一种干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法
技术领域
1.本发明涉及干细胞培养领域，尤其是涉及一种干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法 。
背景技术：
2.干细胞种类很多，已经在疾病治疗、医美、抗衰、药物筛选等众多领域大量应用。干细胞培养已经成为整个干细胞产业链发展的制约瓶颈，干细胞培养器已经成为干细胞培养领域的开发热点。按干细胞培养装置的特点，分为2d培养与3d培养两大类。2d培养主要通过增大皿进行，批量换液、扩散法供气。3d培养主要在立体容器中完成，可以自主调控培养液的组成，可以主动向培养液供气，对培养过程的调控手段更丰富，3d培养技术逐渐成为干细胞产业链的主流。
3.干细胞3d培养载体是影响干细胞3d培养产业链发展的重要因素，有众多厂家进行干细胞3d培养载体研究开发，尤其是多数厂家制造多孔微载体进行干细胞3d培养。但这些多孔载体中的孔道大多都是随机生成，或间断或连续，孔道或宽或窄，无法研究孔道直径大小与干细胞3d增殖之间的相互关系，更无法预知不同孔道直径的载体在干细胞3d培养产业 中的作用。
技术实现要素：
4.针对上述不足，本发明提供干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法，其实质利用纳米碳酸钙增强明胶胶液的加工性能，保证明胶可以制备形成不同内径的毛细管，并组装的毛细管束用于干细胞3d培养。同时，还可以利用纳米碳酸钙的表面能吸附赖氨酸、精氨酸、组氨酸，增强干细胞在毛细管束中的吸附与增殖。纳米碳酸钙及其表面吸附的氨基酸，都可以在干细胞增殖过程中被分解增加毛细管之间的沟通连接，增强培养系统的均质性。
5.交联明胶制备的干细胞3d培养用用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束能够用胶原蛋白酶温和裂解，有效避免载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。
6.本发明提供的一种干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法，具体步骤如下：s1 将明胶与纳米碳酸钙按比例混合后制成胶液；s2 将胶液拉制成特定内径的毛细管，利用高浓度戊二醛进行快速固定；s3将多根毛细管在外层包裹胶液形成毛细管束，利用戊二醛进行固定与定型；s4将定型后的毛细管束进行冷冻切割，获得毛细管束小段；s5毛细管束小段清洗脱除戊二醛，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束。
7.优选地，利用纳米碳酸作为助剂提高明胶的加工性能，可以使用明胶胶液拉制成
不同内径的毛细管。
8.优选地，s2中胶原（或明胶）与纳米碳酸钙混合胶液拉制的毛细管直径为0.1-2mm。
9.优选地，毛细管利用戊二醛快速固定后直接多根并组后包裹胶液制备毛细管束。
10.优选地，定型后的毛细管束采用冷冻切割法制成毛细管束小段。
11.优选地，优先采用辐照灭菌的方法进行毛细管束小段的无菌处理。
12.优选地，干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束可以用胶原蛋白酶裂解并释放其内部培养的干细胞。
13.优选地，利用纳米碳酸钙吸附赖氨酸、精氨酸、组氨酸的一种或几种，将相应的氨基酸固定在干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束中。
14.优选地，干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束不仅满足msc类干细胞3d培养制备，也适用hsc类干细胞3d培养制备。
15.有益效果：本发明提供一种干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法，其实质利用纳米碳酸钙增强明胶胶液的加工性能，保证明胶可以制备形成不同内径的毛细管，并进一步组装为毛细管束用于干细胞3d培养。还可以利用纳米碳酸钙的表面能吸附赖氨酸、精氨酸、组氨酸，增强干细胞在毛细管束中的吸附与增殖。纳米碳酸钙及其表面吸附的氨基酸，都可以在干细胞增殖过程中被分解增加毛细管之间的沟通连接，增强培养系统的均质性。交联明胶制备的干细胞3d培养用用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束能够用胶原蛋白酶温和裂解，有效避免载体裂解并释放干细胞时对干细胞的损伤。
16.下面结合实施例对本发明作进一步说明。本发明中涉及到研发团队已经申报专利的相关技术、方法与设备，在实施例中仅重点说明相关专利技术或方法或设备在干细胞3d细胞制备过程中的主要用途，不再具体描述已申报专利的具体细节。
17.实施例1（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶与纳米碳酸钙按比例（1：0.5）混合后制成胶液；s2 将胶液拉制成特定内径0.3mm的毛细管，利用10%高浓度戊二醛进行快速固定；s3将7根毛细管合组在外层包裹胶液形成毛细管束，利用2.5%戊二醛进行固定与定型；s4将定型后的毛细管束进行冷冻切割，获得毛细管束小段10mm；s5毛细管束小段清洗脱除戊二醛，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束。
18.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s6利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x 一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x 一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8 一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）；s7将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖；s8 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细
胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(97.97%)、cd 44(99.48%)、cd73 (97.78%)、cd90 (98.98%)、cd 105(98.69%); cd14 (0.09%)、cd19 (0.11%)、cd31 (0.14%)、cd34 (0.10%)、cd45 (0.13%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
