本发明属于耐药基因检测技术领域，具体涉及一种aac-(6’)-ib-cr基因检测试剂盒。
背景技术：
aac-(6’)-ib-cr是aac-(6’)-ib的突变体。虽然aac-(6’)-ib主要介导对氨基糖苷类的耐药，但aac-(6’)-ib-cr不仅可以介导氨基糖苷类的耐药，还可以介导喹诺酮类的耐药。尤其是aac-(6’)-ib-cr不仅可以通过质粒介导传播，还可以通过染色体间的整合传播，由此导致细菌耐药率逐年升高。因此，该耐药基因为临床治疗带来了巨大压力。
临床上分析该类耐药基因，常采用pcr、电泳、测序等方法，以上方法均相对较为耗时，且耗资较高。因此，可以采取更为简单、高效的核酸检测方法。核酸检测主要集中在dna生物传感器的使用，而该类传感器中使用较为广泛的有荧光传感器。荧光传感器因其高灵敏度、高特异性、简单易操作等优点被熟知。荧光传感器主要使用的有带标记的荧光探针，但往往荧光标记探针较为昂贵。因此，有必要选择一种更为经济、高效的荧光探针对目标物进行检测。针对这一要求，大量可发出荧光的染料被发现。其中较为常用的dna染料包括碘化丙啶(pi)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)等，而rna染料使用的有噻唑橙、吖啶橙等。但这些仍然不能满足需求。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种aac-(6’)-ib-cr基因检测试剂盒。
本发明的技术方案如下：
一种aac-(6’)-ib-cr基因检测试剂盒，包括捕获探针、k+、exoiii和tht；其中，
捕获探针，其5’端具有一第一序列，其3’端具有与aac-(6’)-ib-cr基因完全互补的一第二序列，第一序列与第二序列通过一缓冲序列相连；第一序列与第二序列形成部分间断互补双链，以使得捕获探针呈发卡结构，且在游离情况下，第一序列能够在k+的作用下形成g-四链体；
其反应具体包括：反应的ph为7.3-7.5，当检测样品中存在aac-(6’)-ib-cr基因时，aac-(6’)-ib-cr基因竞争结合第二序列形成双链结构，第一序列脱离捕获探针的3’端，该双链结构被exoiii剪切以释放aac-(6’)-ib-cr基因，缓冲序列防止exoiii剪切第一序列，第一序列处于游离状态，并在k+的作用下形成g-四链体，该g-四链体与tht结合后，增强tht的荧光。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第一序列如seqidno.01所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述第二序列如seqidno.02所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述缓冲序列如seqidno.03所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述捕获探针的序列如seqidno.04所示。
在本发明的一个优选实施方案中，所述反应的温度为25-41℃。
在本发明的一个优选实施方案中，所述反应的时间为10-40min。
在本发明的一个优选实施方案中，所述tht在所述反应的体系中的浓度为2-6μm。
在本发明的一个优选实施方案中，所述exoiii在20μl的所述反应的体系中的用量为1-2.5u。
在本发明的一个优选实施方案中，所述反应的温度为37℃，时间为30min，tht在所述反应的体系中的浓度为5μm，exoiii在20μl的所述反应的体系中的用量为2u。
本发明的有益效果是：
