一种右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料及其制备方法和用途与流程

本发明涉及材料与生物技术领域，具体地涉及一种右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料，本发明还涉及复合材料的制备方法以及用途。

背景技术：

右旋糖苷酶是一种专一性水解右旋糖苷内部α-1,6糖苷键的水解酶。其可以将高分子右旋糖酐催化降解为低分子量异麦芽多糖或寡糖的水解酶。该酶及其催化产物在医药、食品、化工等领域具有重要的应用价值与广泛的工业用途，因此，国内外对右旋糖苷酶的研究逐渐增加。

游离酶使用是一次性的，无法重复使用，造成成本高，也无法从产物中去除。酶制剂绝大多数是以液态形式使用，但这种形式使用后就难以分离并再利用。由于酶制剂价格一般比较高，单次利用使成本过高，这些限制因素导致了其应用受到一定影响。这个缺点可以通过固定技术克服。迄今为止，物理吸附，共价结合，交联是常用的制备复合材料技术。固定化后，通常可改善其储存稳定性，ph和耐热性。基于这些优点，固定化酶能够应用于制药、日化、食品、纺织工业和废水处理等领域。

将酶与材料复合实现固定化是改善上述酶制剂问题有效手段之一。固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，克服了游离酶的上述不足之处，因此酶的固定化受到研究者日益重视，人们根据传统酶固定化技术存在的问题，不断探索改进、完善和发展新的酶固定化方法。固定化酶技术是用物理或化学手段将游离酶封锁住固体材料或限制在一定区域内进行活跃的、特有的催化作用，亦可回收，重复使用的一种技术。酶与材料复合后，也有利于对酶的保藏。经固定化的酶与游离酶相比具有稳定性高、回收方便、易于控制、可反复使用、成本低廉等优点，在生物工业、医学及临床诊断、化学分析、环境保护、能源开发以及基础研究等方面发挥了重要作用。

技术实现要素：

本发明的目的是针对上述的现有技术中存在的问题，提供一种新的右旋糖酐酶的复合材料，该复合材料的可以固定化右旋糖酐酶，其重复性好，可以提高固定化酶的稳定性。

本发明的另一个目的是提供前述复合材料的制备方法。

本发明的又一个目的是提供前述复合材料的用途。

为了实现以上发明目的，本发明公开了一种右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料，该复合材料由右旋糖酐酶和羟基磷灰石组合而成，且每1000u右旋糖酐酶中加入的羟基磷灰石为80g-120g。优选每1000u右旋糖酐酶中加入的羟基磷灰石为100g。右旋糖酐酶优选具有专一水解右旋糖酐内部α-1,6糖苷键的酶。所述的羟基磷灰石ca5(po4)3(oh)的粒度优选为纳米级与/或微米级。

本发明还公开了一种如以上技术方案所述的右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料的制备方法：将羟基磷灰石加入右旋糖酐酶溶液中，采用物理方法充分混匀，即得。

优选的右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料的制备方法步骤如下：

（1）将右旋糖酐酶粉加入缓冲液配成右旋糖酐酶溶液；

（2）将羟基磷灰石放入右旋糖酐酶溶液中，充分混匀，使右旋糖酐酶与羟基磷灰石表面相互固定化作用，形成右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料；固定化时间为30-300分钟；缓冲液ph＝5-8；固定化温度为10℃-45℃。

所述固定化时间优选为150-180分钟，所述缓冲液ph＝5－6；固定化温度为25℃。所加入的缓冲液优选为适量的醋酸缓冲液与/或tris盐酸缓冲液。

本发明还公开了右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料的用途，所述的用途为复合材料在右旋糖酐水解中作水解剂使用。复合材料在右旋糖酐水解中作水解剂使用时，优选的水解温度为35℃，优选的水解ph6.0,优选保温水解30min。

本发明制得的右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料可以进行表征，通过扫描电镜（sem）、傅里叶远红外光谱(ft-ir)和粉末衍射仪(xrd)，检测复合材料。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明复合材料采用亲和吸附将海洋右旋糖酐酶与羟基磷灰石结合。得到的复合材料具有操作方便、酶利用度高、酶活性好、酶寿命长、后续分离方法简便等优点。

2、本发明复合材料可以进行重复利用，重复利用30次以上，复合材料的右旋糖酐酶活仍保留在70%以上。利用率高，复合材料能够应用于制药，日用化工，食品工业，废水处理和纺织工业等各个领域。

3、本发明的方法制备的复合材料可以保持酶活90％以上，具有稳定性和可重复利用性，为其在工业上的应用提供了广泛前景。

4、本发明右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料用来酶解右旋糖酐，其产物主要为异麦芽寡糖。酶解效果好。

