一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的组合物及诊断试剂的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种用于宫颈高级别病变检测的组合物及诊断试剂或试剂盒，具体的，涉及epb41l3、hpv16l1及hpv18l2甲基化的特异性引物及各自的内参基因引物。


背景技术：

2.宫颈癌的发病率与死亡率居女性恶性肿瘤的第二位。who 2018年统计数据全球子宫颈癌新发病例58.98万，在我国，每年约有13～15万例新发病例，约占世界的30％。2018年全年我国宫颈癌死亡人数大约为4.7～4.8万人，发病率和死亡率成逐年上升趋势。宫颈癌虽是恶性肿瘤，但正常的宫颈细胞经过癌前病变发展到浸润癌，可能有5～10年的潜伏期。整个过程中部分hpv病毒的感染可被自身免疫系统修复而自动转归为正常，而另一部分与宫颈癌联系更加紧密的癌前病变则最终发展为宫颈癌。因此，选择合适有效的诊断方法对于宫颈癌的防治具有重要意义。
3.宫颈癌的发生发展是由宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia,cin)逐渐发展的连续、可逆转的病理过程，该过程的任一阶段早期发现及时诊治都可以阻断其向浸润性癌发展。因此早期检出高级别cin并行阻断性治疗能够有效控制宫颈癌的发生。根据cin病变的严重程度可分为3级。cin1是宫颈低级别病变,异型细胞局限于上皮下1/3的轻度细胞不典型增生。cin2和cin3合称为宫颈高级别病变，其中，cin2指的是病变范围为上皮下2/3的中度细胞不典型增生，临床上界定较为困难。cin3则是超过上皮下2/3,甚至是累及全层的重度细胞不典型增生。高危型hpv感染后3-5年即可进展为高级别病变。但是由高级别病变进展成宫颈癌可能需20-30年。
4.目前应用最广泛的宫颈癌筛查方法为宫颈液基细胞学检查和高危型hpv检测。液基细胞学检查敏感性较低。有研究数据显示，细胞学检查在初筛过程中遗漏了约有一半的cin2、cin3及宫颈癌(cin2+)患者，常造成对患者的漏诊漏治。虽然高危型hpv dna检测灵敏度高，操作便于规范化。但hpv感染并不一定发展成为宫颈癌，事实上80％的女性一生中都会感染hpv病毒，但大部分均可以自我清除。因此高危型hpv检查虽然具有很高的灵敏度和筛查特异性，但不具备很好的宫颈癌预测性。hpv阳性的结果会带来较大的心理负担，形成令人关注的社会问题。
5.目前的细胞和高危型hpv dna联合筛查仍然是停留在在健康人群中“初筛”出有“潜在”病变需要进一步观察的人群。虽然阴道镜引导下的活组织检查女性宫颈癌和癌前病变诊断的“金标准，”但大部分hpv为一过性感染，细胞学存在漏检，很多低级别病变会转归。目前通过检测hpv病毒或细胞学的初筛结果，就需要通过有创检查(阴道镜)和处理(锥切等)的子宫颈上皮内瘤变病理来判断受检者患癌风险，这种过度治疗过度检查，一方面不利于妇女的健康状态和生活质量，也会会导致医疗资源的大量浪费。
6.dna甲基化是表观遗传学的重要研究内容，基因甲基化是肿瘤发生过程中的早期事件，是细胞的遗传本质和外界环境共同影响作用的结果。利用基因的甲基化来早期诊断
端发光基团相同或不同，选自fam、hex、rox、joe、vic、tet、ned、fitc、cy3或cy5；3’端淬灭基团相同或不同选自bhq1、bhq2、bhq3、tamra、eclipse、dabcyl。
17.本发明一个具体的技术方案，所述的epb41l3荧光探针5’端发光基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1，epb41l3内参探针5’端发光基团为hex，3’端淬灭基团为bhq1；hpv16l1荧光探针5’端发光基团为fam，3’端淬灭基团为bhq1；hpv16 l1内参荧光探针5’端发光基团为hex，3’端淬灭基团为bhq1；hpv18l2荧光探针5’端发光基团为rox，3’端淬灭基团为bhq2；hpv18l2内参荧光探针5’端发光基团为cy5，3’端淬灭基团为bhq2。
