构建食烷菌敲除酰基辅酶A硫脂酶基因的方法和应用与流程

本发明基因工程技术领域，特别涉及一种构建食烷菌中敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用。

背景技术：

聚羟基脂肪酸酯(pha)是唯一的一种由微生物生产、可被微生物降解的热塑性塑料材料，作为石油基塑料的替代品，可缓解日益严重的塑料污染问题。目前，pha通过细胞内累积的方式发酵生产。pha作为细菌的胞内储能物质，累积量无法超过细胞干重，使生产速度直接受细菌生命周期长度影响。具有持续胞外分泌pha能力的菌株，能有效提高细菌单位时间生产pha的效率。

食烷菌具有完整的油类代谢途径，能够合成脂肪酸、甘油三酯和蜡酯并分泌到细胞外。虽然食烷菌也能合成pha，但是由于3-羟基脂肪酸((3-ha)和pha的合成途径使用相同的前体，两者是竞争途径的关系，所以通常食烷菌内并没有累积pha。

通过转座子随机突变，在食烷菌的酰基辅酶a硫脂酶(tesb)基因插入一段序列，会使食烷菌失去3-ha合成能力，从而激活pha的合成途径，并实现pha胞外分泌。但是，转座子突变属于有痕突变，这种突变方法在原有基因中插入大片段序列，虽然使得基因失活，但是可能对下游基因表达产生未知影响。而且，转座子突变的随机性决定这种方法一方面无法进行定点突变，另一方面耗时耗力。因此，这种方法无法用于食烷菌在基因水平上的进一步优化。

技术实现要素：

本发明所解决的技术问题是针对现有技术中的食烷菌缺少稳定的定点基因敲除方法，而提供一种基于crispr-cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法。使用该方法通过敲除酰基辅酶a硫脂酶(tesb)基因得到重组菌，使食烷菌所产pha分泌到细胞外，使食烷菌在生命周期内累积的pha超过细胞总重量，从而提高pha生产效率的食烷菌酰基辅酶a硫酯酶基因敲除株利用十八烷烃或丙酮胞外制备pha的方法。

本发明的技术解决方案是所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法，其特殊之处在于，所述方法通过crispr-cas9双质粒基因编辑技术，无痕敲除除食烷菌酰基辅酶a硫脂酶基因，得到重组菌，使食烷菌所产聚羟基丁酸酯分泌到细胞外；所述tesb基因的核苷酸序列，其上游和下游核苷酸序列如序列表序列1、序列2和序列3所示；所述食烷菌为alcanivoraxborkumensis，保藏号为dsm11573；双质粒系统包括：工具质粒pcas9，addgene编号#62225，和辅助质粒ptargetf，addgene编号#62225。

作为优选：所述构建食烷菌中敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：

⑴构建重组辅助质粒：替换辅助质粒ptargetf中的向导rna(grna)片段，插入供体分子(donor)的核苷酸序列，得到重组辅助质粒ptargetf-grna-donor；所述grna的核苷酸序列包括具有特异性的待敲除基因中的一段20bp的片段和grna骨架(grnascaffold)共同组成识别切割位点的片段，所述片段如序列表中序列4所示；所述供体核苷酸序列为基于食烷菌基因组中酰基辅酶a硫酯酶基因的上游序列和下游序列合成的序列，所述上游序列和所述下游序列如序列表中序列2和序列3所示；

⑵将所述重组辅助质粒和工具质粒导入出发菌株，实现基因敲除，得到包含质粒的敲除株；所述食烷菌为出发菌株；

⑶包含双质粒的敲除株在异丙基-β-d-硫代半乳糖苷诱导下消除工具质粒，在37℃培养下消除重组辅助质粒，即得到所述敲除株。

本发明的第二技术解决方案是基于crispr-cas9双质粒系统的基因编辑方法构建食烷菌敲除株的方法，其特殊之处在于，包括如下步骤：

⑴制备质粒：

(1.1)替换grna的特异性片段：以酰基辅酶a硫酯酶基因(tesb)序列为模板，设计特异性识别所述基因的grna；根据原质粒序列和特异性grna片段设计一对引物，利用反向聚合酶链式反应(反向pcr)，用特异性grna片段替换ptargetf上的原grna片段，所得到的线性化质粒为ptargetf-grna；