1、本发明中含有g-四链体序列的发夹结构的捕获探针，在目的基因存在的情况下，目的基因可以和发夹探针构成更稳定的双链结构，从而展露第一序列；exoiii剪切发夹探针中与目的基因互补的第二序列从而释放目的基因和第一序列，从而放大信号；第一序列在k+作用下可折叠为g-四链体；在加入tht后，g-四链体可增强tht的荧光信号，能够实现对aac-(6’)-ib-cr基因的简单、快速、灵敏度高、特异性好的检测，在临床耐药基因的检测上有望被广泛应用。
2、本发明的试剂盒在1nm-200nm范围内呈现良好的线性关系，检测限可以达到0.69nm。
3、本发明不需要其他标记，降低了检测成本，具有很高的性价比。
附图说明
图1为本发明的实验原理图。
图2为本发明实施例1中的可行性验证的实验结果图，其中，a：hp；b：hp(200nm)+target(200nm)；c：hp+exoiii(200nm)；d：hp(200nm)+target(200nm)+exoiii(2u)。
图3为本发明实施例1中的琼脂糖凝胶电泳图谱，其中，lane1：hp(3μm)；lane2：hp(3μm)+target(0.5μm)；lane3：hp(3μm)+exoiii(9u)；lane4：hp(3μm)+target(0.5μm)+exoiii(9u)。
图4为本发明实施例1中不同反应温度对荧光强度的影响图，其中，反应条件：hp(200nm)，target(300nm)，ph(7.4)，反应时间30min，exoiii(2u)。
图5为本发明实施例1中不同反应时间对荧光强度的影响图，其中，反应条件：hp(200nm)，target(300nm)，t(37℃)，ph(7.4)，exoiii(2u)。
图6为本发明实施例1中不同核酸外切酶iii的量对荧光强度的影响图，其中，反应条件：hp(200nm)，target(300nm)，t(37℃)，ph(7.4)。
图7为本发明实施例1中不同硫磺素t的浓度对荧光强度的影响图，其中，反应条件：hp(200nm)，target(300nm)，t(37℃)，ph(7.4)，exoiii(2u)。
图8为本发明实施例1中的定量分析的实验结果图。
图9为本发明实施例1中的特异性考察的实验结果图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1
1实验材料
1.1主要试剂和材料
1.2寡核苷酸序列
本实施例使用的寡核苷酸序列均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体如下表1所示：
表1本实施例中使用的寡核苷酸序列
捕获探针(hp，seqidno.04)中下划线的一段核酸序列为第二序列(seqidno.02)，其与目的基因(target，seqidno.05)中下划线的一段核酸序列互补；加粗的一段核苷酸序列为第一序列pu22(seqidno.01)，其在k+存在下，可以形成二维结构的g-四链体，第一序列和第二序列通过缓冲序列相连(aaaa，seqidno.03)。t1、t2及t3(seqidno.06-08)核苷酸序列分别为单碱基突变序列、双碱基突变序列和三碱基突变序列，其中下划线的碱基为突变位点。
1.3溶液配制：
(1)0.01mol/lte(ph8.0)缓冲溶液：精确称取0.2422gtris、1.1688gnacl和0.0585gedta溶于200ml超纯水中，混匀，并用1m的naoh和hcl调节ph至8.0。
(2)0.01mol/ltris-hcl(ph7.4)反应缓冲溶液：精确称取0.2422gtris和1.1688gnacl溶于200ml超纯水中，混匀，并用1m的naoh和hcl调节ph至7.4。
