一种芽孢杆菌及其合成纳米硒的方法与流程

本发明涉及微生物培育应用技术领域，更具体地说，涉及一种芽孢杆菌及其合成纳米硒的方法。

背景技术：

硒是生物体必需的一种微量元素，研究表明其对微生物的新陈代谢、动植物的生长发育、甚至对人类自身的健康都有着不可忽略的作用。在自然界中元素硒通常以有机硒和无机硒两种形式存在，有机硒通常以硒代氨基酸的形式存在于生物体内，参与生物体中的各种生命活动；无机硒通常是以硒酸盐(vi)、亚硒酸盐(iv)、单质硒(0)和金属硒化合物(-ii)四种形式存在于岩石、土壤、自然水体以及含硒废水等环境介质中。但通常无机硒中的硒酸盐和亚硒酸盐对生物具有较大的生物毒性，相关实验验证亚硒酸钠对大鼠的ld50为7mg/kg，硒酸钠对大鼠的ld50为1.6mg/kg。然而，在过去几十年间，由于煤矿开采、化工制造等工业活动使得seo3^2-以及seo4^2-在水体中严重富集，对生态环境造成了严重的破坏。

对于含硒废水的处理，传统的处理方法主要为物理处理法和化学处理法。物理法中常用的技术为纳滤、离子交换、反渗透等，虽然该方法已在处理城市饮用水和废水中得到了一定的应用，但是由于膜系统在使用过程中存在能耗高、运行维护费用高等问题，使其在实际应用中存在一定的局限性。化学法主要是利用诸如氧化铁等化学试剂将se(iv/vi)还原为单质硒沉淀，再进一步利用化学吸附剂吸附以达到将其彻底去除的目的，但该方法可能会使用有毒的化学试剂从而对环境造成二次污染。近年来，据文献报道某些微生物具有将seo3^2-和seo4^2-还原生成单质硒的能力。zhang等人利用嗜碱假单胞菌将seo3^2-还原为粒径为200nm的单斜硒纳米颗粒；dwivedi等利用pseudomonasaeruginosajs-11将seo3^2-还原为粒径为21nm的球形硒纳米颗粒。在此过程中，微生物能将毒性较大且对环境污染较为严重的seo3^2-和seo4^2-还原为毒性较小且对环境更为友好的se⁰。同时，生物合成的纳米硒具有良好的光电特性，可以广泛应用于医疗、电气和制造工业等。但目前发现的菌株大多只可在较低浓度下还原seo3^2-，对于能在高浓度条件下还原seo3^2-的菌株有待进一步开发。

技术实现要素：

本发明的目的是开发一种在高浓度条件下还原seo3^2-的菌株。

为了达到上述目的，本发明提供了一种芽孢杆菌，芽孢杆菌(拉丁文分类命名为bacillussp.sl)，所述菌株的登记入册编号为cgmccno.19051，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101保藏日期为2019年11月28日。

本发明所述的芽孢杆菌，2018年于贵州省开阳县富硒茶厂的泥土样品经过7次平板稀释涂布法，将所述泥土样品涂布在lb培养基上，30±0.5℃，150±5r/min条件下培养获得菌液。所述芽孢杆菌的菌株的细胞形态为杆状，大小为3-5μm。所述lb培养基组分为：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水。

所述芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，菌体为杆状，其16srrna基因序列的genbank登录号为mn371282。

一种芽孢杆菌合成纳米硒的方法，具体的方法如下：

s1、处理lb培养基；

所述的lb培养基在121℃高温，0.15mpa高压的条件下，灭菌20min后备用；加入碱液或酸液调配lb培养基的ph值在3.0-10.0；

s12、接种芽孢杆菌合成纳米硒；

在s11所述的lb培养基中加入终浓度分别为1mmol/l-50mmol/l的na2seo3溶液后，接入接菌量为2％(v/v)的所述芽孢杆菌，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养2h-11h；

优选的是，所述lb培养基的ph值在5.0-8.0。

优选的是，所述na2seo3溶液终浓度为5mmol/l-20mmol/l。

优选的是，所述接种芽孢杆菌合成纳米硒培养时间为2-8h。

本发明所述芽孢杆菌能够耐受较高浓度的seo3^2-，且具有将其还原为不同粒径的单质纳米硒颗粒的能力。

附图说明

图1菌株sl的sem图。

图2菌株sl的系统发育树。

图3菌株sl在lb培养基中的生长曲线。

图4不同seo3^2-浓度下菌株sl对seo3^2-的还原率。

图5不同ph下菌株sl对seo3^2-的还原率。

图6菌株sl合成硒纳米硒比例尺100nm的tem图。

图7菌株sl合成硒纳米硒比例尺500nm的tem图。

图8菌株sl合成纳米硒过程中胞外eps随时间变化图。

具体实施方式

本发明提供了一种芽孢杆菌，所述芽孢杆菌的菌株登记入册编号为cgmccno.19051，保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏日期为2019年11月28日。

