回收

以布鲁氏菌s2疫苗株基因组、pbbr1mcs5骨架载体和pg-kje8载体为模板，用相应的引物分别进行pcr反应，扩增omp16基因、骨架载体和四环素诱导启动子：

反应体系如下：5×psbuffer5μl；dntpmixture2μl；f0.5μl；r0.5μl；模板1μl；primestardnapolymerase0.5μl；ddh2o15.5μl；

pcr反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s；58℃退火50s；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min；

将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在切胶仪下分别切取目的大小条带，omp16基因543bp、骨架载体3563bp和四环素诱导启动子1082bp目的条带胶块，使用天根生化科技公司生产的dna纯化回收试剂盒回收pgr产物；

s3、重组载体pzt-g⁺载体构建

将胶回收的骨架载体和四环素诱导启动子在pgr仪中37℃连接30min；连接体系如下：

将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，固体平板放置37℃恒温培养箱12h后，取出固体平板，用枪头挑出生长状况良好的菌落，将枪头打到加有20mllb液体培养基的50ml离心管中，置于37℃恒温摇床中培养12h；之后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒提取pzt-g⁺重组载体；

将提取出的重组载体pzt-g⁺用hindiii和bamhi进行双酶切，使用天根生化科技公司生产的dna纯化回收试剂盒回收酶切产物；

s4、omp16基因黏性末端的获取

将胶回收的omp16基因连接上19t(simple)载体，连接体系如下：

目的基因1μl；19tvector4μl；solutionl5μl；

反应条件为：16℃连接2h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，复苏1小时后，在超净台里用枪吸取100μl的大肠杆菌感受态细胞dh5a滴加到已经到37℃的g⁺la平板，涂布均匀，37℃条件下培养12小时后，用白色枪头挑选生长状态良好的单个菌落，打到装有20mllb液体培养基的50ml灭菌离心管里，震荡培养12h，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取重组载体；

重组载体用19t(simple)-omp16用hindiii和bamhi进行双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，胶回收omp16基因；

s5、条件诱导载体pzt-g⁺-omp16的构建

将双酶切后的pzt-g⁺重组载体和omp16基因在如下反应条件和反应体系进行连接；

反应体系：

pzt-g重组载体1μl；

omp16基因4μl；

solution15μl；

反应条件：16℃连接4h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，复苏1h，取100μl的复苏的菌液在超净台中涂布已经预热到37℃的g⁺la平板，之后在37℃恒温培养箱培养12h，挑取平板上生长状态良好的单个克隆，在lb培养基里震荡培养12h后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取pzt-g-omp16重组载体；

将提取的pzt-g⁺-omp16重组载体进行hindiii和bamhi的双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

s6、自杀载体puc19-a⁺-omp16的构建

分别将胶回收的omp16上游同源臂(654bp)、omp16下游同源臂(651bp)和氨苄霉素抗性基因(973bp)与19t(simple)载体进行连接，连接体系：目的基因1μl；19t(simple)vector4μl；soluton15μl；连接条件是：16℃连接2h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，经转化和复苏步骤后，取100μl菌液涂布于a⁺la平板，37℃条件下培养12h，选取平板上生长状况良好的单个克隆，接种于lb液体培养基，37℃条件下震荡培养12h后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取重组载体；

将提取的重组载体进行双酶切操作，其中，19t(simple)-omp16上游同源臂使用pst1和xba1，19t(simple)-omp16下游同源臂使用kpn1和ecor1，19t(simple)-a⁺使用xba1和kpn1进行双酶切，酶切体系如下：

19t(simple)-omp16上游同源臂酶切体系，psti1.5μl；xbai1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

19t(simple)-omp16下游同源臂酶切体系，kpni1.5μl；ecori1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

19t(simple)-a⁺酶切体系，kpni1.5μl；xbai1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收omp16上游同源臂基因、omp16下游同源臂基因和氨苄霉素抗性基因；

puc19载体用ecori和psti双酶切，puc19酶切体系如下：

psti1.5μl；ecori1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收酶切后的puc19载体；

将上述胶回收的omp16上游同源臂基因、omp16下游同源臂基因、氨苄霉素抗性基因和puc19载体进行连接操作，连接体系如下：

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，经复苏后，涂布到已经预热过的a⁺la平板，37℃条件下培养12h后，选取平板上生长状态良好的单个克隆，接种于lb液体培养基，37℃条件下震荡培养12h，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒提取puc19-a⁺-omp16重组载体；