(1.2)合成供体分子：以tesb基因的上游序列和下游序列为模板，各设计一对引物；

上游序列的正向引物含ecori酶切位点，下游序列的反向引物含hindiii的酶切位点，在适宜的条件下进行重叠聚合酶链式反应(重叠pcr)反应，回收得到带有酶切位点的供体分子；供体分子序列如序列表中序列5所示；

(1.3)连接质粒骨架和同源臂：使用ecori、hindiii限制性内切酶在适宜条件下分别双酶切质粒ptargetf-grna和dna片段donor，回收线性化产物；回收线性化产物，在t4连接酶作用下进行连接，回收得到质粒ptargetf-grna-donor；所述质粒序列如序列表中序列6所示；

⑵制备敲除株：

(2.1)质粒导入食烷菌：将质粒ptargetf-grna-donor和质粒pcas分别以电转化形式转入食烷菌，在卡那霉素(50mg/l)和壮观霉素(50mg/l)的onr7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pcas和ptargetf-grna-donor所构成双质粒系统的食烷菌菌株；所述onr7a培养基为德国微生物菌种保藏中心dszm950培养基；

(2.2)消除质粒：所述双阳性克隆转接至含卡那霉素(50mg/l)和iptg(0.5mm)的onr7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒ptargetf-grna-donor；涂布培养液于含卡那霉素(50mg/l)的onr7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pcas的重组菌；

所述单阳性克隆转接于onr7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pcas；涂布培养液于onr7a平板，得到无质粒的重组菌；

⑶验证重组菌：以重组菌作为模板进行pcr，使用上述(1.2)中的tesb基因的上游序列的正向引物和tesb基因的下游序列的反向引物，在适宜体系和程序下进行pcr反应，回收pcr产物进行测序，测序结果与供体序列一致，证明同源重组正确，获得食烷菌tesb基因的敲除株。

本发明的第三技术解决方案是重组食烷菌酰基辅酶a硫酯酶基因敲除株利用十八烷烃胞外制备pha的方法，其特殊之处在于，敲除株以十八烷烃为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加1.5％(wt/vol)十八烷烃的mm培养基；mm培养基成分包括(g/l)：na2hpo4_4、kh2po4_2.65、(nh4)2so4_0.5、mgso4_0.2和微量元素1ml(浓度g/l：cuso4·6h2o_0.155、nso4·7h2o_0.153、cocl2·6h2o_0.22、mncl2·4h2o_0.0589、cacl2_7.8、fecl3·6h2o_20)；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非pha物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥48h，得到pha。

本发明的第四技术解决方案是重组食烷菌酰基辅酶a硫酯酶基因敲除株利用丙酮酸胞外制备pha的方法，其特殊之处在于，敲除株以丙酮酸为唯一碳源进行发酵；发酵培养基：添加2％(wt/vol)丙酮酸的mm培养基；mm培养基成分包括(g/l)：na2hpo4_4、kh2po4_2.65、(nh4)2so4_0.5、mgso4_0.2和微量元素1ml(浓度g/l：cuso4·6h2o_0.155、znso4·7h2o_0.153、cocl2·6h2o_0.22、mncl2·4h2o_0.0589、cacl2_7.8、fecl3·6h2o_20)；培养条件为30℃、200rpm振荡培养48-72h；取全部发酵液进行冷冻干燥，干燥菌体中加入10倍菌体量体积的氯仿，90℃提取4h，提取完毕后静置冷却，过滤去除非pha物质，取上清液加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃混匀后静置，过滤后干燥，得到pha。