18.本发明一个优选的技术方案，针对人epb41l3基因425、427、438位点和内参基因ac tb(ncbi数据库公开的人类全基因组序列nc_00018.10)，以及病毒hpv 16l1基因6367、6389位点和hpv18 l2基因4256、4261、4265、4269、4275和4282位点，使用primer premier 5.0及methy primer express v1.0软件，分别设计特异性引物及探针。所述特异性引物及内参基因引物的核苷酸序列如下所示：
[0019][0020][0021]
本发明另一目的在于提供所述的组合物在制备宫颈高级别病变及宫颈癌诊断试剂中的应用。
[0022]
本发明另一目的在于提供一种用于宫颈高级别病变及宫颈癌检测的诊断试剂或试剂盒，包括本发明所述的组合物。
[0023]
进一步的，本发明所述的诊断试剂或试剂盒还包括甲基化特异性荧光定量pcr反应液和热启动酶。所述甲基化特异性荧光定量pcr反应液包括pcr反应液1和pcr反应液2，p cr反应液1用于扩增甲基化的epb41l3，pcr反应液2用于扩增甲基化的hpv16l1和hp v18l2。
所述热启动酶优选为bioline公司提供的immolase
tm dna polymerase。
[0024]
其中所述的pcr反应液1包括：
[0025]
epb41l3甲基化正向引物、epb41l3甲基化反向引物、epb41l3甲基化探针、内参a ctb正向引物、内参actb反向引物、内参actb探针、tris、(nh4)2so4、kcl、dntp。
[0026]
其中所述的epb41l3甲基化探针5’端用fam标记作为发光基团，内参actb探针5’端用hex标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq1标记作为淬灭基团。
[0027]
其中所述的pcr反应液2包括：
[0028]
hpv16 l1甲基化正向引物、hpv16 l1甲基化反向引物、hpv16 l1甲基化探针、hpv16 l1内参正向引物、hpv16 l1内参反向引物、hpv16 l1内参探针、hpv18l2甲基化正向引物、hpv18l2甲基化反向引物、hpv18l2甲基化探针、hpv18l2内参正向引物、hpv18l2内参反向引物、hpv18l2内参探针、tris、(nh4)2so4、kcl、dntp。
[0029]
其中所述的hpv16 l1甲基化探针5’端用fam标记作为发光基团，hpv16 l1内参探针5’端用hex标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq1标记作为淬灭基团。hpv18l2甲基化探针5’端用rox标记作为发光基团，hpv18l2内参探针5’端用cy5标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq2标记作为淬灭基团。
[0030]
其中所述的引物终浓度为0.1μm-0.4μm，探针终浓度为0.05μm-0.2μm。
[0031]
其中所述的tris终浓度为10mm-40mm，ph值为8.0-9.0。
[0032]
其中所述的(nh4)2so4终浓度为10mm-40mm。
[0033]
其中所述的kcl终浓度为30mm-70mm。
[0034]
其中所述的dntp终浓度为100-500μm。
[0035]
本发明一个具体的试剂盒包含以下组分：
[0036][0037]
本发明优点：
[0038]
1.本发明首次将作为宫颈癌直接致病原因的高危hpv病毒甲基化水平纳入表观遗传的检测体系中，和现有的宫颈癌甲基化检测技术相比，不仅有效补充了可能由于位点选择以及分析体系的差异，同时最大程度的提高了对宫颈高级别病变及宫颈癌的预测能力，从单纯检测“人”癌变到检测“病毒和人”相互作用病变。本发明结合人epb41l3基因和病毒hpv 16l1基因和hpv18l2基因甲基化的表观遗传学检测，一方面建立用于预测宫颈高级别病变及宫颈癌风险的cutoff值，另一方面有效区分hpv一过性感染和真正具有持续性和致