将提取的puc19-a⁺-omp16重组载体进行psti和ecori的双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

s7、筛选四环素诱导外源omp16表达的布鲁氏菌菌株(s2<omp16>)

s7.1、布鲁氏菌感受态的制备

(1)将活化后的布鲁氏菌涂布到tsa平板上，置于恒温培养箱中，37℃条件下培养72h；

(2)从恒温培养箱中取出平板，挑取平板上生长状况良好的单个克隆接种于装有10ml的50ml离心管里，37℃条件下震荡培养24h；

(3)将所得的菌液与tsb培养基按1∶100的体积比例，在50ml离心管内，37℃条件下震荡培养至od600一次为0.6；

(4)将所得菌液在4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(5)向所得的沉淀中加入预冷的无菌水10ml，重悬沉淀，4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(6)重复步骤(4)和步骤(5)一次；

(7)加入预冷的10％的甘油10ml，重悬沉淀，4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(8)重复步骤(7)一次；

(9)加入事先4℃预冷1h的10％的甘油1ml，重悬沉淀，分装在1.5ml的离心管里，每管100μl，保存在-80℃冰箱备用；

s7.2、电转化

取10μl的pzt-g⁺-omp16质粒加到100μl的布鲁氏菌感受态中，混合均匀，加入到电击杯中，注意，电击杯要事先放在4℃冰箱预冷1h，将电击杯在冰上放置10min后，转到电转仪中，设置电压为1.8kv，电击时间为6ms，电击后立马加入37℃预热的tsb培养液中，转移到1.5ml的离心管里，放入37℃摇床，转速设置为180rpm/min，震荡培养24h后，离心，去上清，沉淀用200μltsb重悬，涂布在具有庆大霉素抗性的tsa平板上，37℃条件下培养72h；

s7.3、筛选s2<omp16>菌株

从37℃恒温培养箱中取出tsa固体平板，用枪头挑出生长状况良好的菌落，接种于10ml离心管中，加入5mltsb庆大霉素和四环素抗性液体培养基，置于37℃恒温摇床中培养约48h；之后通过westernblotting检测omp16的表达；

s8、基于产生的s2<omp16>菌株，筛选内源性omp16缺失菌株(omp16<omp16>)

取puc19-a⁺-omp16质粒10μl，与100μl的s2<omp16>布鲁氏菌感受态混合均匀后，转到电击杯，在冰上放置10min后，将电击杯放到电转仪中，将电压设置为1.8kv，电击时间为6ms，电击后，立马加入已经预热到37℃的tsb培养液，并转入37℃摇床震荡培养24h，菌液进行离心操作，弃掉上清，沉淀用200μltsb重悬，涂布在具有庆大霉素抗性的tsa平板上，37℃条件下培养72h；选取平板上生长状况良好的单个克隆接种于具有氨苄霉素和四环素抗性的tsb液体培养基，37℃条件下震荡培养48h后，westernblotting检测omp16的表达。

进一步地，通过以下步骤将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a：

(1)从-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞dh5a，放置在冰上至其完全融化，此过程大概5min；

(2)向1.5ml离心管内加入20μl已经融化的大肠杆菌感受态细胞dh5a，再加入全部连接产物，充分混匀，注意1.5ml离心管要提前预冷，且操作时不要离开冰面；

(3)混匀之后将1.5ml离心管冰上放置30min，42℃恒温水浴锅热激1min，之后再次在冰上放置2min；

(4)从冰上取出离心管，在超净工作台内加入无抗lb培养液500μl，将摇床温度设置为37℃，转速为180r/min，复苏1h；

(5)复苏期间将g⁺la平板在37℃恒温培养箱预热半小时，用100μl枪取上一步复苏产物100μl，用涂布器在g⁺la平板均匀涂抹。

本发明所述的布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因缺失菌株可用于制备布鲁氏菌减毒疫苗。

本发明提供了一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因缺失菌株，为探究omp16对布鲁氏菌的致病机制及区分自然感染和人工免疫的特性奠定基础，对预防和控制布病具有重要的意义。

