提取甘蔗叶多糖的方法

1.本发明属于甘蔗叶利用技术领域，尤其涉及一种提取甘蔗叶多糖的方法。


背景技术：

2.多糖又称多聚糖，是由10个以上单糖通过糖苷键连接而成的天然高分子化合物，广泛分布于植物、动物和微生物的细胞壁和细胞膜上。文献报道，植物多糖具有免疫调节、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等生物活性。然而，因多糖结构的复杂性，使提取得到高纯度多糖成为研究的难点。目前提取植物多糖的方法多为热水提取法、酶提取法、超声提取法，但这些提取方法无法得到含量较高的植物多糖。
3.甘蔗叶是禾本科植物甘蔗(saccharum sinensis roxb.和saccharum officinarum linn.)的叶，是甘蔗收割后的废弃物，为世界性的大宗农作物废弃物。发明人前期研究中发现，甘蔗叶粗多糖具有降糖、抗心血管疾病的作用。
4.目前未见碱性过氧化氢法应用于多糖提取的报道。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种提取甘蔗叶多糖的方法。
6.为解决上述技术问题，本发明采用以下技术问题：
7.一种提取甘蔗叶多糖的方法，碱水提取后的甘蔗叶加h2o2溶液，调节ph至11，45℃下提取；而后，先用hcl溶液调节ph至8.5，过滤除去硅酸盐；滤液继续用hcl溶液调节ph至5.5，浓缩，加乙醇沉淀，弃去上清液，收集沉淀，洗涤，透析后得甘蔗叶多糖。
8.碱水提取按以下进行操作：称取干燥的甘蔗叶20g，按料液比1:40(w/v)加800ml1％naoh溶液，55℃下提取2h，除去滤液。
9.根据权利要求2的提取甘蔗叶多糖的方法，其特征在于干燥的甘蔗叶按以下进行前处理：称取100g干燥甘蔗叶，用95％乙醇或体积比(2:1v/v)甲苯-乙醇溶液回流6h，溶剂挥发后，45℃烘箱干燥。
10.碱水提取后的甘蔗叶按料液比1:40(w/v)加800ml 3％h2o2溶液，调节ph至11，45℃下提取12h。
11.hcl溶液浓度为6mol/l。
12.加乙醇至含醇量达到80％，洗涤为加无水乙醇洗涤。
13.针对目前甘蔗叶多糖提取存在的问题，发明人首次采用碱性过氧化氢建立了一种提取甘蔗叶多糖的方法，碱水提取后的甘蔗叶加h2o2溶液，调节ph至11，45℃下提取；而后，先用hcl溶液调节ph至8.5，过滤除去硅酸盐；滤液继续用hcl溶液调节ph至5.5，浓缩，加乙醇沉淀，弃去上清液，收集沉淀，洗涤，透析后得甘蔗叶多糖。其中，h2o2在碱性条件下不稳定，容易分解为羟基自由基(ho
·
)和超氧阴离子自由基(o
2-·
)，这些基团会氧化木质素结构，引入亲水性(羧基)基团，增强木质素溶解，从而破坏甘蔗叶的细胞壁结构，促进更多的甘蔗叶多糖释放。研究表明，应用本发明提取甘蔗叶多糖，多糖得率和总糖含量较高。
附图说明
14.图1是提取甘蔗叶多糖的方法的流程图。
15.图2是葡萄糖标准曲线。
16.图3是糖醛酸的标准曲线。
具体实施方式
17.甘蔗叶多糖提取方法研究
18.1.生产工艺筛选
19.甘蔗叶的前处理：称取100g干燥甘蔗叶三份，其中一份不做前处理，另两份分别用95％乙醇、甲苯-乙醇(2:1v/v)回流6h。溶剂挥发后，45℃烘箱干燥。
20.分别称取经上述前处理的三种干燥的甘蔗叶各20g，按料液比1:40(w/v)加800ml1％naoh溶液，55℃下提取2h，除去滤液。碱水提取后的甘蔗叶按料液比1:40(w/v)加800ml 3％h2o2溶液，调节ph至11，45℃下提取12h，先用6mol/l hcl溶液调节ph至8.5，过滤除去硅酸盐。滤液继续用6mol/l hcl溶液调节ph至5.5，浓缩至200ml左右，磁力搅拌下，缓慢加乙醇至含醇量达到80％，弃去上清液，收集沉淀加无水乙醇洗涤，常规透析(透析袋的规格为1000da，即分子量小于1000的物质可以穿过透析袋)，将洗涤后的沉淀物溶于少量水形成混悬物，装入透析袋中，密封好之后置于蒸馏水中透析，直到透析袋外的水中检测不出氯离子，后得甘蔗叶多糖。
21.未做前处理的甘蔗叶得到的甘蔗叶多糖命名为slp-b；经过95％乙醇前处理的甘蔗叶得到的甘蔗叶多糖命名为slp-e；经过甲苯-乙醇(2:1v/v)前处理的甘蔗叶得到的甘蔗叶多糖命名为slp-te。
22.2.三种甘蔗叶多糖的得率
23.得率(％)＝甘蔗叶多糖的质量/干燥甘蔗叶的质量*100％
24.表1甘蔗叶多糖得率结果
[0025][0026]
由表1可知，经过乙醇和甲苯-乙醇(2:1v/v)前处理得到的slp-e和slp-te的得率比未经过前处理的slp-b的得率高，推测前处理可以去除植物表面的蜡质，使提取溶剂更容易渗透到植物细胞内部结构，从而获得更高的得率。
[0027]
3.三种甘蔗叶多糖的总糖含量测定
[0028]
3.1实验方法
[0029]
采用苯酚硫酸法测定甘蔗叶多糖的总糖含量。
[0030]