(3)3mol/lkcl：精确称取44.73gkcl溶于200mltris-hcl(ph7.4)缓冲液中。
(4)1mmol/l硫磺素t(tht)的配制：精确称取0.0318g硫磺素t溶于100ml超纯水中，用棕色玻璃瓶盛装。待充分溶解后于4℃保存。使用时取该浓度硫磺素t(1：20)稀释后使用。
(5)5×tbe缓冲液：精确称取54gtris、4.04gedta和27.5g硼酸溶于1000ml超纯水中，混匀，并用1m的naoh和hcl调节ph至7.4。后续的实验用超纯水将其稀释为0.5×tbe缓冲液后使用。
(6)dna探针的使用和分装：取装有纯化后的寡核苷酸序列冻干粉的冷冻管于高速离心机中离心(4000rpm，4℃，10min)，后按照说明移取相应体积的te缓冲溶液于冷冻管中溶解寡核苷酸序列至100μm。将母液按需分装为若干管，于-20℃冰箱保存。使用时取出分装后的母液用tris-hcl(ph7.4)缓冲液稀释到相应浓度后使用。
2实验方法
2.1实验过程
(1)将分装好的发夹捕获探针(hp)用tris-hcl(ph7.4)缓冲液稀释至10μm，在使用前需经95℃加热5min后并缓慢冷却至室温，然后放置于4℃冰箱保存。
(2)在20μl反应体系中分别准确加入hp(2μl10μm)，tris-hcl(14μl)，10×nebbuffer1(2μl)和各种浓度的目标基因(2μl)，exoiii(2u)吹打混匀后于37℃反应30min。将反应后的溶液、kcl(2.5μl，3m)、tris-hcl(67.5μl)、tht(10μl，50μm)加入到棕色ep管中，吹打混匀。随后，4℃避光静置15min。
(3)反应结束后进行荧光强度检测。
2.2样品的荧光检测
本实验使用的荧光分光光度计为安捷伦carryeclipse荧光分光光度计。样本检测所使用的样本池为100μl的微量石英比色皿。实验中，荧光分光光度计采用的电压为570v，激发狭缝同发射狭缝均为10nm，扫描速度为1200nm/min，激发波长441nm，发射波段为460-600nm进行扫描，记录460nm处至600nm处的荧光值。
2.3琼脂糖凝胶电泳
20μl反应液吹打混匀后于37℃反应30min后，75℃加热25min。取反应溶液各5ul同1ulloadingbuffer吹打混匀，加入到配置好的3.5％琼脂糖凝胶对应的孔道中。凝胶在110v恒定电压下运行75min，最后用凝胶成像仪拍摄。
2.4模拟样品处理
取正常人血清(索莱宝生物科技)稀释1000倍后，加入相应浓度的目的基因配成相应浓度的模拟样品。4℃保存。
取临床细菌感染样本做培养，取生长良好的菌落于生理盐水中制成混悬液。取1xpbs溶解混悬液至0.5个麦氏单位，加入相应浓度的目的基因配成相应浓度的模拟样品。4℃保存。
3实验结果
3.1实验原理
如图1所示，本实施例设计了一个发夹结构的捕获探针。该捕获探针包含了三个部分，发夹探针的5’端为一段核酸序列(pu22)，该序列与发夹探针3’端一段与目的基因完全互补的序列形成部分间断互补双链，二者之间的结合力相对较弱；中间紧挨着pu22的为4个富腺嘌呤(a)核酸序列，该段序列为缓冲序列，可以防止exoiii剪切pu22、减少空间位阻；其后3’端是一段与目的基因完全互补的序列。当目的基因存在时，目的基因竞争结合该完全互补序列，形成结合力更强更稳定的双链结构，pu22被目的基因竞争脱离探针3’端得以暴露，互补序列被exoiii剪切。一轮剪切后，目的基因得以释放进入下一轮剪切，从而放大信号。释放的pu22核酸序列在k+存在下构成g-四链体。当加入tht后，g-四链体结合tht，并增强其荧光强度。通过荧光分光光度计可以记录该荧光强度的改变。正是由于本方法采用exoiii、g-四链体/tht复合物检测目的基因，使该检测方法在具有简便性的同时具有较高的灵敏度和特异度。
