与羊绒细度性状相关的分子标记及其检测引物和应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与羊绒细度性状相关的分子标记及其检测引物和应用。

背景技术：

绒山羊有很多种，但基本上可分为两大类：一类是以产绒为主的俄罗斯地区绒山羊，其特点是毛短绒长，毛比绒少；另一类是以我国为代表的毛长绒短，毛比绒多的绒山羊。绒山羊对人类社会的日常生活至关重要，以其纤细的羊绒闻名于世，由于羊绒是高档且昂贵的纺织原料，所以羊绒直径成为决定纤维价值的重要因素之一。羊绒产于绒山羊皮肤次级毛囊，纤维直径为13～18μm，总产量较少，仅占所有动物纤维的百分之零点二左右，因而成为最珍贵的动物纤维型原材料。羊绒纤维的主要特点是柔软、轻薄、纤细、导热性小、具有纺纱性和可塑性等。羊绒和羊毛纤维的细度和长度决定着所有纺织产品的风格及性能，纤维直径越小，同等支数纱线中羊绒个数就越多，均匀度和强力就更好，所以纺纱制品的质量是由纤维细度决定的。羊绒细度是评价羊绒品质和衡量羊绒价格的关键，其表型特征的本质由基因表达决定，近年来，通过高通量数据解析及全基因组关联分析，逐步筛选出羊绒细度相关性状的候选基因，但羊绒细度关键调控基因、表达量及分子调节机制尚不明确。目前经高通量测序和生物信息分析发现，非编码rna在绒山羊品种间和品种内的不同个体皮肤、次级毛囊以及次级毛囊周期性生长发育中差异表达并调节羊绒细度相关靶基因。

研究证明nfkbia基因对羊绒品质有影响，nf-κb在调控细胞凋亡、细胞增殖和分化中也起着重要作用。在几种促凋亡机制的刺激下，nf-κb的激活会导致iκb-α在细胞质中的磷酸化和降解的发生。同时，nf-κb转移到细胞核并影响靶向基因的转录。nfkbia基因可能可以调控无汗性外胚层发育免疫缺陷(eda)，eda的出现是稀疏的头发、牙齿的免疫缺陷的特征。常染色体显性(ad)的eda的id，是由杂合的nfkbia突变引起的，是非常罕见的临床表现的特点，在很大程度上是未知的。遗传分析发现nfkbia基因中存在一种新的杂合错义突变，即p.ser36tyr，可导致nfkbia基因降解缺陷和nf-κb活化受损。nfkbia基因主要富集在nf-κb通路。rel/nuclearfactor-kappab(rel/nf-kappab)转录因子对细胞凋亡、细胞增殖和肿瘤发生的控制都有影响，研究发现，通过靶向过度表达超抑制因子ikappabα，可以选择性抑制小鼠皮肤中的rel/nf-kappab信号的表达，导致了凋亡细胞的基础频率的增加和鳞状细胞癌的自发发生。增生和毛囊变性的存在也很好的证明了rel/nf-kappab信号在正常表皮发育中的重要作用。此外，转基因皮肤对紫外线诱导的细胞凋亡具有很强的敏感性。由此表明rel/nf-kappab通路可能参与皮肤细胞凋亡和癌症的发生过程。rel/nf-kappab信号在正常的表皮发育过程中起着重要作用，特别是在毛囊和角质形成的细胞生长控制方面。以前的一项研究证实了nf-κb对小鼠表皮生长的抑制作用。研究多数证明了nfkbia基因在癌症上起作用，对细胞增殖、分裂有调控作用。

虽然，目前已有研究表明nfkbia基因可能调控羊绒生长，但关于羊绒细度的作用还没有被发现。

技术实现要素：

本发明实施例的目的在于提供一种与羊绒细度性状相关的分子标记，旨在解决背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种与羊绒细度性状相关的分子标记，包括绒山羊nfkbia基因的g1355a位点；所述g1355a位点的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示；所述g1355a位点的核苷酸序列中的r为a或g。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述g1355a位点在羊绒细度、产绒量、绒长和净绒率的优势基因型均为ag基因型。

本发明实施例的另一目的在于提供一种检测引物，所述检测引物用于检测上述的分子标记；所述检测引物用于检测如权利要求1或2所述的分子标记；所述检测引物包括nfkbia-1引物对、nfkbia-2引物对、nfkbia-3引物对、nfkbia-4/5引物对和nfkbia-6引物对中的至少一种；所述nfkbia-1引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:2～3所示；所述nfkbia-2引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:4～5所示；所述nfkbia-3引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:6～7所示；所述nfkbia-4/5引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:8～9所示；所述nfkbia-6引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:10～11所示。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的分子标记在选育细绒绒山羊中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的检测引物在制备检测与羊绒细度性状相关的分子标记的试剂盒中的应用。

