含马铃薯X病毒片段的黄瓜花叶病毒RNA2弱毒突变体质粒载体及其应用的制作方法

含马铃薯x病毒片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变体质粒载体及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及植物病毒学和分子生物学技术领域，具体涉及一种含马铃薯x病毒(pvx)片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变体质粒载体及其作为弱毒疫苗的应用。


背景技术：

[0002]
对于植物病毒病的防治，最有效的方法是种植抗病品种，但其存在育种周期长、抗病品种抗性易丧失等不足。另一种方法是弱毒交叉保护，是利用弱毒刺激植物自身的免疫系统而防治后期侵染的强毒株系；也是一种有效的病毒防治策略。病毒弱毒突变体可以是天然存在的，也可以是通过分子生物学手段进行人工制备的。
[0003]
黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus,cmv)是雀麦花叶病毒科(bromoviridae)黄瓜花叶病毒属(cucumovirus)的典型成员(garc
í
a-arenal et al.,2001)。cmv可侵染85个科365个属1000多种单双子叶植物，包括十字花科、茄科、葫芦科、豆科作物等。烟草极易被cmv侵染，在全世界的烟草主栽区均有cmv的分布和危害(赵伟等，2015)。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、最具经济价值的病毒之一，是世界性分布的重要正义单链rna病毒之一(beemster,1982；gallitelli,2000)。由于其广寄主特性，创制cmv的弱毒疫苗具有广泛的应用价值。
[0004]
cmv基因组由三条正义单链rna组成，分别为rna1、rna2、rna3。rna1约3350nt，含1个orf，编码111kda的1a蛋白。rna2约3050nt，含2个位置部分重叠的orf，编码2a、2b蛋白(palukaitis et al.,1992)，1a、2a蛋白参与病毒复制酶复合体的形成，与侵染寄主植株的症状、传播、温度敏感性及与卫星rna的互作起决定性作用；2b蛋白强烈抑制寄主植物转录后的基因沉默，是cmv抵抗寄主自身存在的ptgs机制的抑制因子，与1a蛋白协作于cmv在植物体内的长距离运输(brignetiet al.,1998)。rna3约2190nt，含移动蛋白(mp)和衣壳蛋白(cp)2个orf，mp决定病毒在寄主间的移动，cp通过rna3的亚基因组rna4翻译产生，与病毒颗粒组装和蚜虫传播有关(llamas et al.,2006)。有的cmv含有卫星rna(金波等，2005)，卫星rna是cmv基因组以外的遗传因子，其大小在307-405nt之间，是线型单链的非编码rna分子，干扰辅助病毒的复制，影响其对寄主的致病性和症状(陈集双等，2001)。
[0005]
由于cmv的2b蛋白是病毒编码的基因沉默抑制因子，对维持cmv的强致病性是必须的；因此，对2b蛋白的编码基因进行突变改造是构建cmv弱毒突变体的潜在途径。本研究是通过突变在保持2a蛋白完整的前提下造成2b蛋白的提前终止，并在新的终止密码子后插入马铃薯x病毒(pvx)的片段，从而得到含有pvx片段的cmv弱毒突变体，达到可以防治cmv和pvx的交叉保护效果。


技术实现要素：

[0006]
基于上述研究背景，本发明的目的是提供一种含马铃薯x病毒(pvx)片段的黄瓜花叶病毒(cmv)rna2弱毒突变体质粒载体及其作为弱毒疫苗的应用，该疫苗具有交叉保护防
治cmv和pvx病毒病的效果。
[0007]
本发明针对黄瓜花叶病毒rna2的2b蛋白编码序列进行改造获得2b蛋白提前终止突变体，然后在2b蛋白提前终止突变体中插入pvx片段，为cmv弱毒疫苗创制提供了理论依据，同时为cmv和pvx病毒病的防治提供了材料。
[0008]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0009]
本发明的第一方面，提供一种含马铃薯x病毒(pvx)片段的黄瓜花叶病毒(cmv)rna2弱毒突变体质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
，所述质粒载体含有cmv
fny
株系rna2全序列，并在2b蛋白提前终止密码子后插入马铃薯x病毒的保守片段；造成2b蛋白提前终止的同时尽可能保持了黄瓜花叶病毒rna2中其他蛋白编码和核苷酸的潜在的顺式调控作用。
[0010]
优选的，所述马铃薯x病毒的保守序列，为马铃薯x病毒pvx5890-6089位200bp的保守片段，其核苷酸序列如seq id no.1所示。
[0011]
所述质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
的核苷酸序列如seq id no.2所示。
[0012]
本发明的第二方面，提供上述质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
的制备方法，包括以下步骤：
[0013]
(1)以cmv
fny rna2侵染性克隆质粒pcb301-cmv
fny2
为模板，利用反向pcr扩增方法获得中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt；