3.2方法的可行性验证
为了验证本实施例用于检测aac-(6’)-ib-cr的可行性，在量化aac-(6’)-ib-cr时获得了荧光光谱，结果如图2所示。如图所示，不含目的基因时监测到非常微弱的信号(曲线a，c)，表明hp未结合任何单链，g-四链体没有形成；在加入目的基因后，监测到的信号强度高于未加目的基因时的信号强度，这是由于目的基因与发夹探针互补配对，导致发夹探针打开，暴露出g-四链体序列，经折叠构成g-四链体后与tht结合增强信号强度(曲线b)；当目的基因与exoiii同时存在，检测到的信号(曲线d)远高于目的基因单独存在时的信号(曲线c)。由荧光图谱可知，信号强度在460-600nm波长范围内显著增强，其中，峰值在出现在490nm处。因此，随后的相关检测在490nm处取值。上述对比实验结果表明，基于exoiii、g-四链体/tht复合物的egtf荧光传感器可以用于检测aac-(6’)-ib-cr基因。
3.3凝胶电泳表征
本实施例以3.5％琼脂糖凝胶电泳证实了该荧光传感器的可行性。由图3电泳图谱可知，1号泳道是发夹探针。2号泳道有两个条带，前方条带是发夹结构的捕获探针，后方条带是由捕获探针和目的基因配对结合的dsdna。3号泳道是发夹结构的捕获探针和exoiii同时参加反应，由图可见，发夹结构的捕获探针对应的条带没有明显改变。4号泳道是发夹结构的捕获探针、目的基因、exoiii同时反应。其中，发夹结构的捕获探针对应的条带消失，说明发夹结构的捕获探针被剪切；前方有一条带，即生成的ssdna。上述对比实验表明，在加入目的基因后，发夹探针可与目的基因结合，从而显露出pu22，同时，exoiii剪切互补序列从而放大信号。因此，本实施例可以用来检测耐药基因aac-(6’)-ib-cr。
3.4各项条件的优化
为了提高检测体系的灵敏度，本实施例接下来分别就反应的温度、核酸外切酶iii的量、反应的时间、硫磺素t的浓度等4个实验条件进行了优化。
3.4.1反应的温度的优化
本发明的检测体系依靠碱基互补配对展开，而碱基互补配对有与之适合的温度，同时核酸外切酶拥有最适的酶切温度。因此对反应温度进行考察是十分必要的。因此，本实施例对检测体系的反应温度进行了优化。本实施例对不同反应温度对荧光强度的影响进行了分析，设置了4℃为间隔考察不同反应温度对检测效果的影响，分别选取25℃、29℃、33℃、37℃和41℃不同的反应温度进行了实验。由图4可知，在目标dna存在的情况下，自25℃起，随着温度的上升，荧光强度也随之增加。当温度为37℃时，荧光信号最强。当温度高于37℃时(41℃)，信号强度略微下降。可见，37℃是该检测体系的最佳反应温度。因此，本实施例选定37℃为检测目标dna的最优反应温度。
3.4.2反应时间的优化
由于dna杂交能力较强，exoiii作用的效率相对快速，若将反应时间设定太短，会剪切不完全；若将反应时间设置太长，会剪切过度，且将增加非特异性吸附及延长检测时长。同样，exoiii剪切发夹探针需要合适的反应时间，从而尽可能放大信号。因此，选择合适的反应时间对提高检测体系的性能是十分重要的。因此，本实施例设置10min为间隔考察不同反应时间对检测效果的影响，分别选定了10min、20min、30min和40min作为不同的反应时间进行研究。如图5可知，自10min起，信号强度已经到达较高的水平，但随着时间的增加，荧光强度依旧在小范围增长。直至反应时间到达30min时，信号强度达到最大。当反应时间继续增加时，信号强度未产生较明显的改变。由此可见，在反应30min后，反应达到最佳状态。因此，选定为30min为检测目的基因的最佳反应时间。