与现有技术相比，本发明的有益效果:

⑴本发明能对食烷菌中目标基因进行精确无痕敲除或敲入。

⑵本发明的基因编辑和验证的全过程不超过两周，省去耗时耗力的大规模的文库筛选。

⑶本发明所述的方法能可重复地改造野生菌株获得敲除tesb基因株，实现聚羟基脂肪酸酯胞外分泌株。

⑷本发明通过crispr-cas9双质粒基因编辑技术，能够无痕敲除tesb基因，能精确控制被敲除的序列长度，不影响相邻的脂酰基转移酶基因,敲除株具有产pha并分泌到细胞外的能力。

附图说明

图1是本发明ptargetf-grna-donor质粒构造途径示意图。(a)质粒装配主要步骤。(b)ptargetf-grna-donor质粒图谱。(c)酰基辅酶a硫脂酶基因和供体分子的位置。

图2是食烷菌敲除株利用十八烷烃或丙酮酸产聚羟基脂肪酸酯的效率与出发菌株的对比图。

图3a是聚羟基丁酸酯标准物质的gc-ms的峰图。

图3b是食烷菌敲除株以十八烷烃为碳源生长的冻干细胞的氯仿提取物的gc-ms峰图。

图3c是食烷菌敲除株以丙酮酸为碳源生长的冻干细胞的氯仿提取物的gc-ms峰图。

具体实施方式

本发明下面将结合实施例作进一步详述：

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均构自常规生化试剂商店。以下实施例中的定量实验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

·关键物质来源

本发明使用的出发菌株食烷菌为alcanivoraxborkumensisdsm11573；

本发明使用的质粒ptargtf和pcas来自addgene。

·术语

本文所使用的术语phb代表聚3-羟基丁酸酯；

本文所用的术语tesb代表酰基辅酶a硫脂酶基因；

本文所用术语grna代表可识特异性别待敲除基因向导rna；

本文所用术语donor代表插入待敲除基因上游和下游核苷酸序列合成的供体分子；

本文所用的术语ptargetf-grna-donor代表替代gtargetf质粒中的向导rna的特异性片段，并插入供体分子的质粒；

本文所用的重组菌和敲除株代表敲除tesb基因后的食烷菌；

本文所用的术语onr7a是食烷菌专用培养基，其配方来自德国微生物菌种保藏中心，编号为dsmz950(https://www.dsmz.de/microorganisms/medium/pdf/dsmz_medium950.pdf)。

实施例1、制备重组食烷菌

1、制备质粒：

a)替换grna：食烷菌基因组上tesb基因核苷酸序列为模板，所述核苷酸序列如序列表的序列1，设计特异性grna的核苷酸序列，所述核苷酸序列如序列表的序列4；基于质粒ptargetf的启动子j23119(spei)promoter和序列4设计正向引物pl-f(gagaccgagagagggtctcagttttagagctagaaatagcaa)和反向引物pl-r(actagtattatacctaggactgagc)，合成磷酸化的引物，进行反向pcr。

反向pcr步骤如下：

1)以原始质粒为模板1μl，添加正向引物pl-f和反向引物pl-r，各1μl，高保真酶25μl(primestarmaxdnapolymearse，takara)，以去rna水补充至体积50μl，于94℃下预变性6min，以94℃下45s、53℃下45s、72℃下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72℃下延伸10min；

