一种重组RecA*蛋白及其表达方法和应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种重组reca*蛋白序列及其表达方法和应用

背景技术：

体外核酸快速扩增技术是一种可使微量核酸在体外高效快速扩增的技术，自问世以来，被广泛应用于分子生物学、医学和法理鉴定等领域，并被不断改进，以使其功能和适应性更为广泛。重组酶介导扩增法是在现有体外核酸扩增原理的基础上发展起来的恒温体外快速扩增核酸技术。

重组酶核酸等温扩增法(raa)利用重组酶、单链结合蛋白和dna聚合酶代替了传统pcr的热循环解链过程，实现了在37℃恒温下的核酸快速扩增，无需特殊的辅助仪器，对操作人员的要求也不高，具备简单、节能、便携、快速等特点，有望在不远的将来取代传统的热循环pcr反应.重组酶核酸等温扩增反应在现场快速检测(poct)环景中有巨大的应用潜力。reca重组酶是e.coli中负责同源重组交换的重要功能蛋白。reca与dna形成复合功能体，与dsdna中的同源序列形成配对，然后形成d-环，打开双链结构。在聚合酶存在的情况下，可以利用重组酶该特性快速扩增反应。但是在体外环境中reca与dna结合能力较弱，直接限制了扩增效率。阻碍了重组核酸等温扩增技术在环境监测、食品安全以及临床诊断等领域的病原微生物现场快速检测。如何通过提高reca重组酶与dna结合效率是直接决定raa扩增效率的关键因素。

技术实现要素：

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组reca*蛋白，通过修改绿脓杆菌reca蛋白酶的特定氨基酸序列，使其与dna结合能力增强并且催化水解atp能力提高，从而大大提高了raa扩增反应效率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案内容具体如下：

一种重组reca*蛋白，其是通过对绿脓杆菌reca氨基酸序列(seqidno.2)中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组reca*蛋白，该重组reca*蛋白的多肽具有为seqidno.1的氨基序列。

作为进一步优选的方案，本发明所述的重组reca*蛋白，其特征在于，所述重组reca*蛋白的多肽编码核苷酸序列为seqidno.3。

本发明还提供了一种重组载体，包括原始载体和本发明所述的重组reca*蛋白的核苷酸序列。

本发明还提供了一种的重组reca*蛋白的表达方法，包括：

编码核苷酸序列步骤：编码重组reca*蛋白的多肽的核苷酸序列seqidno.3；

构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列seqidno.3与原始载体进行重组，获得重组载体；

表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。

本发明还提供了一种蛋白-dna复合物，其是由本发明所述的重重组reca*蛋白与dna结合后形成的大分子复合物。

本发明还提供了一种reca*蛋白在恒定温度下特异性扩增dna的方法，包括将重组reca*蛋白，单链结合蛋白ssb，聚合酶bst，dna模版，dntp，正向引物和反向引物在扩增反应体系中孵育，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。

作为进一步优选的方案，本发明所采用的扩增反应体系tris-hcl50mm、kcl60mm、二硫苏糖醇2mm、甜菜碱1m、海藻糖5.5％、peg5.5％、bsa0.1mg/ml；所述反应酶系包含dntps200μm、聚合酶bst50u、单链重组reca*蛋白262ng/μl、e.colireca蛋白360ng/μl；上游引物和下游引物浓度均为200nm；浓度为5mm的氯化镁。

一种核酸扩增试剂盒，包括本发明所述的重组reca*蛋白。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1.本发明所述的重组reca*蛋白相对于reca蛋白，催化水解dna效率增加，与dna结合能力增更强，能形成更稳定的蛋白-dna复合物。

2.本发明所述的重组reca*蛋白应用于raa扩增检测试剂盒中，能够大大提高了raa扩增反应效率。

上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本发明的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下特举较佳实施例，并配合附图，详细说明如下。

附图说明

图1为reca蛋白与重组reca*蛋白进行重组等温扩增反应电泳结果对比图，其中，a：dnamarker、b：reca进行重组等温扩增反应、c：reca*进行重组等温扩增反应。

图2为reca蛋白与重组reca*蛋白分别与dna结合后的电泳结果图，其中a：dnamarker、b：500ngdna、c：5ugreca与dna、d：5ugreca*与dna。

图3为reca*与reca水解atp效率对比曲线图；

图4为reca*与reca结合dna效率对比曲线图。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明为达成预定发明目的所采取的技术手段及功效，以下结合附图及较佳实施例，对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效，详细说明如下：

