一种交联透明质酸的硫酸软骨素类化合物及其应用的制作方法

本发明属于原料药合成领域，具体涉及一种交联透明质酸钠的硫酸软骨素或类肝素及其应用。
背景技术：
：硫酸软骨素，简称cs，是一类硫酸化的酸性粘多糖由葡糖醛酸和n-乙酰氨基半乳糖二糖单位重复组成。硫酸软骨素在人和动物的很多组织器官中都存在，多分布于软骨、韧带、肌腱、角膜等不同组织中。具有一定的抗氧化和清除自由基的作用。类肝素，是一种多硫酸化硫酸软骨素，具有一定的消炎抗菌的作用。市面上常见的硫酸软骨素软膏和类肝素软膏，添加的是硫酸软骨素和类肝素，达到消炎消肿祛疤等效果。但是硫酸软骨素和类肝素容易被酶分解，其中部分硫酸软骨素和类肝素还未到效果就被分解掉了。因此需要开发一种新的产品既具有硫酸软骨素软膏和类肝素的活性，又能够抗酶解。技术实现要素：针对硫酸软骨素和类肝素使用过程中容易被酶解的问题，本发明提供一种交联的硫酸软骨素或类肝素，该交联后的化合物性质稳定、不易降解。本发明的另一目的是提供一种交联化合物在医药中的应用。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。一种交联硫酸软骨素类化合物的制备方法，包括以下步骤：（1）相转移催化剂存在下，透明质酸钠和edc·hcl（1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐）溶解于水中，调节ph并搅拌反应；（2）在步骤（1）的溶液中加入硫酸软骨素类化合物和edc·hcl，调节ph至酸性、搅拌反应；（3）对上述溶液进行超滤除杂，获得流出液；（4）调节流出液的ph，加入乙醇获得沉淀，将沉淀洗涤并烘干，得到交联硫酸软骨素类化合物。所述透明质钠的浓度为0.5-2wt%。所述透明质酸钠的分子量为20-200kda。所述透明质酸钠和edc·hcl的摩尔比为1:1-1:1.5。所述透明质酸钠的摩尔数根据透明质酸钠的平均分子量计算。所述透明质酸和相转移催化剂的摩尔比为1:0.25-1:0.5。优选的，所述相转移催化剂选自季铵盐类、季膦盐类，如苄基三乙基氯化铵（teba）、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、四丁基硫酸氢铵（tbab）、三辛基甲基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵或四丁基溴化膦。步骤（1）和步骤（2）中，所述ph为3.8-4.0。步骤（1）和步骤（2）中，所述反应温度为20-40℃。所述反应时间为2-3h。优选的，步骤（1）的水中还包括氯化钠；更优选的，所述氯化钠在水中的浓度为2wt%-4wt%。所述硫酸软骨素类化合物与步骤（1）中透明质酸钠的摩尔比为1:0.25-1:0.5。所述透明质酸钠的摩尔数根据透明质酸钠的平均分子量计算。所述硫酸软骨素类化合物包括硫酸软骨素和类肝素。所述硫酸软骨素类化合物与edc·hcl摩尔比为1:1-1:1.5。所述超滤的条件为采用3kda-10kda的超滤膜，压差0.2mpa。步骤（3）中，所述流出液中目标产物浓度为35-45g/l。步骤（4）中，所述乙醇的浓度为90-100wt%。步骤（4）中，所述ph为6.5-7.0。优选的，步骤（4）中，以ph9-10.5的浓度为90-95wt%乙醇调节ph。优选的，步骤（4）中，在调节ph前还包括加入氯化钠的步骤。所述氯化钠的加入量为2wt%-4wt%。一种上述方法获得的交联硫酸软骨素类化合物。所述交联硫酸软骨素的交联度为0.00052mol/g-0.00056mol/g。所述交联类肝素的交联度为0.00034mol/g-0.00039mol/g。所述mol/g是指每克交联硫酸软骨素类化合物中所含的酯基的物质的量。一种上述交联硫酸软骨素类化合物在制备药物中的应用。一种含上述交联硫酸软骨素类化合物的药物。所述药物优选为外用药。本发明具有以下优点：本发明的制备方法优化了活化反应中的条件，通过添加氯化钠和ph调节透明质酸活化反应体系的粘度和反应速度。