3.4.3核酸外切酶iii的量的优化
exoiii的量的使用对荧光强度的大小可产生影响。当使用量过低，剪切较局限，从而不能最大限度的放大信号。当浓度过高时，会导致背景信号较高，无法检测到较低浓度的靶标，因此，选择合适的exoiii的量对提高检测体系的性能是十分重要的。因此，本实施例设置0.5u为间隔考察不同exoiii的量对检测效果的影响，分别选定了1u、1.5u、2u和2.5u作为不同的exoiii的量进行研究。如图6可知，自1u起，信号强度随着酶量的增加而增加。直至酶用量到达2u时，信号强度达到最大。酶的用量继续增加时，信号强度未产生较明显的改变，即酶用量到达2u后，反应达到最大状态。故选定为2u为核酸外切酶iii的最佳反应量。
3.4.4硫磺素t浓度的优化
硫磺素t的使用浓度对荧光强度的大小可产生影响。当浓度过低，产生的信号差异较小，从而不能以最大限度的检测目的基因。当浓度过高时，会导致背景信号较高，无法检测到较低浓度的靶标，选择合适的反应浓度对提高检测体系的性能是十分重要的。因此，本实施例设置1μm为间隔考察不同硫磺素t的浓度对检测效果的影响，分别选定了2μm、3μm、4μm、5μm和6μm作为不同的反应浓度进行研究。如图7可知，自2μm起，信号强度随着浓度的增加而增加。直至硫磺素t浓度到达5μm时，信号强度达到最大。当浓度继续增加时，信号强度未产生较明显的改变。由此可见，硫磺素t的浓度到达5μm后，反应达到最佳状态。因此，选定为5μm为硫磺素t的最佳反应浓度。
3.5目标dna(aac(6’)-ib-cr)的定量分析
在最优的实验条件下，本实施例对不同浓度的目标基因(aac-(6’)-ib-cr)进行了定量分析，从而检测egtf荧光传感器的分析性能。由图8(a)可知，不同浓度的目标产生了不同的荧光信号。图8(b)为荧光信号与目的基因之间的散点关系图。信号强度随着目标基因aac-(6’)-ib-cr的浓度增加而增强，呈现线性相关关系。这是因为在目的基因存在下，发夹探针被特异性识别，暴露的pu22在k+存在下折叠为二维结构从而获得显著增强的荧光信号。图8(b)显示，目标基因(aac-(6’)-ib-cr)的浓度从1nm逐渐增加到300nm，荧光强度随着目的基因的增加而增加。当目的基因在1nm至200nm间增长，荧光强度呈现线性相关关系，当目的基因的浓度继续增加，荧光强度虽然依旧增长，但增加幅度开始降低。在1nm至200nm范围内，荧光强度与目标基因的浓度呈现良好的线性关系，线性拟合方程为y＝2.278x+37.34，其中，y为荧光信号强度，x为目标基因的浓度(nm)，线性相关系数为r2＝0.9860，根据3σ/s原则，检测限为0.69nm。
通过将本实施例提出的检测方法学与已经建立的相关dna检测方法学进行比较，分析本方案的性能。如表2所示，发现相较于双酶辅助的荧光传感器(leeij，gooni，kimde.label/quencher-freedetectionofsingle-nucleotidechangesindnausingisothermalamplificationandg-quadmplexes[j].analyst，2016，141(24)：6503-6506.)、无标记荧光传感器(zhouw，yuz，mag，jint，liy，fanl，lix.thioflavintspecificallybrightening″guanineisland″induplex-dna：anovelfluorescentprobeforsingle-nucleotidemutation[j].analyst，2019，144(7)：2284-2290.