3.1.1溶液的配制
[0031]
葡萄糖标准液的配制：准确称取10mg的无水葡萄糖，加水至100ml，得到0.1mg/ml的对照溶液。
[0032]
样品溶液的配制：分别准确称取10mg样品slp-b、slp-e、slp-te，加水溶解至10ml，
配制成1mg/ml溶液。
[0033]
5％苯酚溶液的配制：称取苯酚5g，加适量水超声溶解，定容至100ml。
[0034]
3.1.2标准曲线的绘制
[0035]
分别取无水葡萄糖标准品溶液0、100、200、400、600、1000μl，加水稀释至1000μl。加2.5ml浓硫酸，缓慢滴加，摇匀，再加500μl 5％苯酚溶液，摇匀，沸水浴15min。吸取200μl于96孔板在490nm处测定吸光度值a。以无水葡萄糖浓度c(mg/ml)为横坐标，吸光度值a为纵坐标建立标准曲线。
[0036]
3.1.3总糖含量测定
[0037]
分取3.1.1项下样品溶液500μl加水至1000μl，按3.1.2项下方法反应，测得吸光度值代入标准曲线方程。
[0038]
实验结果
[0039]
3.2.1葡萄糖的标准曲线
[0040]
总糖的标准曲线：y＝7.4295x+0.0891，r2＝0.9988，其线性范围为0～0.1mg/ml，如图1所示，线性范围内吸光度与葡萄糖浓度具有良好的线性关系。
[0041]
3.2.2总糖含量测定结果
[0042]
表2总糖含量测定结果
[0043][0044]
由表2可知，scl-b的总糖含量高于slp-te和slp-e，推测对甘蔗叶进行前处理可能会使部分多糖流失。
[0045]
4.三种甘蔗叶多糖的糖醛酸含量测定
[0046]
4.1实验方法
[0047]
采用间羟基联苯法测定甘蔗叶多糖的糖醛酸含量
[0048]
4.1.1溶液配制
[0049]
(1)硼酸盐溶液：取2.3876g四硼酸钠，使之完全溶于250ml浓硫酸中。
[0050]
(2)4mol/ml氨基磺酸盐溶液：取38.90g氨基磺酸，溶于适量水中，逐滴加入饱和的氢氧化钠溶液使氨基磺酸充分溶解，将溶液的ph值调至1.6后定容至100ml。
[0051]
(3)间羟基联苯溶液：取0.15g间羟基联苯，溶于5mg/ml的naoh溶液中，定容至100ml。
[0052]
(4)标准溶液：准确称量d-葡萄糖醛酸10.04mg，用水定容至25ml，分装后于-20℃保存备用；取储备液1ml加水定容至10ml，配成标准工作液。
[0053]
(5)样品溶液配制：分别称取甘蔗叶多糖样品5mg，加水溶解定容至5ml，配成1mg/ml的样品溶液。
[0054]
4.1.2标准曲线的绘制
[0055]
分别取0，100，200，400，600，800，1000μl工作标准液于试管中，补水至1000μl，每管加10μl氨基磺酸盐，摇匀，缓慢加入5ml硼酸盐硫酸溶液，振荡混匀后将其放入沸水浴中
15min，取出后冷却至室温。每管缓慢加入80μl间羟基联苯溶液，充分振荡至颜色均匀后，室温下放置30min。取200μl至96孔板，于525nm处测a值，以糖醛酸浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。
[0056]
4.1.3糖醛酸含量测定
[0057]
分别取4.1.1项下样品溶液1000μl，按4.1.2项下方法进行糖醛酸含量含量测定。
[0058]
实验结果
[0059]
4.2.1糖醛酸的标准曲线
[0060]
糖醛酸的标准曲线：y＝9.1311x+0.0495，r2＝0.9997，其线性范围为0～0.04mg/ml，如图2所示，线性范围内吸光度与葡萄糖醛酸浓度具有良好的线性关系。
[0061]
4.2.2糖醛酸含量测定结果
[0062]
表3糖醛酸含量测定结果
[0063][0064]
由表3可知，slp-te和slp-e的糖醛酸含量高于slp-b，对甘蔗叶进行前处理可能会使部分多糖流失，但前处理有效提高了糖醛酸的含量。
[0065]
5.对比研究
[0066]
为进行对比研究，发明人尝试直接进行水提，具体操作如下：
[0067]
取100g干燥的甘蔗叶，切成小段。加水煮沸，浸泡2h，添水至盖过药面，保持微沸提取3次，每次2h。过滤，合并滤液，滤液浓缩至75ml，浓缩液加入3倍量95％乙醇，充分搅拌，静置12h，收集下层沉淀，冷冻干燥，粉碎即得甘蔗叶粗多糖粉末，标记为sclp-1。
[0068]
经测定计算，该水提法得率为3.56％，总糖含量为8.7％。
[0069]
史娟等人采用超声提取甘蔗叶多糖(甘蔗叶多糖超声波提取工艺研究[j].化工技术与开发,2012,41(09):7-9+65.)，提取温度60℃、提取时间60min、提取次数2次、料液比1∶50(g∶ml)下，甘蔗叶多糖提取率为1.973％。
[0070]
可见，与已报道有关方法相比，本发明提取甘蔗叶多糖的方法得率和总糖含量较高，为进一步研究甘蔗叶多糖的医药应用提供了有力技术支撑。