癌性的感染，甚至同时也区别于其他宿主基因甲基化协同hpv检测方法，提高了宫颈高级别病变及宫颈癌的预测能力，解决了现有技术单纯检测病毒感染无法诊断真正的不可逆的高危病变的问题。
[0039]
2.通过焦磷酸测序的方法对宫颈癌宫颈脱落细胞和正常人宫颈脱落细胞两组样本，对多个候选基因多个候选位点进行筛选分析，筛选出和宫颈癌相关性最好的基因和位点，最终选择人epb41l3基因425、427、438位点，以及病毒hpv 16 l1基因6367、6389位点和hpv18 l2基因4256、4261、4265、4269、4275和4282位点的组合，进行甲基化检测，用于宫颈高级别病变及宫颈癌诊断。
[0040]
3.本发明对人、hpv16和hpv18的内参序列进行选择，除了考虑甲基化发生频率低的序列特征，还进一步结合考虑病毒与宿主染色体的整合带来病毒基因缺失的问题。高危型hpv整合也是宫颈细胞高级别病变及癌变发生的重要步骤和重要机制，但病毒整合的位置的随机性往往导致基因组的缺失，继而导致荧光定量pcr的方法的漏检。本发明选择hpv 16l1和hp v18l2基因甲基化位点附近的区域设计内参检测的引物探针，最大程度地降低因为hpv与宿主染色体整合发生缺失带来数据无效的风险。
[0041]
4.本发明采用甲基化特异性荧光定量pcr的方法检测发生甲基化的目标基因epb41l3、hpv 16l1和hpv18l2，采用甲基化特异性引物和探针对核酸进行扩增，通过多通道的探针荧光标记实现对3个目标基因同时检测，根据实时荧光定量pcr的ct值对检测结果进行判读。此外，针对每个目标基因，分别选取了甲基化发生频率低的区域作为内参基因，采用不同于甲基化基因的多通道的荧光标记，实现对3个内参基因的同时检测，代表核酸总体的水平和质量。最终根据各基因实时荧光定量pcr的
△
ct值(内参ct值-靶标ct值)对甲基化水平进行定量评价。和现有的甲基化焦磷酸测序相比，此方法具备成本低、高灵敏度、高特异性、高通量、快速检测和全程封闭的特点，最终为临床提供更为简单又精准的筛查以及风险分级方法，从“科学研究”走向了“临床应用”。
[0042]
目前已上市的国外相关产品有德国oncgnostics的宫颈癌风险评估甲基化检测试剂盒和德国qiagen的qiasure methylation test。国内有湖南宏雅基因技术有限公司的cer vi-m宫颈癌基因甲基化检测。
[0043]
甲基化检测试剂盒采用了高分辨熔解曲线技术对astn1,dlx1,itga4,rx fp3,sox17 and znf671 6个人基因的甲基化水平进行检测分析，用于预测宫颈高级别病变及宫颈癌风险，用于检测cin3+灵敏度为64.8％，特异性为94.6％。
[0044]
qiagen的qiasure甲基化检测试剂盒采用了甲基化特异性pcr的方法，对fam19a4和hsa-mir-124-2 2个人基因的甲基化水平进行检测分析，用于检测cin3+灵敏度为68-71％，特异性为68-76％。
[0045]
宏雅的cervi-m宫颈癌基因甲基化检测采用了甲基化特异性pcr的方法，对pax1基因的甲基化水平进行检测分析，用于检测cin3+灵敏度为77％，特异性为79％。
[0046]
本发明通过联合人epb41l3和病毒hpv 16l1和hpv18l2甲基化检测，首次将作为宫颈癌直接致病原因的高危hpv病毒甲基化水平纳入检测体系中，和现有的宫颈癌甲基化检测技术相比，不仅有效补充了可能由于位点选择以及分析体系的差异，同时最大程度的提高了对宫颈高级别病变及宫颈癌的预测准确性。本发明联合人epb41l3和病毒hpv 16l1和hpv18l2甲基化检测，检测cin3+灵敏度为93.3％，特异性为98.5％，检测cin2+灵敏度为
92.4％，特异性为82.5％，大大提高了宫颈高级别病变及宫颈癌的检测灵敏度和特异性，充分显示了本发明对于宫颈高级别病变及宫颈癌的预测能力的优势。
附图说明
[0047]
图1甲基化特异性荧光定量pcr的方法检测甲基化dna的技术原理。
[0048]
图2 pcr反应体系1(epb41l3)对临床123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果。
