一种表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株ncu s6
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术领域，涉及一种表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株（staphylococcus caprae）ncu s6。
背景技术：[0002]
脂肪酶（1ipase，ec3.1.1.3）是一类特殊的酯键水解酶，可以催化酯类化合物的水解、醇解、酯化、酯交换以及化合物的合成等反应。其广泛来源于动物、植物和微生物中。哺乳动物的胰脏和脂肪组织中含脂肪酶较多；植物中含脂肪酶较多的是油料作物的种子，如蓖麻籽、油菜籽等；细菌、真菌和酵母中的脂肪酶含量更为丰富。由于微生物种类多、繁殖快、受季节等波动影响小，具有比动植物更广的作用ph和温度范围以及底物专一性，且微生物来源的脂肪酶一般都是分泌性的胞外酶，工业用途的酶制剂基本上都来源于微生物，因此微生物脂肪酶是工业用脂肪酶的重要来源，可应用于食品、医药、洗涤剂、纺织、生物柴油、造纸、皮革、化妆品和环境保护等多个工业领域。
[0003]
由于商业脂肪酶价格昂贵，使“采用脂肪酶催化樟树籽仁油等中碳链油脂与亚麻籽油等亚麻酸亚油酸系油脂进行酯化、酯交换而制备具有特殊生理功能的结构脂技术”的生产成本过高，故采用微生物脂肪酶用于制备基于樟树籽仁油、富含辛酸和癸酸及必需脂肪酸或功能脂肪酸的中长碳链功能油脂，可大幅降低中长碳链功能油脂生产成本。
[0004]
实施“采用脂肪酶催化樟树籽仁油等中碳链油脂与亚麻籽油等亚麻酸亚油酸系油脂进行酯化、酯交换而制备具有特殊生理功能的结构脂”的工业化生产的关键，是筛选出高产脂肪酶且耐中碳链脂肪酸（medium chain fatty acids，mcfa）型菌株，直接采用菌株发酵液催化中碳链油脂与亚麻酸亚油酸系油脂之间的酯化、酯交换，大幅降低结构油脂的生产成本。国内现无相关针对该问题的菌株筛选技术及实例报道，本发明使用营养肉汤培养基平板富集，三丁酸甘油酯平板法、脱脂奶平板法初筛，罗丹明b平板法、橄榄油摇瓶复筛等方法，自樟树籽仁油生产废渣周围下水道中筛选出耐中碳链脂肪酸、产脂肪酶能力强、适用于以中碳链油脂为原料制备结构油脂的菌株。
技术实现要素：[0005]
本发明的目的是提供一种表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株（staphylococcus caprae）ncu s6，它能高产脂肪酶且耐mcfa，适用于通过微生物酶法构建和制备一种基于樟树籽仁油、富含辛酸和癸酸及必需脂肪酸或功能脂肪酸的中长碳链功能油脂。
[0006]
本发明是通过以下技术方案实现的。
[0007]
表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株（staphylococcus caprae）ncu s6，已于2020年1月15日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），其简称为cgmcc，保藏编号为 cgmcc no.19356。
[0008]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6在营养琼脂培养基上培养24h后，菌落呈球形或稍呈椭圆形凸起、直径1-2mm，排列成葡萄状、边缘整齐，表面光滑，湿润并且不透明的菌落。革
兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态为圆球状，直径0.5～1.5μm左右，无芽孢、鞭毛和荚膜。该菌株的菌落形态和革兰氏染色后的细胞形态示于图1和图2中。
[0009]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6接触酶实验为阳性，氧化酶实验、血浆凝固酶实验为阴性，新生霉素敏感实验表现为敏感型，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，能水解底物如紫苏油、亚麻油、大豆油、米糠油、橄榄油。
[0010]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6的种子培养基配方为：葡萄糖10g，酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，nacl5g，水1000ml，ph7.0-7.5，121℃灭菌20min。种子培养条件为 ：37℃，200r/min，摇瓶培养24h。
[0011]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6的发酵产酶培养基优化配方为：葡萄糖5g，胰大豆蛋白胨25g，k2hp042.5g，nacl10g，水1000ml，ph7.0，接种量4%。发酵产酶培养的优化条件为：37℃，200r/min摇瓶培养。
[0012]
经发酵培养后，取发酵液，8000r/min离心30min，所得上清液即为胞外粗酶液。
[0013]
