一种保持细菌活性的dsDNA微波解链方法与流程

本发明属于微生物特殊处理领域，具体涉及的是一种保持细菌活性的dsdna微波解链方法。

背景技术：

通常解链dsdna的方法是煮沸或强酸处理或者采用生物试剂和化学试剂相结合的方法，由于热处理和酸处理无疑会导致细菌死亡，而试剂提取dna时，主要利用溶菌酶并结合其它裂解脂类和蛋白质的酶类一起处理，以破坏细胞壁使核酸物质更好地释放出来，但是步骤繁琐且需要大量试剂。

技术实现要素：

本发明的主要目的在于提供了一种保持细菌活性的dsdna微波解链方法，该方法能解链细菌dsdna为ssdna，同时保证细菌的生物活性。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：

一种保持细菌活性的dsdna微波解链方法，所述dsdna微波解链方法为将经过预处理的大肠杆菌重悬于无菌pbs中，然后置于微波下进行处理，得到仍保持生物活性的大肠杆菌ssdna；

其中所述微波下进行处理的条件为：功率136～160w，温度20～60℃，时间5～10s。

进一步的，所述微波下进行处理的条件为：功率136w，温度为室温，时间为9s。

进一步的，所述微波使用0～200w连续可调型固态微波源。

与现有技术相比，本发明通过设置特定的微波条件，采用微波方法解链细菌dsdna为ssdna，同时保证细菌的生物活性，并有助于细菌的跨膜和跨壁电子转移。

附图说明

图1是本发明实施例中大肠杆菌经过功率为136w的微波处理8s、9s、10s后的鸟嘌呤电信号对比图；

图2是对照组和不同处理组的大肠杆菌数目对比图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

设备选型

(1)单模腔：根据目前实验的需要，对直径20mm左右的电解杯内的样品进行微波处理，由于多模腔结构的微波功率密度(电磁场强度)较小，不能对试样进行有效加热和稳定加热，因此推荐采用单模谐振腔结构。本发明采用te101矩形波导单模谐振腔，单模腔具有功率密度高、损耗小、温度均匀和易于控制等优点，已成为主要对低损耗材料进行微波处理的加热腔。

(2)微波源：由于试验试剂量较低少，只有3ml左右，因此加热所需的微波功率也不宜过大，否则无法实现精确温度控制，以试剂为水计算，如果每分钟温升1℃,只需要微波功率0.21w，所以微波源选择固态源，不能用磁控管式微波源。本发明采用0-200w连续可调型固态微波源。

实施例1

将冷冻干燥的大肠杆菌(atcc25922)在37℃的脑心浸液(bhi)中复活18～24h。然后在37℃下将一圈细菌培养物接种到营养肉汤(nb)中24h。之后，通过在室温下以9000rpm离心10分钟获得大肠杆菌，然后将沉淀物通过无菌磷酸盐缓冲溶液(pbs)洗涤两次。最后，将洗涤后的大肠杆菌重悬于无菌pbs中。

将3ml大肠杆菌重悬液采用上述设备在不同条件下进行微波处理，处理温度为室温，处理条件分别为：(1)136w8s；(2)136w9s；(3)136w10s；(4)269w10s。

测试例

(1)鸟嘌呤电信号测定

测定方法：将三电极系统(pgce，饱和甘汞电极和铂丝电极)放入大肠杆菌的悬浮液中。通过电化学富集的方法，将大肠杆菌在0.3v下固定在pgce上90s。然后，在ph6.0的pbs中从0.6至1.0v进行cv。

测定3ml大肠杆菌重悬液经过(1)136w8s；(2)136w9s；(3)136w10s三种条件处理后的电化学信号，测定结果如图1所示。图1为大肠杆菌经过功率为136w的微波处理8s、9s、10s后的鸟嘌呤电信号对比图。根据图1可知，微波条件为136w9s时，氧化峰值电流最高，说明该条件下，在保持活性的同时，电化学信号也很显著，说明该微波处理条件有助于细菌的跨膜和跨壁电子转移。

(2)菌落计数

计数方法：根据中华人民共和国(gb4789.2-2016)，将大肠杆菌接种在营养琼脂平板上，于37℃孵育48小时。然后，以每毫升菌落形成单位(cfu/ml)为单位，计算活细菌数。未经过微波处理的大肠杆菌重悬液中活大肠杆菌数为2.30×10⁸cfu/ml。

不同处理条件下的菌落情况如图2所示，图2中a为未经过微波处理的大肠杆菌重悬液，b为136w9s条件处理得到的大肠杆菌重悬液，c为136w8s条件处理得到的大肠杆菌重悬液，d为136w10s条件处理得到的大肠杆菌重悬液，e为269w10s条件处理得到的大肠杆菌重悬液。根据图2可知，136w9s条件处理得到的大肠杆菌重悬液中，活大肠杆菌的数量与对照组几乎相同。表明微波处理后大肠杆菌的生物学活性没有改变。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

技术特征：

1.一种保持细菌活性的dsdna微波解链方法，其特征在于，所述dsdna微波解链方法为将经过预处理的大肠杆菌重悬于无菌pbs中，然后置于微波下进行处理，得到仍保持生物活性的大肠杆菌ssdna；

其中所述微波下进行处理的条件为：功率136～160w，温度20～60℃，时间5～10s。

2.根据权利要求1所述的dsdna微波解链方法，其特征在于，所述微波下进行处理的条件为：功率136w，温度为室温，时间为9s。

3.根据权利要求1所述的dsdna微波解链方法，其特征在于，所述微波使用0～200w连续可调型固态微波源。

技术总结
本发明属于微生物特殊处理领域，公开了一种保持细菌活性的dsDNA微波解链方法。本发明提供的dsDNA微波解链方法为将经过预处理的大肠杆菌重悬于无菌PBS中，然后20～60℃温度条件下置于微波下进行处理5～10s，得到仍保持生物活性的大肠杆菌ssDNA。本发明提供的dsDNA微波解链方法可以保证细菌的生物活性，并有助于细菌的跨膜和跨壁电子转移。

技术研发人员：顾海鹰;张晶;刘晓骏;钱钰颖;唐浩文;孙巧灵;沙舟
受保护的技术使用者：南通大学
技术研发日：2020.09.16
技术公布日：2020.12.22