2)琼脂糖凝胶电泳分离扩增产物，胶回收试剂盒(ag21005，艾科瑞生物)对目标片段进行回收，回收得到的线性化片段在t4连接酶的作用下进行自连，得到环化片段ptargetf-grna；

b)合成供体分子

以食烷菌出发菌株基因组上tesb基因阅读框的上下游序列为模板，并保证下游序列不影响下游的基因完整性，基因与供体序列的相对位置如图1所示，核苷酸序列如序列表序列2和序列3所示，设计上游序列的正向引物pl-f(ccgccggaattccaagtcaaaacgcagtccaatg)和反向pl-r(tgagtggcaccagttccgatttcatgcggtgctttatttaccattcc)，设计下游序列的正向引物pr-f(gcaggaatggtaaataaagcaccgcatgaaatcggaactggtgccac)和反向引物pl-r(acccccaagcttacgccggtaacagaaacctaaca)；其中大写字母分别表示ecori和hindiii酶切位点；donor片段由上游序列、下游序列、ecori酶切位点、hindiii酶切位点以及保护碱基组成；利用所述的两对引物在适宜的体积和条件下利用overlap-pcr合成供体分子。

overlap-pcr步骤如下：

1)以食烷菌出发菌株基因组为模板(1μl)，加入引物pl-f(1μl)和pl-r(1μl)，2xtaq酶(25μl，ag11107，艾科瑞生物)，去rna水补充体积至50μl，于94℃下预变性6min，以94℃下45s、53℃下45s、72℃下90s为一个循环扩增，共31个循环，最后72℃下延伸10min；同样以食烷菌出发菌株基因组为模板，加入引物pr-f和pr-r，于所述上游序列的和核苷酸分子片段pcr扩增的体系和程序下进行pcr反应，得到下游序列的核苷酸分子片段；

2)琼脂糖凝胶电泳(ag21005，艾科瑞生物)纯化回收上游和下游核苷酸分子片段；

3)上游片段和和下游片段各1μl作为共同模板，高保真酶25μl(primestarmaxdnapolymearse，takara)，以去rna水补充至体积49μl，于98℃下预变性2min，以98℃下30s、60℃下40s、72℃下60s为一个循环连接，共5个循环，最后72℃下5min发生互补，得到融合序列片段；

4)在所述融合序列片段体系中加入0.5μl的pl-f为正向引物，0.5μl的pr-r为反向引物，于98℃下预变性2min，以98℃下30s、55℃下30s、72℃下120s为一个循环扩增，共12个循环，最后72℃下延伸5min，得到供体分子；

c)连接质粒骨架和同源臂：

使用1μl的ecori、1μl的hindiii限制性内切酶、2μl的10x缓冲溶液、去rna水16μl，质粒ptargetf-grna或供体分子1μl，在37℃孵育30min，回收线性化产物以3:1的摩尔比混合供体分子与质粒，体系中dna含量约为50-100ng，10xt4连接酶缓冲溶液2μl，t4连接酶2μl，去rna水补足体积至20μl，与16℃孵育过夜连接得到ptargetf-grna-donor；

2、制备敲除株：

a)质粒导入食烷菌：将质粒ptargetf-grna-donor和质粒pcas分别以电击的方式转化形式转入食烷菌出发菌株，在卡那霉素(50mg/l)和壮观霉素(50mg/l)的onr7a平板上筛选出双阳性克隆，得到含有pcas和ptargetf-grna-donor所构成双质粒系统的食烷菌；

电转化步骤如下：

1)在onr7a培养基中培养至培养液在600nm波长下的吸光度达到0.4；

2)细胞在灭菌后的超纯水中洗3次，重悬液置于冰上；

3)在0.1cm的电击杯中加入20μl细菌重悬液，和1-8μl质粒溶液(dna含量50-100ng)；

4)使用电穿孔仪(1652100，bio-rad)，电击条件为12kv，电击后加入onr7a培养液，30℃培养。

b)消除质粒:所述筛选得到的双阳性克隆转接至含卡那霉素(50mg/l)和iptg(0.5mm)的onr7a液体培养基，30℃过夜培养，消除质粒ptargetf-grna-donor；涂布培养液于含卡那霉素(50mg/l)的onr7a平板上，筛选出单阳性克隆，得到含有单一质粒pcas的重组菌；