附图说明

图1为作用时间值对复合材料酶活的影响曲线；

图2为缓冲液ph值对复合材料酶活的影响曲线；

图3为作用温度对复合材料酶活的影响曲线；

图4为重复利用的次数对复合材料酶活的影响柱状图；

图5为复合材料的扫描电镜图；

图6为复合材料的傅里叶远红外光谱图；

图7为复合材料的xrd图谱；

图8为复合材料水解产物图（g2：麦芽糖,g4：异麦芽四糖,g5：异麦芽五糖,g7：异麦芽七糖,g:多糖）。

具体实施方式

以下实例是对本发明的进一步说明，并不构成对本发明实质内容的限制，本发明的保护范围并不仅限于此。

实施例1，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验一：

（1）称量实验所需的酶粉，含有右旋糖酐酶1000u，加入ph＝6的缓冲液中，制成酶溶液。称量羟基磷灰石100g，将材料羟基磷灰石放入酶溶液中，把反应容器放进可控温摇床，设置温度25℃，反应150分钟后，用离心机设置转数12000r/min进行离心10min,并且用纯水洗涤3次得到右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。所得的复合材料的扫描电镜图参照图5，复合材料的傅里叶远红外光谱图参照图6，复合材料的xrd图谱参照图7。

（2）通过dns法测出酶活力，计算右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料的酶活力，90%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。

实施例2，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验二：

除了将实施例1的步骤(1)中反应时间分别设置成180min、210min、240min、270min、300min，即考察不同反应时间对固定化结果的影响，按照实施例1相同的方法制备右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料，反应时间延长，对酶的活力略有提高，不会降低酶的活力。结果参见图1。

实施例3，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验三：

除了将实施例1步骤(1)中缓冲液ph分别采用ph＝3、ph＝4、ph＝5、ph＝6、ph＝7、ph＝8、ph＝9，即考察不同ph对复合材料的酶活力的影响，按照实施例1相同的方法制备右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料，在ph5-6时，酶的活力保持在90%以上，即获得的每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。在ph7时，酶的活力保持在80%以上，即获得的每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为8个单位。在ph9时，酶的活力保持在70%以上，即获得的每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为7个单位。具体见照图2。

实施例4，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验四：

除了将实施例1中步骤(1)中温度分别采用10℃-45℃不同的温度，即考察不同温度对右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料酶活力的影响，按照实施例1相同的方法制备右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。温度在30℃-40℃时对复合材料影响小，以25℃为复合温度最佳。最体参见图3。

实施例5，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验五：

除了将实施例1步骤(1)中缓冲液分别采用醋酸缓冲液和tris-盐酸缓冲液外，即考察不同不同缓冲液对复合材料的酶活力的影响，按照实施例1相同的方法制备右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。结果证明，醋酸缓冲液优于tris-盐酸缓冲液，两者的复合时，90%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。

实施例6，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备实验六：

除了将实施例1步骤(1)中羟基磷灰石采用不同粒径，即纳米级粒径和微米级粒径外，即考察不同羟基磷灰石粒径对复合材料的酶活力的影响，按照实施例1相同的方法制备右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。结果证明，微米粒径略好于微米粒径材料，两者的复合时，90%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。

实施例7，将实施例1制得的复合材料重复使用，重复30次时，酶活力保持70%以上。结果参照图4。

实施例8，将实施例1制得的复合材料用于水解右旋糖酐，产物可以得到多糖和异麦芽寡糖，得到寡糖的种类和比例，由右旋糖酐酶的性质决定。结果参照图8。

实施例9，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备：

（1）称量实验所需的酶粉，含有右旋糖酐酶1000u，加入ph＝6的醋酸缓冲液中，制成酶溶液。称量微米级羟基磷灰石95g，将材料羟基磷灰石放入酶溶液中，把反应容器放进可控温摇床，设置温度30℃，反应120分钟后，用离心机设置转数12000r/min进行离心10min,并且用纯水洗涤2次得到右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。

（2）通过dns法测出酶活力，计算右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料的酶活力，90%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。

实施例10，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备：

（1）称量实验所需的酶粉，含有右旋糖酐酶1000u，加入ph＝5的tris-盐酸缓冲液中，制成酶溶液。称量纳米级与微米级羟基磷灰石105g，将材料羟基磷灰石放入酶溶液中，把反应容器放进可控温摇床，设置温度35℃，反应180分钟后，用离心机设置转数12000r/min进行离心10min,并且用纯水洗涤2次得到右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。

（2）通过dns法测出酶活力，计算右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料的酶活力，90%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为9个单位。

实施例11，右旋糖酐酶与羟基磷灰石复合材料制备：

（1）称量实验所需的酶粉，含有右旋糖酐酶1000u，加入ph＝7的醋酸缓冲液和tris-盐酸缓冲液中，制成酶溶液。称量纳米级羟基磷灰石120g，将材料羟基磷灰石放入酶溶液中，把反应容器放进可控温摇床，设置温度35℃，反应200分钟后，用离心机设置转数12000r/min进行离心10min,并且用纯水洗涤3次得到右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料。

（2）通过dns法测出酶活力，计算右旋糖酐酶与羟基磷灰石的复合材料的酶活力，80%的酶被复合在羟基磷灰石表面，每克羟基磷灰石与右旋糖酐酶复合材料的酶活为8个单位。