本发明实施例的另一目的在于提供一种上述的检测引物在检测绒山羊nfkbia基因中突变位点的应用。

作为本发明实施例的另一个优选方案，包括以下步骤：

获取待检测绒山羊的dna，得到dna模板；

将所述检测引物和所述dna模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

对所述pcr扩增产物进行测序，得到测序基因序列；

将所述测序基因序列与绒山羊nfkbia标准基因序列进行比对，得到待检测绒山羊nfkbia基因中突变位点。

本发明实施例提供的一种与羊绒细度性状相关的分子标记，其包括绒山羊nfkbia基因的g1355a位点；由于g1355a位点在羊绒细度、产绒量、绒长和净绒率的优势基因型均为：ag>gg>aa。因此，g1355a位点的ag基因型可用于细绒绒山羊的选育，以改善现有辽宁绒山羊的羊绒品质较差等问题。

附图说明

图1为不同绒山羊样本的dna模板的琼脂糖凝胶电泳图。

图2为五组引物对分别对应得到的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为对pcr扩增产物进行测序得到的测序基因序列与nfkbia标准基因序列比对结果图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

该实施例提供了一种与羊绒细度性状相关的分子标记，其包括绒山羊nfkbia基因的g1355a位点；所述g1355a位点的核苷酸序列如序列表seqidno:1所示，具体为：acrccactccacttggctg；其中，g1355a位点的核苷酸序列中的r为a或g；g1355a位点的ag基因型可以用于细绒绒山羊的选育。

另外，该实施例还提供了一种用于检测上述的分子标记检测引物，具体的，该检测引物包括五组引物对，具体为所述检测引物用于检测如权利要求1或2所述的分子标记；所述检测引物包括nfkbia-1引物对、nfkbia-2引物对、nfkbia-3引物对、nfkbia-4/5引物对和nfkbia-6引物对中的至少一种；所述nfkbia-1引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:2～3所示；所述nfkbia-2引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:4～5所示；所述nfkbia-3引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:6～7所示；所述nfkbia-4/5引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:8～9所示；所述nfkbia-6引物对的核苷酸序列如序列表seqidno:10～11所示；该检测引物还可以用于检测绒山羊nfkbia基因中突变位点。

其中，上述五组引物对是根据绒山羊nfkbia基因序列(登录号为nc_019475.2)，并用primer5.0软件对nfkbia基因cds区进行特异性引物设计而得到的，其由上海生工合成的。上述各引物对的序列、退火温度、扩增片段大小如下表1所示。

表1

实施例2

该实施例提供了一种利用上述检测引物检测绒山羊nfkbia基因中突变位点的方法，包括以下步骤：

s1、获取待检测绒山羊的dna，得到dna模板；

s2、将所述检测引物和所述dna模板进行pcr扩增，得到pcr扩增产物；

s3、对所述pcr扩增产物进行测序，得到测序基因序列；

s4、将所述测序基因序列与绒山羊nfkbia标准基因序列进行比对，得到待检测绒山羊nfkbia基因中突变位点。

具体的，在实际的应用中，上述方法可用于寻找与辽宁绒山羊羊绒细度经济性状相关的标记基因型的实验中，其实验方法可包括以下步骤：

(1)在辽宁省辽阳市绒山羊种羊场，共采集1140只辽宁绒山羊、胎次在1～4胎的绒山羊血样和绒样(血样和绒样由置于实验室保存)；其中，血样可在绒山羊颈静脉采集血样(血液:acd＝6:1)，放置在-20℃条件下进行保存。另外，羊绒生长性能的测定由辽宁省畜牧科学研究院完成，用“绒山羊精准化育种管理系统”统计和行数据管理分析，形成分析报告。

(2)取1ml上述血样进行离心(5000rpm，5min)，弃上清液，保留沉淀，重复洗涤3次，得到沉淀物，倒干。接着，将沉淀物与450ml细胞裂解液、6ml蛋白酶k进行混合，并水浴处理4h(水浴温度可控制在55～66℃)，得到混合液；然后，用等体积的酚和氯仿混合溶剂(酚和氯仿的体积比为25:24)抽提2次上述合液(12000rpm，5min)，用2倍体积无水乙醇进行沉淀处理(-20℃，30min)；当发生絮状沉淀时(12000rpm，5min)，弃掉上清，沉淀物用800ml70％的乙醇清洗(12000rpm，3min)，弃上清液，干燥，然后紫外分光光度法测量od值，计算od260/od280。最后加te缓冲液50ml溶解，得到dna模板，并置于-20℃条件下保存，备用。

(3)将实施例1提供的五组引物对与上述得到的dna模板进行pcr反应。具体的，pcr反应体系为25μl，其包括：12.5μl的2×taqmastermix，1.0μl的上游引物，1.0μl的下游引物，1.0μl的dna模板，9.5μl的灭菌三蒸水；pcr反义条件如下表2所示。按照以下条件进行扩增，结束后取5μlpcr扩增产物同1μl加样缓冲液混匀，点样后电泳(1.0％琼脂糖凝胶)，同时加5μlmarker作参照，120v电压电泳20min左右。电泳结束检测目的条带，拍照并标记，送往上海生工公司双向测序，进行序列比对和snp图谱及突变位点碱基识别和基因型确定。