所述单阳性克隆转接于onr7a培养基，37℃过夜培养，消除温敏型质粒pcas；涂布培养液于onr7a平板，得到无质粒的重组菌；

c)验证重组菌:以重组菌基因组为模板，pl-f为正向引物，pr-r为反向引物，适宜体系和程序下进行pcr反应，回收产物进行测序结果与供体分子序列一致，即重组菌基因组上不含tesb基因。

实施例2、重组食烷菌利用十八烷烃胞外产pha

1、制备种子液：取敲除株接种至onr7a培养基平板，30℃培养3天，获得活化菌种；平板上挑选单菌落接种于装有10ml液体onr7a培养基的50ml锥形瓶内，30℃摇床培养3天，获得一级种子液；10％的接种量转接一级种子液到含10ml液体onr7a培养基的50ml锥形瓶内，30℃摇床培养24h，获得二级种子液；

2、以十八烷烃为唯一碳源进行发酵:取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48h或72h；发酵培养基：添加1.5％(wt/vol)十八烷烃的mm培养基；mm培养基成分包括(g/l)：na2hpo4_4、kh2po4_2.65、(nh4)2so4_0.5、mgso4_0.2和微量元素1ml(浓度g/l：cuso4·6h2o_0.155、znso4·7h2o_0.153、cocl2·6h2o_0.22、mncl2·4h2o_0.0589、cacl2_7.8、fecl3·6h2o_20)；

3、胞外pha提取：发酵后，取全部发酵液进行冷冻干燥(将装有液相体系的离心管先置于-80℃预冷1h，再放入真空冷冻干燥仪中12h，得到全发酵液的冷冻干燥产物，并称重；室温条件下，加入10倍体积的氯仿洗脱，90℃提取4h，静置冷却，过滤去除非pha物质，加入2.5倍氯仿体积的冷乙醇4℃搅拌，沉淀过滤60℃干燥24h，得到pha干燥产物，称重计算每升培养基胞外pha的产量，单位mg/l；

4、制备pha酯化样品：取上述pha干燥产物加入氯仿1ml，加入1ml的酯化液(含15％浓硫酸的甲醇溶液)混匀，加盖密闭，100℃油浴150min进行酸性条件下的甲酯化反应；冰浴冷却5min，加入1ml去离子水，充分混匀30s，静置1min，取下层有机相150μl进行气相色谱分析；

5、gc分析pha的种类:取20-25mg的聚3-羟基丁酸酯(phb)作为标准样品；气相色谱(gc)分析参数：使用db-wax型号柱(agilenttechnologies，g6501-ctc)分析被测物质；流动相为氦气，平衡溶剂为氯仿试剂；进样口、检测器温度分别为250℃、275℃；起始色谱柱温度80℃维持2min，然后以10℃/min的速率升至245℃维持1min；进样量1μl，分流比1:8，进样速率0.7ml/min；通过比较待测样品和标准样品在相同保留时间确定pha的种类。

实施例3、重组食烷菌利用丙酮酸胞外产pha

1、制备种子液：同实施例2(1)；

2、以丙酮酸为唯一碳源进行发酵：取2.5ml步骤1得到的种子液，接种于47.5ml发酵培养基，30℃、200rpm振荡培养48-72h；发酵培养基：含2％(wt/vol)丙酮酸的mm培养基，mm培养基见实施例1(2)；

3、胞外pha提取：同实施例2(3)；

4、制备pha酯化样品：同实施例2(4)；

5、gc分析pha的种类:同实施例2(5)。

从图2能看出食烷菌的敲除株胞外累积pha的速度比出发菌株快，且食烷菌敲除株利用十八烷烃累积pha的能力大于丙酮酸。此外，从图3能确定食烷菌敲除株产pha的种类为聚羟基丁酸酯。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明权利要求范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明权利要求的涵盖范围。

北京大学深圳研究院

构建食烷菌敲除酰基辅酶a硫脂酶基因的方法和应用

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人工序列

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