采用gb/t 23535-2009 脂肪酶制剂中规定的酸碱滴定法，测定粗酶液的脂肪酶活力。脂肪酶活力以脂肪酶活力单位表示，定义为1g固体酶粉（或1ml液体酶），在一定温度和ph条件下，1min水解底物产生1μmol的可滴定的脂肪酸，即为1个酶活力单位，以u/g（u/ml）表示。
[0014]
采用轻工业标准qb1502-92中规定的碘量法，测定粗酶液的果胶酶活力。果胶酶活力定义：1ml酶液，在40℃、ph为7.0条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个果胶酶酶活力单位。
[0015]
采用国标gb8276-2006中规定的碘量法，测定粗酶液的糖化酶活力。糖化酶活力定义：1ml酶液，在40℃、ph为7.0条件下，1h水解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖，即为1个糖化酶活力单位。
[0016]
采用国标gb23881-2009中规定的滤纸片法，测定粗酶液的纤维素酶活力。纤维素酶活力定义：1ml酶液，在40℃、ph为7.0条件下，每分钟水解滤纸片，产生1.0μg的葡萄糖，即为1个纤维素酶活单位。
[0017]
采用国标gb24401-2009中规定的碘比色法，测定粗酶液的淀粉酶活力。淀粉酶活力定义：1ml酶液，在40℃、ph为7.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉，即为1个淀粉酶活力单位。
[0018]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养42h时，所产碱性脂肪酶活力为4290.4
±
1.6%u/ml；所产果胶酶活力为651.4
±
2.1%u/ml；所产糖化酶活力为1023.7
±
3.1%u/ml；所产淀粉酶活力为；10.6
±
1.9%u/ml；所产纤维素酶活力为6.1
±
2.5%u/ml。
[0019]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养51h时，所产碱性脂肪酶活力为4968.3
±
1.2%u/ml；所产果胶酶活力为786.5
±
1.4%u/ml；所产糖化酶活力为817.4
±
2.1%u/ml；所产淀粉酶活力为；36.2
±
1.5%u/ml；所产纤维素酶活力为21.9
±
1.3%u/ml。
[0020]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6在优化培养基及优化培养条件下，发酵培养60h时，所产碱性脂肪酶活力为4627.1
±
1.8%u/ml；所产果胶酶活力为342.4
±
2.1%u/ml；所产糖化酶活力为586.1
±
2.3%u/ml；所产淀粉酶活力为；19.2
±
0.9%u/ml；所产纤维素酶活力为11.8
±
3.2%u/ml。
[0021]
采用优化培养基与优化条件，所述的山羊葡萄球菌株ncu s6发酵产碱性脂肪酶酶曲线和生长曲线如图3所示。
[0022]
所述的山羊葡萄球菌株ncu s6所产的碱性脂肪酶的最适作用温度为37℃，最适作用ph为8.0，ca
2+
对其酶活力有明显的激活作用，加入终浓度为10mm的cac12可使所述的山羊葡萄球菌株ncu s6所产的碱性脂肪酶活力提高66.4%。
[0023]
本发明的有益效果是：使用山羊葡萄球菌株ncu s6的发酵酶液应用于生物酶法转化樟树籽仁油制备中碳链结构油脂工艺中，可提高中长碳链功能油脂的得率，有利于促进我国来源丰富的樟树资源的高值化开发利用，为后续更深入的研究提供了理论基础，具有显著的理论和应用价值及广阔的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为本发明山羊葡萄球菌株ncu s6的菌落形态图。
[0025]
图2为本发明山羊葡萄球菌株ncu s6的革兰氏染色后细胞形态图（放大200倍）。
[0026]
图3为本发明山羊葡萄球菌株ncu s6发酵产碱性脂肪酶曲线和生长曲线。
具体实施方式
[0027]
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
[0028]
实施例1。山羊葡萄球菌株ncu s6的筛选方法。
[0029]
（一）实验材料准备。
[0030]
1、分离源取自樟树籽仁油生产废渣和周围下水道污水（南昌大学青山湖校区）。
[0031]
2、培养基。
[0032]
营养肉汤培养基：蛋白胨1%，牛肉浸出粉0.3%，nac10.5%，最终ph7.2
±
0.2，121℃高压灭菌15min，待冷至常温，备用。
[0033]
琼脂肉汤培养基：在营养肉汤培养基中添加最终质量浓度为1.5-2%的琼脂。
[0034]
橄榄油乳化液的制备：橄榄油与0.1g/ml阿拉伯树胶以1:4（v/v）的比例混合，利用高速均质机乳化10min，即得橄榄油乳化液。
[0035]
富集培养基：大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨1.5%、nacl0.5%、橄榄油乳化液2%（v/v），将ph调至7.2，121℃灭菌20min。
[0036]
脂肪酶初筛培养基：大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨1.5%、nacl0.5%、酵母提取物0.3%、琼脂粉2.0%、中性三丁酸甘油酯1.0%，将ph调至7.5