[0014]
(2)利用rt-pcr从pvx侵染发病的烟草中扩增得到200bp pvx片段；
[0015]
(3)利用酶切和连接方法将pvx片段插入到中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt中，构建得到含pvx片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变体质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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。
[0016]
优选的，所述步骤(1)中，用于反向pcr扩增的引物序列分别如seq id no.3和seq id no.4所示。
[0017]
优选的，步骤(1)中，所述中间载体是2661位g后引入taatag，然后依次引入bamh i、spei和sma i酶切位点。
[0018]
优选的，所述步骤(2)中，用于扩增pvx的200bp保守片段的引物序列分别如seq id no.5和seq id no.6所示。
[0019]
本发明的第三方面，提供上述质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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在植物病毒病防治中的应用；具体的，所述植物病毒病是由黄瓜花叶病毒或马铃薯x病毒引起的植物病毒病。
[0020]
进一步的，本发明还保护上述质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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在弱毒疫苗制备和/或研究中的应用。
[0021]
本发明还提供一种含质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的重组菌，所述重组菌为转入该质粒载体的农杆菌。
[0022]
本发明的有益效果：
[0023]
本发明通过对黄瓜花叶病毒rna22b蛋白编码序列进行改造获得弱毒突变体，同时在弱毒突变体改造过程中插入pvx片段，从而制备得到含pvx片段的黄瓜花叶病毒rna2弱毒突变质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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。
[0024]
利用本发明制备的质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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，与含野生型cmv
fny
rna1和野生型cmv
fny
rna3的质粒通过农杆菌浸润方法混合接种中烟100，接种10d后，与野生型cmv
fny rna1+rna2+rna3混合接种症状相比显示弱侵染性，表现为株高正常且叶片平展；同时系统叶片无明显的卷叶花叶等病毒病症状，表明该cmv突变体为弱毒突变体；通过rt-pcr检测，插入的200bp pvx片段能稳定存在。交叉保护实验表明，该cmv弱毒突变体可以防治cmv和pvx引起的病毒病；说明该cmv弱毒突变体满足弱侵染性和诱导内源免疫系统的弱毒疫苗特性。本发明cmv弱毒疫苗中携带的200bp pvx序列是pvx不同分离物中比较保守的序列，因此本发明的cmv弱毒疫苗可潜在防治pvx多种不同分离物造成的烟草病毒病；而且由于cmv基础载体的广寄主特性，暗示该疫苗不仅适用于烟草，还适用于其他寄主植物。
附图说明
[0025]
图1为中间载体pcb301-cmvfny-r2-2bpt示意图；其中包括基础载体和改造后的中间载体；lb，t-dnaleft border(lb)；rb，t-dnaright border(rb)；35s，promoter(from gene 2x35s)；rz，ribozyme(hdv-rz)；nos，terminator(nos terminator)。
[0026]
图2为中间载体pcb301-cmvfny-r2-2bpt的酶切鉴定；其中m为tiange公司的d15000+2000分子量标准。
[0027]
图3为质粒pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的酶切鉴定；其中m为tiangen公司的d15000+2000分子量标准，箭头所指为酶切片段。
[0028]
图4为质粒pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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中含有的pvx序列与pvx(ncbi登录号eu571480)全长的比对。
[0029]
图5为pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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在中烟100上弱致病症状；mock，空的农杆菌菌液；r1,cmv
fny rna1；r2,cmv
