一种嗜酸性混合菌种及其快速制备方法和应用与流程

本发明属于环境工程领域，涉及污泥的调理方法，特别是指一种嗜酸性混合菌种及其快速制备方法和应用。

背景技术：

据统计，近年来我国城市污泥量迅速增加，对污泥的处理工艺要求越来越高。城市污泥富含丰富的有机质、氮、磷等植物营养元素，在园林绿化、堆肥回用、土壤改良具有良好的发展前景，但是对污泥的含水率有较高的要求：一般需要达到40%-60%。现有污水处理厂脱水污泥含水率一般高达70%-80%，难以满足后续污泥处置对含水率的要求。此外，部分污水处理厂混入了工业废水导致污泥中重金属含量较高限制了污泥的资源化利用。

污泥的生物沥滤技术起源于微生物湿法冶金，通过化能自养型嗜酸性硫杆菌的催化氧化作用降低污泥体系的ph，使得难容的重金属从固相溶解到液相通过固液分离达到去除重金属的目的。大量研究发现生物沥滤技术在去除重金属的同时还可以提高污泥的脱水性能，由于其经济成本低、无二次污染等优点受到了越来越多人的关注。污泥进行生物沥滤首先就需要进行菌种的筛选与驯化，因此快速高效的获得菌种具有极其重要的意义。

目前大多数关于生物沥滤的实验研究，生物沥滤菌种的获得多是采用购买或驯化分离出的纯种菌株，也有研究是从温泉水矿山废水中驯化获得生物沥滤菌液，但是上述方法存在菌种获得操作复杂、成本高、获得周期较长等问题。因此，研发一种时间短、成本低、效率高的获取生物沥滤技术显得十分必要。传统菌种获得的方法是在污泥中直接加入能源物质s⁰和硫酸亚铁待ph降低，经过2-3富集培养后直接获得。该方法存在筛选时间长、失败风险高、菌种的种类与浓度无法得到保证等缺点。代谢过程产生的生物氧化、生物酸化等一系列作用，促使固相中一种或多种不溶性物质溶解进入液相的一种生物技术。最开始生物沥滤法被引入污泥处理中，主要是利用其生物酸化作用去除污泥中的重金属。南京周立祥教授首次提出利用生物沥滤技术改善污泥脱水性能，其在对制革污泥中利用生物沥滤技术去除重金属实验时发现：经过生物沥滤技术处理后的污泥，脱水性能得到明显的改善，在不添加任何絮凝剂直接进行机械脱水，污泥含水率可低至60%左右。

现有研究表明二沉池、氧化池等也存在天然的氧化硫硫杆菌与氧化亚铁硫杆菌，通过合适的方法可驯化获得生物沥滤菌液，可避免繁杂的菌种分离过程，为了探寻合适的驯化方法，本课题组进行了深入的研究。

技术实现要素：

为解决上述技术问题，本发明提出一种嗜酸性混合菌种及其快速制备方法和应用，还解决了现有菌种获取操作复杂速度较慢的问题。

本发明的技术方案是这样实现的：

一种生物沥滤过程中嗜酸性混合菌种的快速制备方法，步骤如下：

（1）改良培养基的配制；

（2）供试污泥经步骤（1）的培养基培养筛选得沥滤菌种a和b；

（3）生物沥滤菌种a和b的三次扩大培养；

（4）扩大培养后的生物沥滤菌种a和b经三次驯化得嗜酸性混合菌种。

所述步骤（1）中改良培养基为沥滤菌种a和沥滤菌种b的改良培养基。

所述沥滤菌种a的改良培养基制备方法为：(nh4)2so40.4g；kh2po43.0g；mgso4·7h2o0.5g；cacl2·2h2o0.25g；用h2so4调节ph至3.0，蒸馏水1l，121℃湿热灭菌30min，添加间歇灭菌的10g/ls⁰为能源物质；沥滤菌种b的改良培养基制备方法为：(nh4)2so43g，kcl0.1g，mgso4·7h2o0.5g，k2hpo40.5g，ca(no3)20.01g，蒸馏水700ml，调节ph至3，121℃灭菌30min，加入300ml预先过滤除菌14.78%的feso4·7h2o溶液。

所述步骤（2）中供试污泥的接种量为每15ml供试污泥分别接种至135ml不同的改良培养基内。

所述步骤（2）中培养筛选的条件为：于180r/min、28℃条件下持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分并测一次ph，直至ph低至1.3-1.8，完成对沥滤菌种a和b的筛选。