在透明质酸钠活化反应过程中，随着反应进行，溶液粘度逐渐增大，加入浓度2-4%氯化钠后可有效降低粘度，有助于反应搅拌继续进行，小于2%或大于4%对粘度降低效果不明显。低于3.8呈凝胶状影响反应速度，大于4时，反应进行不彻底。本发明制备的交联硫酸软骨素类化合物交联度适宜，具有良好的生物活性，且性质稳定不易降解，能够用于制备硫酸软骨素软膏和类肝素软膏具有消炎抗菌的作用。附图说明图1是实施例1制备的交联硫酸软骨素/透明质酸的红外谱图；图4是硫酸软骨素的红外谱图（1240cm-1处为s=o伸缩振动）；图3是透明质酸钠（平均分子量200kda）的红外谱图；图2是实施例2制备的交联类肝素/透明质酸的红外谱图；图5是类肝素的红外谱图（1240cm-1处为s=o伸缩振动）。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明做进一步说明，但本发明不受下述实施例的限制。实施例1透明质酸-硫酸软骨素交联物的合成（1）在1000ml蒸馏水中溶解20g氯化钠和5g的四丁基溴化铵备用，在2000ml的反应瓶中称取20g分子量为200kda的透明质酸钠用上述蒸馏水溶液溶解，再加入10gedc·hcl完全溶解后调节ph至4.0并在室温下反应3h，每隔15min检测一次ph使其始终维持在4.0；（2）称取20g的硫酸软骨素加入上述反应瓶中溶解，再加入10gedc·hcl溶解后调节ph至4.0并在室温下反应3h；（3）将上述溶液稀释到10l进行超滤，超滤至溶液为1000ml，再次稀释超滤，超滤三次，获得流出液1000ml；（4）溶液中加入20g氯化钠溶解以利于沉淀，缓慢加入ph10的95%乙醇1000ml调节溶液ph至6.8，缓慢加入95%乙醇至沉淀完全析出；沉淀用80%的酒精洗涤沉淀三次，每次1000ml；再用95%的酒精洗涤沉淀三次，每次500ml；将沉淀烘干得到36g白色粉末，即为交联透明质酸的硫酸软骨素。其红外谱图如图1所示，与硫酸软骨素的红外谱图（图2）相比：在1235cm-1处为s=o伸缩振动，1703cm-1处为酯基吸收峰，说明有交联形成的酯。实施例2透明质酸-类肝素交联物的合成（1）在1000ml蒸馏水中溶解20g氯化钠和5g的四丁基溴化铵备用，在2000ml的反应瓶中称取20g分子量为200kda的透明质酸钠用上述蒸馏水溶液溶解，再加入10gedc·hcl完全溶解后调节ph至4.0并在室温下反应3h,每隔15min检测一次ph使其始终维持在4.0；（2）称取20g的类肝素加入上述反应瓶中溶解，再加入10gedc·hcl溶解后调节ph至4.0并在室温下反应3h；（3）将上述溶液稀释到10l进行超滤，超滤至溶液为1000ml，再次稀释超滤，超滤三次，获得流出液1000ml；（4）将流出液中加入20g氯化钠溶解以利于沉淀，缓慢加入ph10.2的95%乙醇1000ml调节溶液ph至6.8，缓慢加入95%乙醇至沉淀完全析出；沉淀用80%的酒精洗涤沉淀三次，每次1000ml；再用95%的酒精洗涤沉淀三次，每次500ml；将沉淀烘干得到36g白色粉末，即为交联透明质酸的类肝素。其红外谱图如图3所示，与类肝素的红外谱图（图4）相比，1240cm-1处为s=o伸缩振动，1699cm-1处为酯基吸收峰，说明有交联形成的酯。实施例3交联硫酸软骨素类化合物交联度检测（1）交联硫酸软骨素准确称取实施例1制备的交联硫酸软骨素5g，置于250ml的耐压瓶中，用移液管移入20.00ml的0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液，在50℃水浴下磁力搅拌30min使其完全皂化，加入3滴酚酞指示剂，用0.25mol/l的盐酸标准溶液滴定至无色为终点，平行测三次，消耗盐酸体积为v1。按照上述步骤，但不加交联硫酸软骨素/透明质酸钠，进行3次空白实验，消耗盐酸体积为v2。交联度x=。