附图说明

图1为条件诱导载体pbb-pzt1-omp16构建示意图；

图2在布鲁氏菌中四环素诱导外源flag-omp16的表达。

图中：a：westernblot检测flag-omp16的表达；bqrt-pcr检测flag-omp16的表达；c：if检测flag-omp16的表达。

图3鉴定内源性omp16缺失菌株；

图中：a：omp16缺失菌株构建示意图；b：自杀载体pug19-a⁺-omp16构建示意图；c：pgr筛选内源性omp16缺失菌株。

图4为在s2<omp16>和omp16<omp16>菌株中四环素诱导omp16的表达；

图中：awesternblot检测omp16的表达；bqrt-pcr检测omp16的表达。

图5为细菌生长曲线。

图6为细菌体外应激存活。

图7细菌形态变化。

图8raw264.7中胞内增殖。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明实施例提供了一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因缺失菌株，所述菌株为敲除omp16基因的布鲁氏菌s2疫苗株，通过如下步骤构建：

s1、引物设计

利用primierprimier5设计omp16基因扩增引物、omp16上下游扩增引物、骨架载体扩增引物、四环素诱导启动子扩增引物、氨苄霉素抗性基因、筛选缺失omp16基因鉴定引物和定量引物，引物序列如下：

pbbr1mcs5骨架载体扩增引物：

f1(5’-ttgacataagcctgttcggttcgta-3’)

r1(5’-cctcccagagcctgataaaaacg-3’)

四环素诱导启动子扩增引物：

f2(5’-gctctgggaggctgcagcggccgtttccatttaggtgggtac-3’)

r2

(5’-cttatgtcaactcgagttttaagcttgcatgcggatccccgggtaccgagctctttctcctctttaatgaattc-3’)

布鲁氏菌omp16基因扩增引物：

f3(5’-ggtaccatgcgccgtatccagtcgattgcac-3’)

r3(5’-

aagcttttacttatcgtcgtcatccttgtaatcccgtccggccccgttgagaa-3’)

omp16上游同源臂

f4(5’-ctgcagttcgcagattgtcttcacatc-3’)

r4(5’-tctagatcatattgaggttaaaacaggct-3’)

omp16下游同源臂

f5(5’-ggtaccatgcgccgtatccagtcgattg-3’)

r5(5’-gaattctacccgatagccgaccgaccct-3’)

氨苄霉素抗性基因鉴定引物：

f6(5’-tctagacgcggaacccctatttgtttatttt-3’)

r6(5’-gtcaccttaccaatgcttaatcagtgaggc-3’)

突变子鉴定引物：

f7(5’-tgctgcaacttgaaaccgg-3’)

r7(5’-ctgggttttttgcaactggtt-3’)

omp16qrt-pcr引物：

f8(5’-tcgatctcgattcgtcgctg-3’)

r8(5’-caagggcgaggttgtactca-3’)

s2、目的基因的pcr扩增及胶回收

以布鲁氏菌s2疫苗株基因组、pbbr1mcs5骨架载体和pg-kje8载体为模板，用相应的引物分别进行pcr反应，扩增omp16基因、骨架载体和四环素诱导启动子：

反应体系如下：5×psbuffer5μl；dntpmixture2μl；f0.5μl；r0.5μl；模板1μl；primestardnapolymerase0.5μl；ddh2o15.5μl；

pcr反应条件如下：95℃预变性10min；95℃变性30s；58℃退火50s；72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。

将pcr产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在切胶仪下分别切取目的大小条带，omp16基因543bp、骨架载体3563bp和四环素诱导启动子1082bp目的条带胶块，使用天根生化科技公司生产的dna纯化回收试剂盒回收pcr产物；

s3、重组载体pzt-g⁺载体构建

将胶回收的骨架载体和四环素诱导启动子在pgr仪中37℃连接30min；连接体系如下：

将连接后的产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，具体的：

(1)从-80℃冰箱取出大肠杆菌感受态细胞dh5a，放置在冰上至其完全融化，此过程大概5min。

(2)向1.5ml离心管内加入20μl已经融化的大肠杆菌感受态细胞dh5a，再加入全部连接产物，充分混匀，注意1.5ml离心管要提前预冷，且操作时不要离开冰面。

(3)混匀之后将1.5ml离心管冰上放置30min，42℃恒温水浴锅热激1min，之后再次在冰上放置2min。

(4)从冰上取出离心管，在超净工作台内加入无抗lb培养液500μl，将摇床温度设置为37℃，转速为180r/min，复苏1h。

(5)复苏期间将g⁺la平板在37℃恒温培养箱预热半小时，用100μl枪取上一步复苏产物100μl，用涂布器在g⁺la平板均匀涂抹。

转化完成，固体平板放置37℃恒温培养箱12h后，取出固体平板，用枪头挑出生长状况良好的菌落，将枪头打到加有20mllb液体培养基的50ml离心管中，置于37℃恒温摇床中培养12h；之后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒提取pzt-g⁺重组载体；