本发明所述的芽孢杆菌，2018年于贵州省开阳县富硒茶厂的泥土样品经过7次平板稀释涂布法，将所述泥土样品涂布在lb培养基上，30±0.5℃，150±5r/min条件下培养获得菌液。所述芽孢杆菌的菌株的细胞形态为杆状，大小为3-5μm。所述lb培养基组分为：nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水。

所述芽孢杆菌属于革兰氏阳性菌，菌体为杆状，其16srrna基因序列的genbank登录号为mn371282。

本发明还提供了一种芽孢杆菌合成纳米硒的方法，具体的方法如下：

s1、处理lb培养基；

所述的lb培养基在121℃高温，0.15mpa高压的条件下，灭菌20min后备用；加入碱液或酸液调配lb培养基的ph值在3.0-10.0；所述lb培养基的ph值在5.0-8.0时，反应体系中seo3^2-的还原率均达到98％以上；

s12、接种芽孢杆菌合成纳米硒；

在s11所述的lb培养基中加入终浓度分别为1mmol/l-50mmol/l的na2seo3溶液后，接入接菌量为2％(v/v)的所述芽孢杆菌，在30±0.5℃，150±5r/min条件下培养2h-11h；所述na2seo3溶液终浓度为5mmol/l-20mmol/l时，na2seo3溶液终浓度为5mmol/l其seo3^2-的还原率达到最大，至20mmol/l后其seo3^2-的还原率会随之下降。所述接种芽孢杆菌合成纳米硒培养时间为2-8h。培养2-8h时，所述芽孢杆菌的菌株处于对数生长期。

实施例1：

本发明所述芽孢杆菌菌株sl的获得：2018年于贵州省开阳县富硒茶厂的泥土样品经过7次平板稀释涂布法，将样品涂布在lb培养基(nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水)上，30±0.5℃，150±5r/min条件下培养获得菌液。菌株sl的细胞形态为杆状，大小为3-5μm。如图1所示，所述芽孢杆菌菌株sl的扫描电镜照片。

所述芽孢杆菌菌株于2019年11月28日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：cgmccno.19051。

实施例2：所述芽孢杆菌菌株的16srrna基因分子鉴定

提取芽孢杆菌sl的基因组dna，通过pcr扩增16srrna基因序列，利用blast程序对序列进行同源性对比，得到与其最相近的菌属为芽孢杆菌，二者16srrna基因序列相似性为100％，因此判定sl为芽孢杆菌。如图2所示，所述菌株16srrna基因的系统发育树，sl菌株的16srrna基因序列如下：

ggctcaggatgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcgaatggattaagagcttgctcttatgaagttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccataagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggataacattttgaaccgcatggttcgaaattgaaaggcggcttcggctgtcacttatggatggacccgcgtcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttagggaagaacaagtgctagttgaataagctggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggtggtttcttaagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggagggtcattggaaactgggagacttgagtgcagaagaggaaagtggaattccatgtgtagcggtgaaatgcgtagagatatggaggaacaccagtggcgaaggcgactttctggtctgtaactgacactgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgaagttaacgcattaagcactccgcctggggagtacggccgcaaggctgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgaaaaccctagagatagggcttctccttcgggagcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccatcattaagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagagctgcaagaccgcgaggtggagctaatctcataaaaccgttctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtggggtaacctttttggagccagccgcctaaggtgggacagatgattggggtgaagtc

实施例3：所述芽孢杆菌菌株sl在lb培养基中的生长曲线

利用实施例1中的菌液，采用121℃，20min高压灭菌的lb培养基(nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水、ph6.0)，30±0.5℃，150±5r/min下培养，接菌量为2％(v/v)。如图3所示，所述芽孢杆菌菌株sl的生长情况，菌株生长10±1h进入稳定期，2-8h为对数生长期。