[0049]
图3 pcr反应体系2(hpv)的hpv16对临床123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果。
[0050]
图4 pcr反应体系2(hpv)的hpv18对临床123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果。
[0051]
图5二次logistic概率回归计算epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平对于cin1-/cin3+的相关性。
[0052]
图6二次logistic概率回归计算epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平对于cin1-/cin2+的相关性。
具体实施方式
[0053]
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
[0054]
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
[0055]
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
[0056]
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
[0057]
实施例1本发明所述宫颈高级别病变及宫颈癌检测的诊断试剂的制备1.引物和探针的设计与合成
[0058]
针对人epb41l3 425,427,438位点和内参基因actb(序列参见ncbi数据库公开的人类全基因组序列nc_00018.10)，以及病毒hpv 16l1基因6367、6389位点(序列参见ncbi数据库公开的af125673.1)和hpv18l2基因4256、4261、4265、4269、4275和4282位点(序列参见ncbi数据库公开的ay262282.1)，使用primer premier 5.0及methy primer express v1.0软件，分别设计特异性引物及探针。
[0059]
特异性引物及探针序列，如下表所示：
[0060]
序列名称寡核苷酸序列碱基长度epb41l3正向引物taaattggcggagaagggac20epb41l3反向引物ggtttttttgggatttttggac22epb41l3探针acgcggggatcgagtcgttttttc24内参actb正向引物tggtgatggaggaggttta19内参actb反向引物aaccaataaaacctactcct20内参actb探针accaccacccaacacacaataacaaacaca30hpv16l1正向引物aaatggtgttagaattatatggc23
hpv16l1反向引物tctaatacattttcaccaacaa22hpv16l1探针ttacgaagggaataaatgtt20hpv16内参正向引物ggggaatattggggtaaagg20hpv16内参反向引物taaaatccataacaccaaaaccaa24hpv16内参探针ttttatgtattaatgttgtagtaawtt26hpv18l2正向引物taaaagtatggtattttatcgtgtc25hpv18l2反向引物aaaaccaacatccaccactat21hpv18l2探针cgtaaacgggtttcggt17hpv18内参正向引物gattaggttaaygggtaattatgt23hpv18内参反向引物atatcaaacaaatcattatcctcc24hpv18内参探针aaccctaacacctatttatataccrctac28
[0061]
2.对照品选择
[0062]
为了真实反映人基因组和病毒基因甲基化水平，阳性对照品由三部分组成：
[0063]
1)克隆获得hpv16全长质粒，参与m.sssi甲基化酶甲基化反应以后可代表hpv16l1基因100％甲基化对照，不参与甲基化反应的全长质粒代表hpv16l1基因0％甲基化对照，两者定量归一以后，按0％/1％/50％/100％比例进行混合；