将提取出的重组载体pzt-g⁺用hindiii和bamhi进行双酶切，使用天根生化科技公司生产的dna纯化回收试剂盒回收酶切产物；

s4、omp16基因黏性末端的获取

将胶回收的omp16基因连接上19t(simple)载体，连接体系如下：

目的基因1μl；19tvector4μl；solution15μl；

反应条件为：16℃连接2h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a(同上述转化步骤)，复苏1小时后，在超净台里用枪吸取100μl的大肠杆菌感受态细胞dh5a滴加到已经37℃预热过的g⁺la平板，涂布均匀，37℃条件下培养12小时后，用白色枪头挑选生长状态良好的单个菌落，打到装有20mllb液体培养基的50ml灭菌离心管里，震荡培养12h，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取重组载体；

重组载体用19t(simple)-omp16用hindiii和bamhi进行双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，胶回收omp16基因；

s5、条件诱导载体pzt-g⁺-omp16的构建

将双酶切后的pzt-g⁺重组载体和omp16基因在如下反应条件和反应体系进行连接；

反应体系：

pzt-g⁺重组载体1μl；

omp16基因4μl；

solution15μl；

反应条件：16℃连接4h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a(同上述转化步骤)，复苏1h，取100μl的复苏的菌液在超净台中涂布已经预热到37℃的g⁺la平板，之后在37℃恒温培养箱培养12h，挑取平板上生长状态良好的单个克隆，在lb培养基里震荡培养12h后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取pzt-g⁺-omp16重组载体；

将提取的pzt-g⁺-omp16重组载体进行hindiii和bamhi的双酶切，并用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

s6、自杀载体puc19-a⁺-omp16的构建

分别将胶回收的omp16上游同源臂(654bp)、omp16下游同源臂(651bp)和氨苄霉素抗性基因(973bp)与19t(simple)载体进行连接，连接体系：目的基因1μl；19t(simple)vector4μl；soluton15μl；连接条件是：16℃连接2h；

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，经转化和复苏步骤后，取100μl菌液涂布于a⁺la平板，37℃条件下培养12h，选取平板上生长状况良好的单个克隆，接种于lb液体培养基，37℃条件下震荡培养12h后，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒按照说明书要求提取重组载体；

将提取的重组载体进行双酶切操作，其中，19t(simple)-omp16上游同源臂使用pst1和xba1，19t(simple)-omp16下游同源臂使用kpn1和ecor1，19t(simple)-a⁺使用xba1和kpn1进行双酶切，酶切体系如下：

19t(simple)-omp16上游同源臂酶切体系，pstl1.5μl；xbal1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

19t(simple)-omp16下游同源臂酶切体系，kpni1.5μl；ecori1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

19t(simple)-a⁺酶切体系，kpni1.5μl；xbai1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收omp16上游同源臂基因、omp16下游同源臂基因和氨苄霉素抗性基因；

puc19载体用ecori和psti双酶切，puc19酶切体系如下：

psti1.5μl；ecori1.5μl；10×mbuffer5μl；质粒30μl；tb12μl；

酶切后的产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收酶切后的puc19载体；

将上述胶回收的omp16上游同源臂基因、omp16下游同源臂基因、氨苄霉素抗性基因和puc19载体进行连接操作，连接体系如下：

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞dh5a，经复苏后，涂布到已经预热过的g⁺la平板，37℃条件下培养12h后，选取平板上生长状态良好的单个克隆，接种于lb液体培养基，37℃条件下震荡培养12h，使用天根生化科技公司生产的质粒小提中量试剂盒提取puc19-a⁺-omp16重组载体；

将提取的puc19-a⁺-omp16重组载体进行psti和ecori的双酶切，酶切产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定；

s7、筛选四环素诱导外源omp16表达的布鲁氏菌菌株(s2<omp16>)

s7.1、布鲁氏菌感受态的制备

(1)将活化后的布鲁氏菌涂布到tsa平板上，置于恒温培养箱中，37℃条件下培养72h；

(2)从恒温培养箱中取出平板，挑取平板上生长状况良好的单个克隆接种于装有10ml的50ml离心管里，37℃条件下震荡培养24h；

(3)将所得的菌液与tsb培养基按1∶100的体积比例，在50ml离心管内，37℃条件下震荡培养至od600约为0.6；

(4)将所得菌液在4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(5)向所得的沉淀中加入预冷的无菌水10ml，重悬沉淀，4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(6)重复步骤(4)和步骤(5)一次；