以及
zhangxf，xuhm，hanl，linb，luohq.athioflavint-inducedg-quadruplexfluorescentbiosensorfortargetdnadetection[j].analsci，2018，34(2)：149-153.)、电化学传感器(zhangd，pengy，qih，gaoq，zhangc.label-freeelectrochemicaldnabiosensorarrayforsimultaneousdetectionofthehiv-1andhiv-2oligonu-cleotidesincorporatingdifferenthairpin-dnaprobesandredoxindicator[j].biosens.bioelectron，2010，25：1088e1094.)，本实施例均具有较好的检测范围及较低的检测限。因此，本发明有较大潜力应用于aac-(6’)-ib-cr基因的检测。
表2与其他检测dna方法的比较
3.6特异性考察
为了评价egtf荧光传感器对检测aac-(6’)-ib-cr耐药基因的特异性，本实施例设计了三条区别于目的基因的核酸序列t1、t2和t3，并且在相同条件下对目的基因同这三条核酸序列进行分析。如图9可知，当反应体系中有目的基因时，可显著增加荧光信号强度。相对于目的基因，t1仅有一个核酸序列发生了改变，其荧光信号强度为目的基因产生的信号的1/4。由于本研究根据aac-(6’)-ib编码区102号位的单碱基突变来区分aac-(6’)-ib-cr与aac-(6’)-ib，因此，在目的基因的基础上进行单碱基突变的t1为主要考察对象。由图可见，t1的信号值相较于目的基因的信号值有显著性差异，因此，该检测方法原则上可以充分区分aac-(6’)-ib-cr与aac-(6’)-ib。在t1的基础上增加一个核酸位点改变的t2相对应的荧光信号强度稍稍增加，这是由于当增加两个突变位点后，目的基因与发夹探针的5’端结合减少，空间位阻降低，从而部分打开的发夹探针更易折叠为g-四链体并结合tht。当增加到3个碱基突变时，其信号在t2的基础上有所降低。虽然t1、t2、t3之间的荧光值的变化较小，但相较于目的基因也有较大改变。综上所述，本发明具有较高的特异性。
4模拟样品分析
表3血清加标实验
表4菌液加标实验
为了考察本发明实际使用效果，本实施例采取了血清、菌液作为模拟样品，运用标准加入法在最优的条件下进行操作，并对目标物产生的信号进行考察。结果如表3和4所示。由表可见，目的基因在血清中的回收率在99.50％-105.21％之间，在菌液中的回收率在101.62％-108.13％之间。同样，因此，本发明拥有较为优秀的抗干扰能力。因此，本发明所建立的检测方法有望在临床上使用.
5经济学分析的评价
表5两种不同技术方案的成本及性能
表6两种技术方案的cea和cua比较
由于检测耐药基因传感器种类的多样性，因此，评价技术方案的标准同样显示出多样性。鉴于临床应用的特殊性，具有较低的成本和较高的性价比的技术方案更具有实际应用价值。因此，选择具有较高性价比的技术方案是十分必要的。值得注意的是，本发明所采用的技术方案在性价比上具有较高优势。本实施例选取检测限相近的双酶辅助的检测单核苷酸突变dna的荧光传感器(对比技术方案：leeij，gooni，kimde.label/quencher-freedetectionofsingle-nucleotidechangesindnausingisothermalamplificationandg-quadruplexes[j].analyst，2016，141(24)：6503-6506.)进行性价比的比较。
综合表5和表6可知，在步骤上，本发明较对比技术方案更简便。在时间上，本发明用时较短。在成本上，本发明成本更低。较对比技术方案，本发明具有更低的c/e和c/u值，即本发明在cea和cua两方面远胜于对比技术方案。因此，从经济学分析的角度看本发明具有较高的性价比。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110>明德松
<120>一种aac-（6’）-ib-cr基因检测试剂盒
<160>8
<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>22
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>1
tgagggtggggagggtggggaa22
<210>2
<211>19
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>2
ttcttcccaccttccgtcc19
<210>3
<211>4
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>3
aaaa4
<210>4
<211>45
<212>dna
<213>人工序列(artificialsequence)
<400>4
tgagggtggggagggtggggaaaaaattcttcccaccttccgtcc45
<210>5
<211>23
<212>dna
<213>homosapiens
<400>5
ggacggaaggtgggaagaagaac23
<210>6
<211>23
<212>dna
<213>homosapiens
<400>6
ggacggagggtgggaagaagaac23
<210>7
<211>23
<212>dna
<213>homosapiens
<400>7
ggacggagggtgggaggaagaac23
<210>8
<211>23
<212>dna
<213>homosapiens
<400>8
ggacggagggtaggaggaagaac23