[0064]
2)克隆获得hpv18全长质粒，参与m.sssi甲基化酶甲基化反应以后可代表hpv18l2基因100％甲基化对照，不参与甲基化反应的全长质粒代表hpv18l2基因0％甲基化对照，两者定量归一以后，按0％/1％/50％/100％比例进行混合；
[0065]
3)胞嘧啶99％都被甲基化形成cpg甲基化序列的基因组dna，和甲基化不到1％的基因组dna,按0％/1％/50％/100％比例进行混合；
[0066]
最终阳性对照品含有epb41l3、hpv 16l1和hpv18l2三个基因，均以全基因组的形式接近真实的临床样本，各基因含不同甲基化比例，用以对试剂盒的配置、运输和使用过程的有效性进行质量控制；
[0067]
阴性对照品为水，目的在对试剂盒使用以及提取转化的全部流程进行污染监控。
[0068]
3.甲基化特异性荧光定量pcr反应液组成
[0069]
本发明包含两种pcr反应液，pcr反应液1用于检测人epb41l3甲基化水平，actb基因作为内参，pcr反应液2用于检测病毒hpv16l1和hpv18l2甲基化水平，各基因低甲基化区域作为内参基因设计引物探针。
[0070]
其中所述的pcr反应液1包括：
[0071]
epb41l3甲基化正向引物、epb41l3甲基化反向引物、epb41l3甲基化探针、内参a ctb正向引物、内参actb反向引物、内参actb探针、tris、(nh4)2so4、kcl、dntp。
[0072]
其中所述的epb41l3甲基化探针5’端用fam标记作为发光基团，内参actb探针5’端用hex标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq1标记作为淬灭基团。
[0073]
其中所述的pcr反应液2包括：
[0074]
hpv16 l1甲基化正向引物、hpv16 l1甲基化反向引物、hpv16 l1甲基化探针、hp v16 l1内参正向引物、hpv16 l1内参反向引物、hpv16 l1内参探针、hpv18l2甲基化正向引物、hpv18l2甲基化反向引物、hpv18l2甲基化探针、hpv18l2内参正向引物、h pv18l2内参反向引物、hpv18l2内参探针、tris、(nh4)2so4、kcl、dntp。
[0075]
其中所述的hpv16 l1甲基化探针5’端用fam标记作为发光基团，hpv16 l1内参探针5’端用hex标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq1标记作为淬灭基团。hpv18l2甲基化探针5’端用rox标记作为发光基团，hpv18l2内参探针5’端用cy5标记作为发光基团，两条探针3端均用bhq2标记作为淬灭基团。
[0076]
其中所述的引物终浓度为0.1μm-0.4μm，探针终浓度为0.05μm-0.2μm。
[0077]
其中所述的tris终浓度为10mm-40mm，ph值为8.0-9.0。
[0078]
其中所述的(nh4)2so4终浓度为10mm-40mm。
[0079]
其中所述的(nh4)2so4终浓度为30mm-70mm。
[0080]
其中所述的dntp终浓度为100-500μm。
[0081]
实施例2：利用实施例1试剂进行宫颈癌甲基化检测
[0082]
1.技术原理
[0083]
将宫颈脱落细胞dna提取纯化以后需要用重亚硫酸盐对dna进行处理，经过处理以后，dna中发生了甲基化的cpg岛上的c碱基仍然保持为c碱基，而没有发生甲基化的cpg岛上的c碱基则变成了u碱基，这样就造成了甲基化的dna和非甲基化的dna的序列差异，可以为后续的甲基化检测方法检测甲基化水平，如图1所示。
[0084]