一种重组reca*蛋白，其是通过对绿脓杆菌reca氨基酸序列(seqidno.2)中的第62位、69位、73位以及85位的氨基进行修饰后获得的多肽，命名为重组reca*蛋白，该重组reca*蛋白的多肽具有为seqidno.1的氨基序列。

作为进一步优选的方案，本发明所述的重组reca*蛋白，其特征在于，所述重组reca*蛋白的多肽编码核苷酸序列为seqidno.3。seqidno.3序列如下：

本发明还提供了一种重组载体，包括原始载体和本发明所述的重组reca*蛋白的dna片段，其根据氨基酸密码子对照表，dna序列可以翻译成reca*的序列(seqidno.1)，其中一种优选dna序列为seqidno.3。所述原始载体可以为pet-28a载体、pbr322载体、psc101载体中的一种，所述原始载体中可以包含一种或多种抗性基因，所述抗性基因具体可以选自但不限于抗青霉素基因、抗卡那霉素基因等。所述原始载体还可以包含一种或多种纯化标签，例如可以是6*his标签、10*his标签、gst标签等。

本发明还提供了一种的重组reca*蛋白的表达方法，包括：

编码核苷酸序列步骤：编码重组reca*蛋白的多肽的核苷酸序列seqidno.3；

构建重组载体的步骤：将上述核苷酸序列seqidno.3与原始载体进行重组，获得重组载体；

表达步骤：将上述重组载体转入表达系统中进行表达，筛选成功转入的菌株，经过破碎、离心、纯化处理后得到目的蛋白。

本发明所述的表达系统可以为大肠杆菌表达系统，酵母表达系统，哺乳动物表达系统或昆虫表达系统。作为一种优选，选用大肠杆菌pet表达系统，进一步作为优选大肠杆菌bl21(de3)表达系统。将上述含有reca*dna序列(seqidno.5)的重组载体转入大肠杆菌bl21(de3)表达系统。利用抗性琼脂平板筛选成功转入reca*载体的重组大肠杆菌，挑选单克隆菌株，扩大培养，离心收集培养液和大肠杆菌，破碎大肠杆菌，例如用超声方法或者酶消化方法，离心收集上清与大肠杆菌菌沉淀，纯化培养液，上清和大肠杆菌沉淀得到目的蛋白；纯化方法可以是亲和层析法，分子筛法等。

本发明还提供了一种蛋白-dna复合物，其是由本发明所述的重组reca*蛋白与dna结合后形成的大分子复合物。

本发明还提供了一种reca*蛋白在恒定温度下特异性扩增dna的方法，包括将重组reca*蛋白，单链结合蛋白ssb，聚合酶bst，dna模版，dntp，正向引物和反向引物在扩增反应体系中孵育，用苯酚氯仿提取反应产物，用乙醇沉淀。

作为进一步优选的方案，本发明所采用的扩增反应体系tris-hcl50mm、kcl60mm、二硫苏糖醇2mm、甜菜碱1m、海藻糖5.5％、peg5.5％、bsa0.1mg/ml；所述反应酶系包含dntps200μm、聚合酶bsu50u、单链重组reca*蛋白262ng/μl、e.colireca蛋白360ng/μl；上游引物和下游引物浓度均为200nm；浓度为5mm的氯化镁。

一种核酸扩增试剂盒，包括本发明所述的重组reca蛋白。

实施例1

用重组reca*蛋白进行重组反应，反应条件如下：

tris-hcl(ph8.3)50mm、kcl60mm、二硫苏糖醇2mm、甜菜碱1m、海藻糖5.5％、peg5.5％、bsa0.1mg/ml；所述反应酶系包含dntps200μm、聚合酶bsu50u、单链reca*蛋白262ng/μl、e.colireca蛋白360ng/μl；dna底物(奇异变形杆菌)50ng，上游引物(fp)下游引物(rp)浓度均为200nm；氯化镁，浓度5mm。

上游引物(seqidno.4)：tattcctaaatatagtcaagtttcttgtgatgt

下游引物(seqidno.5)：attaaaacgaaaaatattaagaatatcgacccc。

在37℃继续孵育30分钟，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。然后3％琼脂糖凝胶上观察扩增结果并对扩增产物进行测序。测序的产物序列为seqid