（2）交联类肝素准确称取实施例2制备的交联类肝素5g，置于250ml的耐压瓶中，用移液管移入20.00ml的0.5mol/l的氢氧化钠标准溶液，在50℃水浴下磁力搅拌30min使其完全皂化，加入3滴酚酞指示剂，用0.25mol/l的盐酸标准溶液滴定至无色为终点，平行测三次，消耗盐酸体积为v3。按照上述，但不加交联类肝素/透明质酸钠，进行3次空白实验，消耗盐酸体积为v4。交联度x=。结果如表1所示：表1交联硫酸软骨素类化合物的交联度产品交联度（mol/g）交联硫酸软骨素0.00054交联类肝素0.00039实施例4抗酶解检测（1）交联硫酸软骨素取0.5g交联硫酸软骨素，加入300u/ml的硫酸软骨素酶溶液2ml，37℃下反应24、48、72h，取0.2ml加无水乙醇4.8ml，用滤器过滤得到1ml溶液，加pbs至8ml，作为a液。另取交联硫酸软骨素0.5g，加0.5mol/l的硫酸溶液10ml，沸水下水解15min，定容至100ml，作为b液。分别取a液和b液各1ml，用改良的咔唑法测定溶液中糖醛酸的质量浓度。按照以下公式计算降解率：降解率（%）=。（2）交联类肝素取0.5g交联类肝素，加入300u/ml的类肝素酶溶液2ml，37℃下反应24、48、72h，取0.2ml加无水乙醇4.8ml，用滤器过滤得到1ml溶液，加pbs至8ml，作为c液。另取交联类肝素0.5g，加0.5mol/l的硫酸溶液10ml，沸水下水解15min，定容至100ml，作为d液。分别取c液和d液各1ml，用改良的咔唑法测定溶液中糖醛酸的质量浓度。按照以下公式计算降解率：降解率（%）=。结果如表2所示：表2交联硫酸软骨素类化合物的降解率产品24h降解率%48h降解率%72h降解率%交联硫酸软骨素6.989.7614.47硫酸软骨素---->95交联类肝素7.8511.5620.35类肝素---->95由表2数据可知，相比于未交联的硫酸软骨素和类肝素，采用本发明中的方法交联后的硫酸软骨素和类肝素性质稳定，抗降解能力明显增强。实施例5交联硫酸软骨素软膏以及交联类肝素软膏的制备（1）交联硫酸软骨素软膏配方：交联硫酸软骨素3.2g，甘油12g，脂肪醇聚氧乙烯醚2.5g，液体石蜡15g，单甘酯17g，尼泊金乙酯0.3g，纯净水50g；制备方法：取甘油、脂肪醇聚氧乙烯醚、纯净水（45g）加热至80℃，取交联硫酸软骨素加入5g水用胶体磨粉碎，加入上述溶液搅拌使溶为水相，备用；另取液体石蜡、单甘酯、尼泊金乙酯加热至80℃，搅匀为油相；将油相缓缓加入水相中，搅拌至冷，即得。（2）交联类肝素软膏配方：交联类肝素3.2g，甘油12g，脂肪醇聚氧乙烯醚2.5g，液体石蜡15g，单甘酯17g，尼泊金乙酯0.3g，纯净水50g；制备方法：取甘油、脂肪醇聚氧乙烯醚、纯净水（45g）加热至80℃，取交联类肝素加入5g水用胶体磨粉碎，加入上述溶液搅拌使溶为水相，备用；另取液体石蜡、单甘酯、尼泊金乙酯加热至80℃，搅匀为油相；将油相缓缓加入水相中，搅拌至冷，即得。实施例6体外消炎实验小鼠50只，雌雄各半，体重（20±2g）随机分为5组：对照组，交联硫酸软骨素软膏高剂量组，交联硫酸软骨素软膏低剂量组，交联类肝素软膏高剂量组，交联类肝素软膏低剂量组，每组10只。麻醉后，在右耳两侧涂对二甲苯致炎，0.02ml每只。30min后，在炎症部位涂抹交联硫酸软骨素软膏高剂量，交联硫酸软骨素软膏低剂量，交联类肝素软膏高剂量，交联类肝素软膏低剂量，左耳不处理。4h后，脱颈椎致死，剪下双耳，用打孔器在同一部位打下圆耳片，称重，肿胀度为左耳减去右耳的重量，并按照以下公式计算肿胀抑制率：肿胀抑制率（%）=×100%。表3交联硫酸软骨素类化合物对皮肤炎症抑制组别剂量（mg）肿胀度（%）肿胀抑制率对照组016.01±1.32--交联硫酸软骨素软膏高剂量组350.011.05±1.3630.98交联硫酸软骨素软膏低剂量组100.012.88±1.2819.55交联类肝素软膏高剂量组350.05.96±1.3362.77交联类肝素软膏低剂量组100.06.85±1.2957.21由表3数据可知，采用本发明中的方法交联后的硫酸软骨素和类肝素生物活性良好，并没有因为交联而影响抗炎活性。当前第1页12