通过甲基化特异性荧光定量pcr的方法检测发生甲基化的目标基因epb41l3、hpv 16l1和hpv18l2，首先采用甲基化特异性引物对核酸进行扩增，通过多通道的探针荧光标记实现对3个目标基因分别进行实时荧光检测，根据实时荧光定量pcr的ct值对检测结果进行判读。此外，针对每个目标基因，分别选取了甲基化发生频率低的区域作为内参基因，采用不同于3个目标基因的多通道的荧光标记，同时实现对3个内参基因的定量检测，内参基因代表了人基因组、hpv16和hpv18核酸总体的水平,于甲基化状态无关。最终根据各基因实时荧光定量pcr的
△
ct值(内参ct值-靶标ct值)，代表了各基因甲基化的比例，实现对甲基化水平进行定量评价。
[0085]
2.检测方法
[0086]
具体检测方法如下：：
[0087]
(1)收集生物样本：
[0088]
由宫颈细胞刷片刷落的宫颈细胞保存在细胞保存液中。
[0089]
其中所述的细胞保存液可以是样本转移培养基(specimen transport medium,stm),car ehpv收集培养基(carehpv collection medium)，surepath细胞保存液和preservcyt细胞保存液。
[0090]
(2)提取细胞dna
[0091]
采用宫颈脱落细胞作为样本，取100μl-500μl用核酸提取试剂盒进行dna提取纯化。
[0092]
其中所述的核酸提取试剂盒可以是天根生化科技有限公司提供的磁珠法动物组织基因组dna提取试剂盒、微量样品基因组dna提取试剂盒，和德国qiagen公司提供的qiamp d na mini kit。
[0093]
(3)dna转化流程
[0094]
采用细胞提取dna为样本，用重亚硫酸盐转化试剂盒对基因组dna和hpv病毒dn a进行重亚硫酸盐转化和纯化。经过处理后，dna中发生了甲基化的cpg岛上的c碱基仍然保持
为c碱基，而没有发生甲基化的cpg岛上的c碱基则变成了u碱基，这样就造成了甲基化的dna和非甲基化的dna的序列差异。
[0095]
其中所述的重亚硫酸盐转化试剂盒可以是天根生化科技有限公司提供的磁珠法dna重亚硫酸盐转化试剂盒、柱法dna重亚硫酸盐转化试剂盒，和美国zymo research公司提供的的ez dna methylation
tm kit和ez dna methylation gold
tm kit，和德国qiagen公司提供的fast bisulfite conversion kit。
[0096]
(4)甲基化特异性荧光定量pcr流程
[0097]
采用经重亚硫酸盐转化的dna为样本，按照下表配置荧光定量pcr反应体系1和2：
[0098]
荧光定量pcr反应体系1组成pcr反应液120μl热启动酶0.2μl经重亚硫酸盐转化的dna5μl
[0099]
荧光定量pcr反应体系2组成pcr反应液220μl热启动酶0.3μl经重亚硫酸盐转化的dna5μl
[0100]
在abi7500荧光定量pcr仪上运行荧光定量pcr反应条件：
[0101][0102]
在其中所述的58-64℃设置荧光信号的收集；
[0103]
其中所述的荧光定量pcr反应体系1用于检测人基因组epb41l3甲基化，荧光通道设置为fam和hex，分别对应epb41l3和内参actb。
[0104]
其中所述的荧光定量pcr反应体系2用于检测hpv16l1和hpv18l2甲基化，荧光通道设置为fam、hex、rox和cy5，分别对应hpv16l1甲基化、hpv16l1内参、hpv18l2甲基化和hpv18l2内参。
[0105]
其中所述的热启动酶优选为bioline公司提供的immolase
tm dna polymerase。
[0106]
(5)结果分析
[0107]
在abi7500荧光定量pcr仪上设置阈值线如下：
[0108]
用于检测人基因组epb41l3的fam荧光通道阈值设置为25000，用于检测人内参act b的hex荧光通道阈值设置为35000。用于检测hpv16l1甲基化的fam荧光通道阈值设置为50000。用于检测hpv16l1内参的hex荧光通道阈值设置为20000。用于检测hpv18l2甲基化的rox荧光通道阈值设置为35000。用于检测hpv18l2内参的cy5荧光通道阈值设置为30000。
[0109]
各基因
△
ct值＝各基因对应的内参ct值-各基因甲基化ct值。
[0110]
根据检测结果对样本的有效性进行判断，如表1所示。