fny rna2；r3,cmv
fny rna3；r2-2bpt-pvx
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,含有cmv
fny rna2全序列，并在2b蛋白提前终止密码子后插入pvx的200bp保守片段。
[0030]
图6为pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的pvx插入片段在植物体内的稳定性检测；其中m为tiangen公司的d2000分子量标准；mock，空的农杆菌菌液；r2,cmv
fny rna2；r2-2bpt-pvx
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,含有cmv
fny rna2全序列，并在2b蛋白提前终止密码子后插入pvx的200bp保守片段；dpi,接种后的天数。
[0031]
图7为pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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对cmv和pvx的交叉保护效果；其中mock为空的农杆菌菌液；post-infection by pvx+cmv，接种pvx和cmv；no pre-infection，不进行弱毒突变体的提前注射接种；pre-infection by r1/r2-2bpt-pvx
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/r3，提前注射接种含有cmv
fny rna1/r2-2bpt-pvx
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/cmv
fny
r3的农杆菌菌液。
具体实施方式
[0032]
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0033]
本发明对于2b蛋白编码基因的改造策略为：以cmv
fny rna2侵染性克隆质粒pcb301-cmv
fny2
(姚敏，2011)为模板，利用反向pcr扩增方法，在2661位g后面插入taatag，造
成2b蛋白的提前终止，并在新的终止密码子后依次引入bamh i、spe i和sam i的多克隆位点，得到中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt。然后，利用rt-pcr从pvx侵染的烟草中扩增pvx的200bp保守序列，再利用酶切和连接方法将此pvx的200bp序列插入到载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt中，由此获得了含有pvx序列的cmv
fny
rna2弱毒突变体质粒，该质粒载体名称为pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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。
[0034]
在本发明的一个优选实施方案中，给出了黄瓜花叶病毒cmv
fny
rna2突变型质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的构建方法，具体如下：
[0035]
(1)pcb301-cmv
fny-r2-2bpt中间载体的构建：根据genbank中公布的cmv
fny rna2的序列(登录号：d00355)，设计引物fny2-del2b 3'-bsst-2662-f和fny2-del2b 3'-b-2661-r(详细信息见表1)。以pcb301-cmv
fny2
为模板，在primestar hs dnapolymerase(takara)作用下进行pcr反向扩增，利用dpni(neb)降解质粒模板后，对pcr扩增片段进行bamh i酶切后自连，连接产物转化大肠杆菌dh5α，经菌落pcr、质粒酶切鉴定和dna测序，确认得到中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt。该中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt是在rna2的2661位g后面插入taatag，造成2b蛋白的提前终止，并依次引入bamh i，spei，smai酶切位点。造成2b蛋白提前终止的同时，尽可能保留2a的完整编码框和其他核苷酸序列的完整性(图1)。
[0036]
表1：本发明中用到的引物
[0037][0038]
注：pvx-bamh
ⅰ-
5890-f对应于pvx的5890-5912位；pvx-sma
ⅰ-
6089-r互补于pvx的6065-6089位。
[0039]
(2)pvx部分片段的扩增：根据genbank中公布的pvx全序列(登录号：eu571480)，利用dnaman软件进行序列比对，发现其序列保守的区域并设计引物pvx-bamh
ⅰ-
5890-f和pvx-sma
ⅰ-
6089-r(详细信息见表1)。提取pvx侵染的烟草样品的总rna，利用rt-pcr扩增对应于烟草pvx基因5890-6089位的200bp片段。
[0040]
(3)pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的构建：分别利用bamh i和smai双酶切pcb301-cmv