所述步骤（3）中扩大培养的前两次扩大培养的接种比为10%，每15ml步骤（2）筛选得到的沥滤菌种a或b接种到135ml相对应的改良培养基中，培养条件为：用饱和naoh溶液调节ph至2.2-2.6，于180r/min、28℃持续振荡培养，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分并测一次ph，直至ph低至0.9-1.1时完成生物沥滤菌种a和b的第一或第二次扩大培养。

所述步骤（3）中扩大培养的第三次扩大培养的接种比为30%，每150ml第二次扩大培养成功的菌液a或b接种到450ml相对应的改良培养基中，培养条件为：用饱和naoh溶液调节ph至2.2-2.6，于180r/min、28℃持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分并测一次ph，直至ph低至1.9-2.1时完成生物沥滤菌种a和b的第三次扩大培养。

所述步骤（4）中三次驯化的步骤相同，仅接种比不同，第一次驯化的步骤为：按20%的接种比，取250ml扩大培养成功的生物沥滤菌种a和b的菌液与2l污泥装至容器内，加入3g/l的s⁰和硫酸亚铁能源物质，于28℃恒温曝气培养，每12h进行ph检测，定期补充蒸发失去的水分，当污泥ph低至1.9-2.1时表示第一次污泥驯化完成；第二、三次的接种比为50%。

利用上述任一方法制备的嗜酸性混合菌种，所述嗜酸性混合菌种为氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌的混合菌液，菌种浓度均为10⁸个细胞/ml。

上述的嗜酸性混合菌种在生物沥滤法改善污泥脱水性能中的应用。

本发明具有以下有益效果：

1、本方法使用自制培养基进行筛选与培养，菌种的筛选与扩大培养的速度快、时间短、菌种的种类与浓度有保障。传统方法中也有使用培养基进行筛选与扩大培养，但是需要进一步对所得菌液进进行菌种计数，具有时间长、步骤繁琐、操作难度大等缺点。本方法通过检测溶液ph是否达到预设目标值来确定菌种是否菌种筛选、扩大培养、污泥驯化是否成功，大大简化的步骤。将第三次扩大培养成功的菌液送去专业检测机构检测，所得菌种为目标菌种，浓度符合要求。

2、本申请省略了菌种分离纯化步骤，依然能顺利、快速完成菌种的扩大培养，本申请的改良培养基非常适合目标菌种在污泥当中的自然繁殖生长，对目标菌种进行筛选与扩大培养后，菌种浓度迅速达到10⁸个细胞/l，成为优势菌种，利于后续生物沥滤处理剩余污泥效率的提高；本申请意外发现，通过改良培养基使某种菌种迅速成为优势菌种，可省略掉菌种的分离纯化步骤，依然能完成菌种的扩大培养，也意外证明了分离纯化并非生物酸化工程菌的必要步骤，本申请可在30d左右完成生物酸化工程菌扩大培养。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为氧化硫硫杆菌菌种和氧化铁硫杆菌菌种的筛选。

图2为氧化硫硫杆菌和氧化铁硫杆菌的三次扩大培养数据对比图。

图3为氧化硫硫杆菌和氧化铁硫杆菌的三次污泥驯化数据对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实验材料

1、供试污泥性质

供试污泥取自郑州市双桥污水处理厂的生物池，取回的污泥保存在聚乙烯桶中置于4℃的冰箱中保存。具体污泥的物理化学性质见表1。

表1污泥的物理化学性质

2、氧化硫硫杆菌培养基

液体培养基：(nh4)2so40.4g；kh2po43.0g；mgso4·7h2o0.5g；cacl2·2h2o0.25g；用h2so4调节ph至3.0，蒸馏水1l，121℃湿热灭菌30min。添加间歇灭菌的10gls⁰为能源物质。

3、氧化亚铁硫杆菌培养基

(nh4)2so43g，kcl0.1g，mgso4·7h2o0.5g，k2hpo40.5g，ca(no3)20.01g，蒸馏水700ml，调节ph至3，121℃灭菌30min。加入300ml预先过滤除菌14.78%的feso4·7h2o溶液。