[0111]
表1
[0112]
内参甲基化判定内参ct≤35甲基化基因ct≤35甲基化阳性，
△
ct值＝actb ct-epb41l3 ct内参ct≤35甲基化基因ct＞35甲基化阴性内参ct＞35甲基化基因ct任意值数据无效，需要复检
[0113]
(6)性能研究
[0114]
为了验证本发明可以准确有效的检测人epb41l3和hpv病毒基因甲基化水平，按照上述发明描述的方法对阳性对照样本组1-组3进行提取和转化，再配置pcr反应体系1(epb)检测阳性对照样本组1(epb)的转化产物，配置pcr反应体系2(hpv)检测阳性对照样本组2(hpv16)和组3(hpv18)的转化产物。
[0115]
其中所述的阳性对照样本组1-组3为：
[0116]
组1：胞嘧啶99％都被甲基化形成cpg甲基化序列的基因组dna，和甲基化不到1％的基因组dna,按1％/50％比例进行混合；
[0117]
组2：克隆获得hpv16全长质粒，参与m.sssi甲基化酶甲基化反应以后可代表hpv16l1基因100％甲基化对照，不参与甲基化反应的全长质粒代表hpv16l1基因0％甲基化对照，两者定量归一以后，按1％/50％比例进行混合；
[0118]
组3：克隆获得hpv18全长质粒，参与m.sssi甲基化酶甲基化反应以后可代表hpv18l2基因100％甲基化对照，不参与甲基化反应的全长质粒代表hpv18l2基因0％甲基化对照，两者定量归一以后，按1％/50％比例进行混合；
[0119]
其中所述的pcr反应体系1(epb)对阳性对照样本组1(epb)转化产物的检测结果如下表2所示。
[0120]
表2
[0121][0122]
其中所述的pcr反应体系2(hpv)对阳性对照样本组2(hpv16)转化产物的检测结果如下表3所示。
[0123]
表3
[0124][0125]
其中所述的pcr反应体系2(hpv)对阳性对照样本组3(hpv18)转化产物的检测结果如下表4所示。
[0126]
表4
[0127][0128]
对上述结果进行分析，epb
△
ct值大小和epb41l3甲基化程度成线性关系，hpv16l1
△
ct值大小和hpv16l1甲基化程度的高低成线性关系，hpv18l2
△
ct值大小和hpv18l2甲基化程度的高低成成线性关系，所以可以实现通过分析各基因的
△
ct值达到对该基因在样本中的甲基化水平进行定量。epb，hpv16l1和hpv18l2三个基因检测都可以明显区分0％甲基化和1％甲基化，所以本发明建立的甲基化检测的方法达到临床样本检测的需求。
[0129]
(7)临床样本验证
[0130]
选自2017年12月-2018年11月期间在复旦大学附属妇产科医院收集的123例宫颈脱落细胞样本进行本发明的临床样本验证，其中包含27例正常人群脱落细胞、30例cin1宫颈脱落细胞、25例cin2/3宫颈脱落细胞、11例ais原位癌宫颈脱落细胞和30例adc腺癌/scc鳞癌宫颈脱落细胞。
[0131]
其中所述的正常人群为高危型hpv检测阴性且细胞学检测为正常的体检人群。
[0132]
其中所述的cin1为宫颈低级别病变。
[0133]
其中所述的cin2/cin3为宫颈高级别病变。
[0134]
其中所述的ais为宫颈原位腺癌，等同于cin3。
[0135]
其中所述的scc为宫颈鳞状癌。
[0136]
其中所述的adc为宫颈腺癌。
[0137]
其中所述的cin1/cin2/cin3/ais/adc/scc均为阴道镜以及阴道镜引导下的组织病理活检的结果。
[0138]
按照上述发明描述的方法对123例宫颈脱落细胞样本进行提取和转化，再分别配置pcr反应体系1(epb)和pcr反应体系2(hpv)同时检测123例宫颈脱落细胞样本的转化产物。
[0139]
其中所述的pcr反应体系1(epb)对123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果如下表5和图2所示，其中所述的数字为epb
△
ct值＝actb内参ct值-epb甲基化ct值，代表了epb41l3甲基化水平。
[0140]
表5
[0141][0142][0143]