实施例4：不同seo3^2-浓度下所述芽孢杆菌菌株sl对seo3^2-的还原率

将实施例1中的菌液，采用121℃，20min高压灭菌的lb培养基(nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水、ph6.0)并在培养基中加入终浓度分别为1、5、10、20、50mmol/l的na2seo3溶液，接菌量为2％(v/v)。培养12h后，将所得菌液分别在10000±500r/min，5±1min条件下离心，之后取1ml上清液测定反应体系中剩余的seo3^2-浓度。seo3^2-浓度采取抗坏血酸和盐酸还原法测定。seo3^2-在强酸溶液中能被抗坏血酸还原为单质的硒，溶液呈现橙红色，于500nm处的吸光度值与seo3^2-浓度成线性关系。在本实验中，将上述得到的1ml上清液加入到0.5ml4mol/l盐酸和1ml1mol/l抗坏血酸中，反应10min中后，于500nm波长下测定吸光度值，根据标准曲线(y＝0.0046x+0.16908,r²＝0.99)计算样品中seo3^2-浓度，并计算其还原率，结果如图4所示。当na2seo3浓度为5mmol/l时，其seo3^2-的还原率达到最大，为98.67％，说明在此浓度下菌体能够与na2seo3溶液充分接触；而随着na2seo3浓度增加到20mmol/l时，其seo3^2-的还原率会随之下降，但由图可知所述芽孢杆菌菌株sl对高浓度的na2seo3具有较好的耐受能力。

实施例5：不同ph下所述芽孢杆菌菌株sl对seo3^2-的还原率

利用naoh和hcl溶液将lb培养基(nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水)的ph分别调至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0以及10.0，并在121℃条件下高压灭菌20min，灭菌完成后加入终浓度为1mmol/l的na2seo3溶液中，接种量为2％(v/v)，培养至对数末期。随后将得到的菌在10000±500r/min，5±1min条件下离心，并取1ml上清液测定其中的seo3^2-剩余浓度。与实施例4相同，seo3^2-浓度采取抗坏血酸和盐酸还原法测定。如图5所示，当培养基ph为5.0-8.0时，反应体系中seo3^2-的还原率均达到98％以上，其中以ph为6.0的还原率最高，由此说明该条件为菌株sl合成纳米硒的最佳ph值；而当ph过酸或过碱时，体系中seo3^2-的还原率均有所下降。

实施例6：所述芽孢杆菌菌株sl合成硒纳米硒的tem图。

将实施例1中的菌液加入经过高压灭菌(121℃，20min)的lb培养基(nacl10g/l、胰蛋白胨10g/l、酵母粉5g/l、去离子水、ph6.0)，并加入终浓度为1mmol/l的na2seo3溶液培养。将最终合成的产物进行透射电镜(transmissionelectronmicroscope，tem)表征，结果如图6、图7所示。该菌株合成的纳米硒颗粒为球形，分散性较好，其平均粒径为150.47nm，最大粒径为226.00nm，最小为44.15nm。

实施例7：

如图8所示，所述芽孢杆菌菌株sl合成纳米硒过程中胞外eps随时间变化图。

胞外聚合物(extracellularpolymericsubstance,eps)是微生物在其胞外所分泌的高分子聚合物，主要由多糖和蛋白质组成。对于微生物而言，eps具有着重要的生理功能，它们不仅能富集环境中的营养成分，还能抵御杀菌剂和有毒物质对细胞的危害。

而在本实验中为了考察生物合成纳米硒过程中seo3^2-和se⁰对微生物的毒性的影响，我们选用eps作为指标进行考察。利用实施例6的方式培养菌株，并在24h内每隔4h进行取样，将取得的10ml样品在12000±500r/min，10min条件下离心，取上清液进行多糖和蛋白质浓度的测定。其中，多糖含量采用浓硫酸-苯酚法测定。多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物。实验中将1ml上清液加入1ml苯酚溶液中，摇匀，缓慢加入5ml浓硫酸，加热15±1min后冷却至室温，静置20min，于490nm波长下测定吸光度，并与绘制的多糖标准曲线(y＝0.1112x+0.0542,r²＝0.9995)对照，计算多糖含量。蛋白质含量采用考马斯亮蓝法测定。在酸性条件下，考马斯亮蓝g-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465nm红移为595nm，同时颜色也由棕色变为蓝色，且其在595nm处的吸光度值与蛋白质浓度成正比。在本实验中取300μl上清液，加入1.5ml考马斯亮蓝试剂，摇匀后静置2min，以去离子水为参比，在595nm处测定吸光度，与标准曲线(y＝0.0082x+0.5228，r²＝0.996)对照，计算蛋白质的含量，结果如图8所示。反应12h时，体系内的eps含量最高，12h后其含量逐渐下降。该结果与菌株的生长曲线具有一致性。推测是由于在12h前，培养基中亚硒酸盐含量高，刺激菌株分泌大量eps以免受到亚硒酸盐毒性干扰。在12h后，亚硒酸盐被还原为纳米硒，毒性降低，菌株分泌的eps也随之减少。同时蛋白质作为纳米硒的封端剂被利用，培养基中的eps总含量下降。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。