对比实施例1

用reca蛋白和重组reca*蛋白分别同时进行重组反应，反应条件如下：tris-hcl(ph8.3)50mm、kcl60mm、二硫苏糖醇2mm、甜菜碱1m、海藻糖5.5％、peg5.5％、bsa0.1mg/ml；所述反应酶系包含dntps200μm、聚合酶bsu50u、单链结合蛋白262ng/μl、reca蛋白/重组reca*蛋白360ng/μl；上游引物(fp)下游引物(rp)浓度均为200nm；氯化镁，浓度5mm。反应体系50微升。在37℃孵育30分钟。取10微升反应样品，加入2ul6x上样缓冲液(0.25％溴酚蓝，36％蔗糖和30mmedta)。3％琼脂糖凝胶上观察扩增结果。

上游引物(seqidno.4)：tattcctaaatatagtcaagtttcttgtgatgt

下游引物(seqidno.5)：attaaaacgaaaaatattaagaatatcgacccc。扩增结果参见图1。图1的结果表明：利用reca重组酶与修饰后重组reca*蛋白组酶，分别同时进行重组等温扩增，reca*组扩增得到目的大小条带，扩增效率显著增强。

实施例2

利用重组reca*蛋白进行重组反应，反应条件如下：tris-hcl(ph8.3)50mm、kcl60mm、二硫苏糖醇2mm、甜菜碱1m、海藻糖5.5％、peg5.5％、bsa0.1mg/ml；所述反应酶系包含dntps200μm、聚合酶bsu50u、单链结合蛋白262ng/μl、e.colireca蛋白360ng/μl；上游引物(fp)下游引物(rp)浓度均为200nm；氯化镁，浓度5mm。在37℃继续孵育30分钟，用苯酚氯仿提取反应，用乙醇沉淀。4％琼脂糖凝胶上观察扩增结果。

上游引物(seqidno.6)：atttcataaccccctgtttattgtgttaatgg

下游引物(seqidno.7)：attttgttaaactcaaacgtgataatgagaat

对比例2

将纯化后的reca蛋白按照上述实施例2的步骤进行重组扩增反应。电泳结果参见图2。

图2中a：dnamarker；b：500ngdna；c：5ugreca与dna；d：5ugreca*与dna；由于dna带负电，在电场的作用下做迁移运动。蛋白结合dna后形成蛋白-dna大分子复合物，迁移速率降低。通过dna电泳实验，与天然的reca蛋白相比，突变修饰后的reca*与dna结合能力更强，形成更稳定的蛋白-dna复合物，迁移速率明显降低。

效果检测

1.reca*与reca水解atp效率对比

检测原理：atpase水解atp释放adp和游离磷酸根离子。通过反应，游离的磷酸根离子生成稳定的显色基团，在650nm测量其吸光值。

采用atpase酶活检测试剂盒(品牌：abcam，货号：ab234055)测量reca与reca*催化atp水解效率。根据说明书要求，配置测试样本(reca(2.5um)，reca*(2.5um))，atpase阳性对照，磷酸盐标准品(0，1，2，3，4and5nmol/孔)加入到96微孔板中。向测试样品孔和阳性对照孔中加入反应底物(100ul)。然后所有孔，包括磷酸盐标准品，atpase阳性对照，测试样品，添加30μl显色剂。在25℃下孵育，并在650nm下每5分钟测量一次吸光值。根据磷酸盐标准品与对应吸光值(30分钟)制作标准曲线，计算不同时间点下，reca与reca*产生磷酸盐的量，然后计算水解atp的量，并绘制得到reca*与reca水解atp效率曲线(参见图3)。

图3的结果表明：reca*水解atp效率明显高于与reca的水解atp效率。

2.reca*与reca结合dna效率对比

用恒定量的dna孵育浓度越来越高的reca或reca*，并使其通过碱处理的硝化纤维素和deae过滤器。与蛋白结合的dna被拦截在膜上。未与蛋白结合的dna流过膜。通过检测穿过膜的液体中dna的含量，用总量减去剩余dna的量，得到与蛋白结合dna量。结合的百分比代表与总dna相比与蛋白结合的dna的量。绘制曲线图(参见图4)。

图4的结果表明reca*与dna的结合效率明显高于与reca与dna的结合效率。

上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

序列表

<110>深圳易致生物科技有限公司

<120>一种重组reca*蛋白及其表达方法和应用

<130>深圳易致生物科技有限公司

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