fny-r2-2bpt以及pvx 200bp片段，然后经胶回收后进行连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，经菌落pcr、质粒酶切鉴定和dna测序，确认得到载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
。
[0041]
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
[0042]
本发明实施例中所用的未进行具体说明试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。本发明实施例中未注明具体实验条件和方法的，通常按照常规条件，如j.萨姆布鲁克等主编，科学出版社，2002，分子克隆实验指南(第三版)；d.l.斯佩克特等主编，科学出版社，2001，细胞实验指南；或者按照制造厂商建议的条件。
[0043]
实施例1.中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt的构建：
[0044]
以cmv
fny
rna2的侵染性克隆质粒pcb301-fny2为模板，在primestar hs dna polymerase(takara)作用下，进行反向pcr扩增，引物对为fny2-del2b 3'-bsst-2662-f和fny2-del2b 3'-b-2661-r；pcr条件：98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸8min，7个循环；98℃变性10s，68℃延伸8min，25个循环；4℃保存。
[0045]
利用dpni(neb)降解反向扩增pcr反应中的质粒模板pcb301-fny2，反应条件为：37℃，2h；80℃，20min；产物利用无水乙醇沉淀法进行回收：将产物加入ddh2o至450μl，加入50ul ph5.23.0mm醋酸钠，1ml无水乙醇，-80℃沉淀2h，常温12000rpm，离心10min，将液体倒掉，加入600μl 70％乙醇，常温12000rpm，离心5min，将液体倒掉，常温12000rpm，离心1min后将离心管内液体吸净，加入ddh2o 30μl回溶。
[0046]
然后利用bamhi(takara)酶切回收产物，酶切产物经dna回收试剂盒回收后，在t
4 dna连接酶(takara)作用下16℃过夜连接，连接产物转化大肠杆菌dh5α，涂带有100μg/ml卡那霉素的lb平板，经菌落pcr、质粒酶切鉴定和dna测序。
[0047]
结果分析：对菌落pcr的阳性质粒选用bamh i和smai分别进行酶切鉴定，酶切结果显示质粒可以被这位两个酶线性化，且线性化质粒长度约为7.6kb(图2)，基本确认该质粒中插入了多克隆位点；最终通过质粒的dna测序确认得到中间载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt(图1)。
[0048]
实施例2.pvx部分片段的扩增：
[0049]
结果分析：pcr扩增pvx片段,电泳结果显示pcr产物约为200bp，与pvx保守区域200bp序列对比一致(图4)。
[0050]
实施例3.pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
构建：
[0051]
利用transzol up(transgen)提取pvx毒源植物总rna，在reverse transcriptase m-mlv(takara)作用下进行反转录反应，反向引物为pvx-sma
ⅰ-
6089-r，反应条件：在不加酶的条件下，80℃变性3min；加入反转录酶后，42℃反应1.5h；
[0052]
再以反转录产物cdna为模版，在2
×
es taq mastermix(dye)(cwbio)作用下，进行pcr反应，引物对为pvx-bamh
ⅰ-
5890-f和pvx-sma
ⅰ-
6089-r；pcr条件：94℃预变性2min；94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸10s，30个循环；72℃延伸2min；4℃保存；pcr产物经dna回收试剂盒回收后备用。
[0053]
将中间载体pcb301-cmv
fny2-del2b经bamh i和smai双酶切，酶切产物经dna回收试剂盒回收；pvx中200bp保守序列片段经bamh i和smai双酶切，酶切产物经dna回收试剂盒回收。将同样双酶切的中间载体pcb301-cmv
fny2-del2b和pvx片段在t
4 dna连接酶作用下16℃过夜连接；连接产物转化大肠杆菌dh5α的感受态细胞，涂带有100μg/ml卡那霉素的lb平板，经菌落pcr筛选、酶切鉴定和dna测序。
[0054]
结果分析：菌落pcr鉴定的阳性质粒进行酶切鉴定，用bamh i和smai进行双酶切，酶切结果显示有约200bp的酶切条带，并且剩余的酶切片段大小约为7.6kb(图3)，表明该质粒中可能含有pvx的200bp序列；通过质粒的dna测序及序列比对(图4)，得到质粒pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
，其核苷酸序列如seq id no.2所示：
[0055]