其中所述的pcr反应体系2(hpv)的hpv16对123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果如下表6和图3所示，其中所述的数字为hpv16l1
△
ct值＝hpv16l1内参ct值-h pv16l1甲基化ct值，代表了hpv16l1甲基化水平，正常人群因hpv16为阴性不纳入统计。
[0144]
表6
[0145][0146]
其中所述的pcr反应体系2(hpv)的hpv18对123例宫颈脱落细胞样本转化产物的检测结果如下表7和图4所示，其中所述的数字为hpv18l2
△
ct值＝hpv18l2内参ct值-h pv18l2甲基化ct值，代表了hpv18l2甲基化水平。正常人群因hpv18为阴性不纳入统计。
[0147]
表7
[0148][0149][0150]
将epb41l3基因、hpv16l1基因和hpv18l2基因甲基化水平分别组合成不同的组合，利用二次logistic概率回归计算各甲基化标志物组合对于cin1-/cin3+的相关性，用于预
测宫颈高级别病变cin3及以上(ais/adc/scc)，绘制roc曲线和auc面积如图5和表8所示。
[0151]
表8
[0152][0153]
对上述结果进行分析，结果显示epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平联合检测，经cin1-/cin3+的相关性分析，呈现出和cin3及以上(ais/adc/scc)极其显著的相关性，auc线下面积为0.969。三靶标联合检测优于使用两两组合和任一单基因与高级别病变相关性。每种组合按照最大约登指数计算，用于预测宫颈高级别病变及宫颈癌风险的灵敏度和特异性统计如表9所示，其中epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平联合检测灵敏度为95.1％，特异性为91.2％，充分显示了本发明对于宫颈高级别病变以上及宫颈癌的预测能力。
[0154]
表9
[0155]
检验结果变量灵敏度特异性epb、hpv16l1和hpv18l2三组合0.9510.912epb和hpv16l1两组合0.8290.930epb和hpv18l2两组合0.9020.947hpv16l1和hpv18l2两组合0.9020.860epb单基因0.7800.965hpv16l1单基因0.5610.930hpv18l2单基因0.3170.982
[0156]
本发明同时将epb41l3基因、hpv16l1基因和hpv18l2基因甲基化水平分别组合成不同的组合，利用二次logistic概率回归计算各甲基化标志物组合对于cin1-/cin2+的相关性，用于预测宫颈中高级别病变及以上(cin2/cin3/ais/adc/scc)的相关性，绘制roc曲线和auc面积如图6和表10所示。
[0157]
表10
[0158][0159]
对上述结果进行分析，结果显示epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平联合检测，经cin1-/cin2+的相关性分析，也呈现出和cin2及以上(cin2/cin3/ais/adc/scc)比较显著的相关性，auc线下面积为0.914。三靶标联合检测优于使用两两组合和任一单基因与高级别病变相关性。每种组合按照最大约登指数计算，用于预测宫颈高级别病变cin2+的灵敏度和特异性统计如表11所示，其中epb41l3、hpv16l1和hpv18l2甲基化水平联合检测灵敏度为92.4％，特异性为82.5％，充分显示了本发明对于宫颈高级别病变cin2+的预测能力。
[0160]
表11
[0161]
检验结果变量灵敏度特异性epb、hpv16l1和hpv18l2三组合0.9240.825epb和hpv16l1两组合0.8480.825epb和hpv18l2两组合0.7420.930hpv16l1和hpv18l2两组合0.8330.860epb单基因0.6520.930hpv16l1单基因0.6210.877hpv18l2单基因0.2580.982