19.实施例2（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶与纳米碳酸钙按比例（1：1）混合后制成胶液；s2 将胶液拉制成特定内径0.1mm的毛细管，利用10%高浓度戊二醛进行快速固定；s3将6根毛细管合组在外层包裹胶液形成毛细管束，利用2.5%戊二醛进行固定与定型；s4将定型后的毛细管束进行冷冻切割，获得毛细管束小段5mm；s5毛细管束小段清洗脱除戊二醛，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束。
20.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s6利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x
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一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x
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一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8
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一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）；s7将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
21.s8 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(99.57%)、cd 44(99.78%)、cd73 (99.88%)、cd90 (99.98%)、cd 105(99.89%); cd14 (0.19%)、cd19 (0.09%)、cd31 (0.07%)、cd34 (0.09%)、cd45 (0.08%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
22.实施例3（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶与纳米碳酸钙、赖氨酸按（1：2：0.5）比例混合后制成胶液；s2 将胶液拉制成特定内径2mm的毛细管，利用10%高浓度戊二醛进行快速固定；s3将3根毛细管合组在外层包裹胶液形成毛细管束，利用2.5%戊二醛进行固定与定型；s4将定型后的毛细管束进行冷冻切割，获得毛细管束小段20mm；s5毛细管束小段清洗脱除戊二醛，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束。
23.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行msc干细胞3d培养s6利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x
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一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x
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一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8
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一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法）：s7将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与msc干细胞种子混合，按每百万个msc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行msc干细胞3d培养增殖。
24.s8 对获得的msc干细胞进行相应的检测并保存。获得msc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd29(98.57%)、cd 44(99.78%)、cd73 (99.88%)、cd90 (99.68%)、cd 105(98.59%); cd14 (0.15%)、cd19 (0.09%)、cd31 (0.07%)、cd34 (0.19%)、cd45 (0.27%)、hla-dr (0%)； msc干细胞的功能指标超过国内与国际msc表面抗原的要求。
25.实施例4（1）进行毛细管型干细胞3d培养用胶原载体制备s1 将明胶与纳米碳酸钙、精氨酸、赖氨酸按比例（1：0.5：0.1：0.2）混合后制成胶液；s2 将胶液拉制成特定内径0.3mm的毛细管，利用10%高浓度戊二醛进行快速固定；s3将7根毛细管合组在外层包裹胶液形成毛细管束，利用2.5%戊二醛进行固定与定型；s4将定型后的毛细管束进行冷冻切割，获得毛细管束小段10mm；s5毛细管束小段清洗脱除戊二醛，低温干燥脱水，无菌处理后检测与保存，得到干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束。
26.（2）以干细胞3d培养用胶原载体进行hsc类干细胞3d培养s6利用干细胞3d培养仪进行干细胞3d培养增殖；干细胞3d培养仪涉及的已经申报专利为：201910408085.x
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一种干细胞的三维仿真培养系统、201910403665.x
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一种干细胞培养容器内气体平衡的调节方法、201910408089.8
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一种3d干细胞仿真培养设备。具体的msc干细胞3d培养液组成与制备（见申报的专利；202010763841.3一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基；202010763837.7一种干细胞3d仿真培养用增殖培养基的制作方法；s7将毛细管型干细胞3d培养用胶原载体与hsc干细胞种子混合，按每百万个hsc用100mg微载体的比例进行接种，接种后进行hsc干细胞3d培养增殖。
27.s8 对获得的hsc干细胞进行相应的检测并保存。获得hsc按标准操作方法进行流式细胞仪的表面抗原检测，检测结果：cd3
+
cd8
+
、cd3-cd（56+16）
+
、cd3
+
cd56
+
超过95%，抗原表征达到国内与国际标准要求。
28.本发明的一种干细胞3d培养用明胶与纳米碳酸钙共聚毛细管束及其制备方法，包括上述本发明说明书的发明内容和具体实施方式部分的任意组合，限于篇幅并为使说明书简明而没有将这些组合构成的各方案全部进行描述。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。