实施例

本发明为生物沥滤菌种的快速高效获得的方法，具体步骤如下：

（1）生物沥滤菌种筛选

a、按10%的接种比，取15ml供试污泥和135ml氧化硫硫杆菌液体培养基装至250ml锥形瓶中，置于180r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.5左右氧化硫硫杆菌种筛选完成。具体数据见图1a。由对比文件1a可知，氧化硫硫杆菌在筛选过程中，7天内体系ph值可由5.8降至1.0左右，完成菌种筛选。1-2天内体系ph值下降速度较慢，这是由于菌种浓度较低，产酸能力有限，2~6天内，菌种大量繁殖，体系ph值快速加快。

b、按10%的接种比，取15ml供试污泥和135ml氧化亚铁硫杆菌液体培养基装至250ml锥形瓶中，置于180r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.5左右氧化亚铁硫杆菌种筛选完成。具体数据见图1b，可知完成氧化亚铁硫杆菌的筛选大约需要11天左右，长于氧化硫硫杆菌的筛选时间，体系ph值降至2.0后便很难下降，不能够缓慢降至1.0。氧化亚铁硫杆菌体系ph值在1～2天内先快速下降，后面ph值下降渐渐趋于平缓。这是由于前期亚铁水解后能够产酸，而且氧化亚铁硫杆菌更适合于弱酸环境下生长，导致体系前期ph值下降速度较快。后期菌种将亚铁氧化为三价铁，通过三价铁水解产酸降低体系ph值，三价铁水解产酸能力不如氧化硫硫杆菌直接氧化硫粉，而且ph较低的环境对氧化亚铁硫杆菌的抑制作用较强，导致体系后期ph值下降缓慢，酸化时间有所滞后。

（2）生物沥滤菌种第一次扩大培养

a、按10%的接种比，取15ml筛选菌液和135ml氧化硫硫杆菌液体培养基装至250ml锥形瓶中，使用饱和naoh溶液调节ph至2.5左右，置于180r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.0左右氧化硫硫杆菌种筛选完成。具体结果数据见图2a可知，氧化硫硫杆菌进行扩大培养，4天内体系ph值可由2.9降至1.0完成氧化硫硫杆菌的第一次扩大培养。相较于菌种筛选所需时间，第一次扩大培养时间缩短了3天，这是由于体系内起始菌种浓度较高，产酸能力得到了加强。

b、按10%的接种比，取15ml筛选菌种和135ml氧化亚铁硫杆菌液体培养基装至250ml锥形瓶中，使用饱和naoh溶液调节ph至2.5左右，置于180r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.0左右氧化亚铁硫杆菌种筛选完成。具体结果数据见图2b：氧化亚铁硫杆菌进行扩大培养，体系ph值由3.0降至1.8需要7天左右完成氧化亚铁硫杆菌的第一次扩大培养。相较于氧化亚铁硫杆菌筛选，菌种扩大培养完成时间缩短了4天左右。

（3）生物沥滤菌种第二次扩大培养

同第一次扩大培养。具体数据见图2c和图2d。由图2c可知氧化硫硫杆菌第完成第二次扩大培养，体系ph值由3.0降至1.0，时间缩短至2.5天。由图2d可知氧化亚铁硫杆菌第完成第二次扩大培养，体系ph值由2.7降至1.8，时间缩短至5.5天。

（4）生物沥滤菌种第三次扩大培养

a、按30%的接种比，取150ml第二次扩大培养成功的菌液和450ml氧化硫硫杆菌液体培养基装至1l锥形瓶中，使用饱和naoh溶液调节ph至2.5左右，置于80r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.0左右氧化硫硫杆菌种筛选完成。具体数据见图2e。对图2e分析可知：氧化硫硫杆菌完成第三次扩大培养，体系ph值由2.6降至1.0，需要时间2.5天。可以看出：经过三次扩大培养，每次完成培养所需要的时间不断缩短，这是由于菌种逐渐适应环境，繁殖速度不断增加，菌种浓度不断升高。菌种第三次扩大培养完成时间缩短不再明显，这是由于体系菌种浓度达到限值，很难再进一步增加。由此趋势可以看出，菌种的分离纯化该过程，并不是获得目标菌种的必须步骤。

b、按30%的接种比，取150ml第二次扩大培养成功的菌液和350ml氧化亚铁硫杆菌液体培养基装至1l锥形瓶中，使用饱和naoh溶液调节ph至2.5左右，置于180r/min、28℃的智能恒温振荡培养箱中持续振荡，每12h用超纯水补充一次蒸发的水分，测一次ph直至ph低至1.0左右氧化亚铁硫杆菌种筛选完成。具体数据见图2f。对图2f分析可知：氧化亚铁硫杆菌第完成第三次扩大培养，体系ph值由2.5降至1.6，时间缩短至5天。氧化亚铁硫杆菌三次扩大培养所需的时间规律与氧化硫硫杆菌一致，菌种逐渐适应环境，繁殖速度不断增加，菌种浓度不断升高。但是每次扩大培养完成时间长于氧化硫硫杆菌，这是由于氧化亚铁硫杆菌产酸能力弱于氧化硫硫杆菌，且氧化亚铁硫杆菌适合于弱酸环境下生长，较低的ph值对其生长繁殖有较强的抑制作用。