(7)加入预冷的10％的甘油10ml，重悬沉淀，4℃离心机里离心，转速为5000r/min，离心10min，弃掉液体，留下沉淀；

(8)重复步骤(7)一次；

(9)加入事先放在4℃冰箱预冷1h的10％的甘油1ml，重悬沉淀，分装在1.5ml的离心管里，每管100μl，保存在-80℃冰箱备用；

s7.2、电转化

取10μl的pzt-g⁺-omp16质粒加到100μl的布鲁氏菌感受态中，混合均匀，加入到电击杯中，注意，电击杯要事先放在4℃冰箱中预冷1h，将电击杯在冰上放置10min后，转到电转仪中，设置电压为1.8kv，电击时间为6ms，电击后立马加入37℃预热的tsb培养液中，转移到1.5ml的离心管里，放入37℃摇床，转速设置为180rpm/min，震荡培养24h后，离心，去上清，沉淀用200μltsb重悬，涂布在具有庆大霉素抗性的tsa平板上，37℃条件下培养72h；

s7.3、筛选s2<omp16>菌株

从37℃恒温培养箱中取出tsa固体平板，用枪头挑出生长状况良好的菌落，接种于10ml离心管中，加入5mltsb庆大霉素和四环素抗性液体培养基，置于37℃恒温摇床中培养约48h；之后通过westernblotting检测omp16的表达。

细菌胞外生长曲线检测

从相应的平板上分别选取生长状态良好的b.suiss2、s2<omp16>和omp16<omp16>单克隆，接种于tsb液体培养基，37℃摇床中震荡培养至od600≈1.0，再按1∶100的体积比例接种于新鲜的tsb液体培养基震荡培养。每种菌分成两个实验组，分别是加四环素组和不加四环素组。每4h取一次菌液，每次取样500μl，在沸水中灭活10min后，用酶联免疫检测仪测吸光值，直至72h。结果：通过生长曲线检测表明δomp16菌株与野生型菌株在体外具有相同的增殖活力。

体外应激实验检测细菌存活率

将培养至od600≈1.0的菌液倍比稀释，涂布于tsa平板，37℃条件下培养一定时间，进行菌落计数。选取合适稀释倍数的菌液，吸取1ml，经离心和弃上清操作后，分别用0.5m的d(-)-sorbitol溶液，50μg/ml多粘菌素b的tsb培养液，含0.5mmh2o2的tsb培养液，ph5.0的tsb培养液及42℃的tsb培养液重悬，并进行梯度稀释后，涂布于tsa平板，37℃条件下培养一定时间，进行菌落计数。同时以未处理的三个菌株作为对照，试验重复三次。结果：通过体外应激试验表明δomp16菌株对渗透压和多粘菌素b的敏感性增加。

扫描电镜观察细菌形态

1.取样：将细菌培养至悬浮状态后，离心，弃去上清。

2.漂洗：取2mlph6.8的0.1m的pbs缓冲液浸洗沉淀，每次10min，此步骤重复4次。

3.后固定：仅动物组织需要后固定：用0.7ml左右1％锇酸4℃固定1-2小时。

4.脱水：依次用10％，30％，50％，70％，80％，90％的乙醇溶液进行脱水操作，每次脱水时间为15-20min；最后用100％的乙醇脱水3次，每次脱水30min。

5.中间置换：用丙酮置换一次，置换时间为10-20min，样品可在4℃条件下于丙酮中长期存放。

6.co2干燥。

7.粘台：样品干燥后，注意区别正反面，粘到导电胶上

8.喷金-上样观察。

结果：通过扫描电镜观察，与野生型菌株相比较，omp16<omp16>菌株在细菌外膜表明出现空泡，但在加入四环素后能够恢复到与野生型相似的水平。

在raw264.7巨噬细胞内增殖的变化

将raw264.7巨噬细胞按2×10⁵细胞/孔接种于24孔板，置于细胞培养箱培养12h。b.suis.s2菌株和δomp16菌株按照100∶1的感染复数(multiplicityofinfection，moi)分别加到铺有raw264.7巨噬细胞的24孔板里，置细胞培养箱培养4h后，弃去培养液，用pbs洗3遍，加入含有50μg/ml氨苄霉素培养液，培养1h。后弃去培养液，用pbs洗3遍，加入25μg/ml氨苄霉素的培养液。此时作为0h，分别在0h、6h、12h、24h、48h时收样，用含有0.5％tritonx-100的pbs裂解细胞，裂解时，放置在恒温培养箱10min。裂解后的细胞进行倍比稀释，涂布于tsa平板，进行菌落计数。注意，每个时间点设置三个重复，该实验重复三次。

结果：omp16<omp16>菌株感染raw264.7期间，在感染后的24和48h，omp16<omp16>菌株胞内增殖显著降低，但在加入四环素后能够恢复到与野生型相似的水平。

以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。

序列表

<110>西北农林科技大学

<120>一株布鲁氏菌s2疫苗株omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用

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