±
0.2，121℃灭菌15 min，冷却至约60℃时，振荡混匀后，趁热倒入平皿。
[0037]
脂肪酶复筛培养基：大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨1.5%、nacl0.5%、橄榄油乳化液 5%（v/v），将ph调至7.2，加入琼脂粉2.0%，121℃灭菌20 min，冷却至约60℃时，加入已过滤除菌的罗丹明b溶液，其终浓度为 0.5g/l，振荡混匀后，趁热倒入平皿。
[0038]
斜面培养基：大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨1.5%、nacl0.5%，将ph调至7.2，加入2.0%的琼脂粉，微热后分装至试管，121℃灭菌20min。
[0039]
发酵培养基：大豆蛋白胨0.5%、胰蛋白胨1.5%、nacl0.5%、橄榄油1%（v/v），将ph调至7.2，121℃灭菌20min。
[0040]
3、实验设备。
[0041]
恒温振荡器、生化培养箱、超净工作台、高压灭菌锅、ph计、高速均质机、721型紫外分光光度计。
[0042]
（二）菌株筛选。
[0043]
（1）高产脂肪酶菌株富集：称取1g/ml左右分离源样品，用富集培养基和10倍稀释法，制备不同稀释度（10-1
～10-9
）的稀释液，从每个稀释度中吸取100μl稀释液匀涂布到琼脂肉汤培养基平板上。37℃恒温培养24h，选取长有10个左右菌落的平板备用。
[0044]
（2）高产脂肪酶菌株初筛：采用点种法，用无菌牙签活取上一步中得到的菌落点种到脂肪酶初筛培养基平板上，37℃恒温培养24h，根据培养基中菌落透明圈直径与菌落直径比（h/c）大小进行产脂肪酶菌株初筛，选取h/c较大的菌株备用。
[0045]
（3）高产碱性脂肪酶菌株复筛。
[0046]
采用点种法，将上一步骤中初筛得到的菌株点种到脂肪酶复筛培养基平板上，37℃恒温培养24h，观察菌落周围是否产生黄色透明水解圈。根据培养基中菌落黄色透明圈直径与菌落直径比（h/c）大小进行产脂肪酶菌株复筛，选取h/c较大的菌株备用。将复筛得到的菌株接种到营养肉汤培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养24h，制成种子液。以4%的接种量将种子液加入到发酵培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养51h，取发酵液，8000r/min离心分离10min，上清液即为粗酶液。采用国标 gb/t 23535-2009《脂肪酶制剂酶活测定方法》中规定的酸碱滴定法测定粗酶液的脂肪酶活力，选取产脂肪酶活力高的菌株。
[0047]
（4）用于生物酶法转化樟树籽仁油制备中碳链结构油脂且耐mcfa菌株的筛选。
[0048]
将上一步中复筛得到的菌株接种到营养肉汤培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养24h，制成种子液。以4%的接种量将种子液加入到发酵培养基中，37℃、220r/min摇瓶培养51h，取发酵液，8000r/min离心分离10min，上清液即为粗酶液。按比例精确称取适量樟树籽仁油（月桂酸含量≤2%）、亚油酸/亚麻酸/dha乙酯/epa乙酯、粗酶液（载酶量10%）等原料于圆底烧瓶中，将其混合均匀，油浴锅设定好温度和转速100r/min，将烧瓶放置其中进行反应，反应一定时间后，取出烧瓶、抽滤除去反应液中的不溶杂质，经二级分子蒸馏分离纯化后，得到中长碳链功能油脂。选取能使中碳链结构油脂得率最高的菌株，即为表达脂肪酶的山羊葡萄球菌株ncu s6。
[0049]
（三）菌株菌落形态特征及生理生化特征。
[0050]
菌株ncu s6在营养肉汤琼脂培养基上培养24h后，菌落呈球形或稍呈椭圆形凸起、直径1-2mm，排列成葡萄状、边缘整齐，表面光滑，湿润并且不透明的菌落。革兰氏染色为阳性，在显微镜下观察细胞形态为圆球状，直径0.5～1.5μm左右，无芽孢、鞭毛和荚膜。接触酶实验为阳性，氧化酶实验、血浆凝固酶实验为阴性，新生霉素敏感实验表现为敏感型，能利用葡萄糖、麦芽糖、蔗糖，能水解底物如紫苏油、亚麻油、大豆油、米糠油、橄榄油。
[0051]
菌株ncu s6的16srdna基因序列见“说明书核苷酸和氨基酸序列表”。
[0052]
采用blast法对菌株ncu s6的16srdna基因序列与genbank 数据库比较分析发现，菌株ncu s6与山羊葡萄球菌的同源性高达99%。
[0053]
综合菌株的生理生化及分子鉴定结果，菌株ncu s6命名为山羊葡萄球菌（staphylococcus caprae）ncu s6。
[0054]
查阅相关文献资料，尚无高产脂肪酶且耐中碳链脂肪酸型山羊葡萄球菌的筛选及应用方面的报道。山羊葡萄球菌ncu s6为新的菌株，已于2020年1月15日交送于中国普通微
生物菌种保藏中心（cgmcc）保藏，保藏号为19356。
[0055]
本发明筛选与分离出的山羊葡萄球菌ncu s6产碱性脂肪酶活力高达4927.3u/ml且耐中碳链脂肪酸，其发酵酶液能显著提高生物酶法转化樟树籽仁油制备中碳链结构油脂的得率。为生物酶法制备中碳链结构油脂提供了菌源和技术，具有较强的实际应用价值。