（5）污泥第一次驯化

按20%的接种比，取250ml扩大培养成功的氧化硫硫杆菌和氧化亚铁硫杆菌菌液与2l污泥装至小桶中，加入3g/l的s⁰和硫酸亚铁能源物质。在小桶中进行28℃恒温曝气培养。每12h进行ph检测观察ph变化，定期使用自来水补充蒸发失去的水分。污泥ph低至2.0左右表示第一次污泥驯化完成。具体数据见图3a：混合菌种进行污泥第一次污泥驯化，污泥体系ph值由6.5降至2.0，需要时间10天左右。前三天体系ph值下降较快，直接由6.5下降至3.0，后期下降速度变慢，ph值由3.0下降至2.0，用了7天时间。分析原因：前期污泥体系ph值较高处于弱酸环境适宜菌种生长繁殖，产酸能力较强。后期污泥体系ph值较低，抑制菌种生长繁殖，产酸能力逐渐下降。

（6）污泥第二次驯化

与第一次污泥驯化步骤一样，使用50%的接种比。具体数据见图3b：混合菌种进行第二次污泥驯化，体系ph值由4.0下降至2.0，需要时间4.5天。ph值变化趋势与第一次污泥驯化相同，驯化所需时间由10天缩短至4.5天，这是由于菌种逐渐适应污泥环境，生长繁殖速度得到提高。

（7）污泥第三次驯化

与污泥第二次驯化步骤一致，污泥驯化成功，生物沥滤混合菌种获得。具体数据见图3c：混合菌种进行第三次污泥驯化，污泥体系ph值由4.5下降至2.0，时间进一步缩短至3天。菌种不断适应污泥环境，生长繁殖速度与产酸能力进一步得到提高，菌种驯化时间进一步缩短。三次驯化结束后，酸化污泥即可作为生物沥滤处理的接种污泥。

实施效果例

由图1a、2a、2c、2e可知：完成氧化硫硫杆菌的筛选需要时间7天左右，三次扩大培养所需时间分别为4天、2.5天、2.5天。后期扩大培养时间缩短是由于菌种逐渐适应环境，生长繁殖速度不断加快，菌种浓度不断升高，产酸能力逐渐增强。16天左右即可获得满足菌种浓度要求的氧化硫硫杆菌菌液。

由图1b、2b、2d、2f可知：氧化亚铁硫杆菌筛选完成时间约为11天，三次扩大培养所需时间分别为7天、5.6天、5天，经过29天左右的菌种筛选与扩大培养，即可和获得氧化亚铁硫杆菌菌液。

两种菌种经过自配培养基的筛选与扩大培养，即可获得满足浓度要求的菌液，省却了菌种分离纯化的步骤，仍能获得所需菌种，本技术在降低菌种获得成本的同时，还缩短了菌种获得的时间。

由图3a、3b、3c可知：将两种菌种混合进行污泥驯化，完成污泥三次驯化时间分别为10天、4.5天、3天，菌种逐渐适应污泥环境，产酸能力不断增强，驯化时间不断缩短。经过18天左右的污泥驯化，即可获得可直接进行接种的酸化污泥。

生物沥滤改善剩余污泥脱水性能的过程中并非是单单依靠某一种或两种细菌，而是利用混合菌群的共同作用，嗜酸性菌种属于协同作用中的优势菌种。传统的实验室分离纯种菌种属于单一菌种，而本发明中混合菌种直接由污水处理厂污泥中筛选扩大培养而来，相较于购买或从泉水矿山废水中驯化分离出的纯种菌株，既完成了优势嗜酸菌的富集，又保留了其在自然环境中的协作菌群结构，因此本发明方法筛选出的嗜酸性菌种在进行污泥驯化时，能够更快的生长繁殖，缩短了污泥驯化的时间，且在生物沥滤改善剩余污泥脱水性能的实际工程应用中具有更快的适应性和高效性，有利于工程推广和应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。