表2

上述实验的结果如下：

1、按照上述方法得到的不同绒山羊样本的dna模板的琼脂糖凝胶电泳图如附图1所示。图1中的1～6分别对应同绒山羊样本的dna模板。

2、上述五组引物对分别对应得到的pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图如附图2所示。另外，将对上述pcr扩增产物进行测序得到的测序基因序列与nfkbia标准基因序列进行比对，比对结果如附图3所示，从图中可以看出，该批绒山羊在cds区共发生15个突变位点，且高度连锁，g1355a为第一种多态类型，g1547与c952g、a976g、c2053t、c2058、a2063g、c2096t、t2103、a2136c、g2288a、g2337a、a2390g连锁形成第二种多态类型，a2420g与t2423c连锁形成第三种多态类型。

3、nfkbia基因有效位点如表3所示。

表3

由表3可知，在辽宁绒山羊群体中，这g1355a、g1547a和a2420g这3种类型的多态基因频率和基因型频率差异较明显，a和g为优势等位基因，频率大于0.5；c和g等位基因在辽宁绒山羊群体中是优势基因且纯合性比较好；在辽宁绒山羊中gg、aa基因型占优势。g1355a和a2420g多态信息含量pic都小于0.25，是低度多态，说明此位点变异程度较低，位点比较保守；两位点杂合度较低，说明遗传变异可能低；同时有效等位基因数也低，在保持等位基因能力时可能较差；χ²都大于1，且p值都小于0.05，属于非平衡状态，在世代遗传中基因频率和基因型频率没有稳定遗传，人为选择强度较大。

4、nfkbia基因替代效应分析结果如表4所示。

表4

由表4可知，nfkbia基因g1355a和a2420g位点的加性效应值都是负数，说明该位点的等位基因发生自然突变和替代是正效应，可对产绒性能提升70％以上。而g1547a对产绒性能是负调控，发生自然突变和替代会让产绒性能下降约40％。

5、nfkbia基因多态位点的产绒性能分析如表5所示。

表5

由表5可知，辽宁绒山羊nfkbia基因的三种多态类型之间的不同基因型在最大绒细度、最小绒细度和平均绒细度上差异不显著，说明群体中羊绒细度均值基本保持一致。但是，g1547a位点gg基因型的羊绒细度最小约14.9，g1355a位点ag基因型的羊绒产量和净绒率最高(p＜0.01)。不同位点不同基因型在羊绒长度上差异不显著。

6、3个snp位点群体产绒性能基因聚合分析结果如表6所示。

表6

如表6所示，据实验测定的辽宁绒山羊群体结果显示，g1547a在产绒量、绒长和净绒率的优势基因型是aa>gg，细度的优势基因型是aa<gg。g1355a在细度、产绒量、绒长和净绒率的优势基因型是ag>gg>aa。根据2个位点进行等位基因聚合，理想聚合可形成6种基因型组合，分别是aaaa、aagg、aaag、aggg、aaaa和aaaa。

7、经χ²检验数据可靠，故进行单倍型分析。其中，g1547a位点的2种基因型aa和gg与g1355a位点的3种基因型ag、aa和gg的群体产绒性能优劣单倍型组合预测和分析结果如表7所示。

表7

如表7所示，通过shesis(http://analysis.bio-x.cn/myanalysis.php)分析得知940只羊群体中可以形成3种单倍型h1:ag、h2:ga、和h3:gghe9种单倍型组合。其中综合产绒优势单倍型组合是h1h3:aggg，产容量、绒长和净绒率的优势单倍型组合是h3h3:gggg，细度的优势单倍型组合是h2h2:ggaa，产绒劣势单倍型组合是h1h1:aagg。

8、单倍型组合与生产性能关联分析的结果如表8所示。

表8

由表8可知，单倍型组合h1h1：aagg的羊绒产量最高；单倍型组合h2h2：ggaa的平均、最大和羊绒细度与其他组合显著不同；单倍型组合h1h3：agg的羊绒净产量最大；h1h3：aggg的最小绒细度最优。

综上所述，经群体基因型分析表明，g1547a位点在产绒量、绒长和净绒率的优势基因型是aa>gg，细度的优势基因型是aa<gg；而g1355a位点在细度、产绒量、绒长和净绒率的优势基因型均是ag>gg>aa。因此，g1355a位点的ag基因型可用于细绒辽宁绒山羊的选育。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110>沈阳农业大学

<120>与羊绒细度性状相关的分子标记及其检测引物和应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>19

<212>dna

<213>绒山羊(caprahircus)

<400>1

acrccactccacttggctg19

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

aacagtcctagcccgtcgtc20

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cagccgtgcacctttgg17

<210>4

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gaacactcagctcataataacctcg25

<210>5

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggcaaagcaaaataccagagg21

<210>6

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

aaagcagcacccacaacca19

<210>7

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

tctgggttctgaatggactttag23

<210>8

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gatccatgttgatgtatggcaga23

<210>9

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

ttgggactcacctcatcttctgt23

<210>10

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

agaatggggtccaggaatact21

<210>11

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

gttccagaccaggcagtgtg20