gtttatttacaagagcgtacggttcaacccctgcctcccctgtaaaactccctagacttaaatcttttctttctagtatcttttctatggctttccctgcccccgcattctcactagccaatcttttgaacggcagttacggtgtcgacactcccgaggatgtggaacgtttgcgatctgagcaacgcgaagaggctgctgcggcctgtcgtaattacag
gcccctacccgctgtggatgtcagcgagagtgtcacagaggacgcgcattccctccgaactcctgacggagctcccgctgaagcggtgtctgatgagtttgtaacttatggtgctgaagattaccttgaaaaatctgatgatgagctccttgtcgcttttgagacgatggtcaaacccatgcgtatcggacaactatggtgccctgcgtttaataaatgttcttttatttccagcattgctatggccagagctttgttgttggcacctagaacatcccaccgaaccatgaagtgttttgaagacctggtcgcggctatttacactaaatctgatttctactacagtgaagagtgtgaagccgacgacgctcagatagatatctcgtctcgcgatgtacccggttattctttcgaaccgtggtcccgaacgtctggatttgaaccgccgcccatttgtgaagcgtgcgacatgatcatgtaccagtgcccgtgttttgattttaatgctttaaagaaatcgtgcgctgagaggaccttcgctgatgattatgttattgaaggtttagatggtgttgttgataatgcgactctgttgtcgaatttgggtccatttttggtacccgtgaagtgtcaatatgaaaaatgtccaacgccaaccatcgcgattcctccggatttaaaccgtgctactgatcgtgttgatatcaatttagttcaatccatttgtgactcgactctgcccactcatagtaattacgacgactcttttcatcaagtgttcgtcgaaagtgcagactattctatagatctggatcatgttagacttcgacagtctgatcttattgcaaaaattccagattcagggcatatgataccggttctgaacaccgggagcggtcacaagagagtaggtacaacgaaggaggtccttacagcaattaagaaacgtaatgctgacgttccagagctaggtgattccgttaatttgtctagattgagtaaagctgtggctgagagattcttcatttcatacatcaatggtaactctctagcatccagtaactttgtcaatgtcgttagtaacttccacgattacatggaaaaatggaagtcctcaggtctttcttatgatgatcttccggatcttcatgctgagaatttgcagttttatgaccacatgataaaatccgatgtgaaacctgtggtgagcgacacactcaatatcgacagaccggttccagctactataacgtatcataagaagagtataacctcccagttctcaccgttattcacagcgctattcgagcgcttccagagatgccttcgagaacgtattattcttcctgttggtaagatttcatcccttgagatggcaggatttgatgtcaagaacaagcactgcctcgagattgacctgtctaagtttgataagtctcaaggtgaatttcacttgctaatccaggaacacattttgaatggtctaggatgtccagctccgataactaagtggtggtgtgatttccatcgattctcttacattagagaccgtagagctggtgttggtatgcctattagtttccagagacgaactggcgatgcactcacttattttggcaataccatcgtcaccatggctgagtttgcctggtgttatgacaccgaccaattcgaaaagcttttattctcaggcgatgattctctaggattttcactgcttccccctgttggtgacccgagtaaattcacaactcttttcaacatggaagctaaggtgatggaacctgccgtaccatatatttgttcgaagttcttactctctgacgagttcggtaacacattttccgttccagatccattgcgcgaggttcagcggttaggaacaaagaaaattccctattctgacaatgatgaattcttgtttgctcacttcatgagctttgttgatcgattgaagtttttggaccgaatgtctcagtcgtgtatcgatcaactttcgattttcttcgaattgaaatacaagaagtctggggaagaggctgctttaatgttaggcgcctttaagaagtataccgctaatttccagtcctacaaagaactctattattcagatcgtcgtcagtgcgaattgatcaattcgttttgtagtacagagttcagggttgagcgtgtaaattccaacaaacagcgaaagaattatggaattgaacgtaggtgcaatgacaaacgtcgaactccaactggctcgtatggtggaggcgaagaagcagagacgaaggtctcacaaacagaatcgacgggaacgaggtcacaaaagtcccagcgagagagcgcgttcaaatctcagactattccgcttcctaccgttctatcaagtggatggttcggaactgacagggtcatgccgccatgtgaacgtggcggagttacccgagtctgagtaatagggatcctgggacttagtcagacactgtgctgatgtgggctcatctgcccaaacagagatgatagatacaggtccttattccaatggcatcagtagagctagattggcagcagcgattaaagaggtgtgcacacttaggcaattctgcatgaagtatgccccagtggtatggaactggatgttgactaacaacagtccacctgctaacccggggcctctcgtttagagttatcggcggaagaccatgattttgacgatacagattggttcgccggtaacgaatgggcggaaggtgctttctgaaacctccccttccgcatctccctccggttttctgtggcgggagctgagttggcagtattgctataaactgtctgaagtcactaaacacattgtggtgaacgggttgtccatccagcttacggctaaaatggtcagtcgtagaggaatctacgccagcagacttacaagtctctgaggcacctttgaaaccatctcctaggtttcttcggaaggac
ttcggtccgtgtacttctagcacaacgtgctagtttcagggtacgggtgccccccacttttgtggggcctccaaaaggagacca。
[0056]
注：加粗斜体是2b蛋白的提前终止密码子；小写碱基分别表示bamhi和smai；下划线碱基表示插入的pvx(ncbi登录号eu571480)的5890-6089位片段
[0057]
实施例4.质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
的生物学效应
[0058]
农杆菌浸润侵染中烟100：首先将野生型cmv
fny
rna1、pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
、野生型cmv
fny rna3的质粒分别转化农杆菌gv3101的感受态细胞，涂带有50μg/ml卡那霉素和100μg/ml利福平的lb平板，28℃，培养48h后挑取单斑进行菌落pcr验证后，挑取单斑于2ml lb培养液(50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，28℃，200rpm培养24h。
[0059]
诱导：分别取含cmv
fny
rna1、pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
5890-6089
、cmv
fny
rna3，300μl菌液加至5ml lb培养液(含50μg/ml卡那霉素，100μg/ml利福平)中，于28℃振荡培养至od
600
为1.0-2.0。
[0060]
重悬：将经诱导的菌液于10ml离心管，在室温条件下，6000rpm离心10min；收集菌体并重新悬浮于1ml农杆菌菌体重悬溶液(10mm mgcl2，10mm mes，0.1mmas)中吸打混匀，取50ul菌液到1ml重悬液，测其od
600
値，调整浓度使其od
600
为1.2，根据菌液和重悬液的比例调整剩余菌液od
600
为0.4-0.5，并使得3种菌液od
600
一致。
[0061]
将三种调节好od
600
值的菌液(分别含有cmv
fny
rna1、pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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、cmv
fny
rna3)等比例混匀，28℃静置3h。
[0062]
接种：取1ml一次性注射器，去掉针头吸取农杆菌菌液，选取3-4叶期的中烟100，利用压力将注射器中的菌液从叶片背面的叶脉之间注入，每株共注射两个叶片，每片叶片注射量至少覆盖叶片的1/3。
[0063]
接种完的植株放置25℃培养，16h光照/8h黑暗交替。
[0064]
结果分析：接种10d后，接种野生型cmv
fny
rna1/rna2/rna3的中烟100叶片皱缩，植株矮化；接种cmv
fny
rna1/rna2-2bpt-pvx
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/rna3与健康对照基本一致，无明显的病毒病症状。表明pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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为cmv rna2的弱毒突变体(图5)。
[0065]
为检测突变体接种烟草后的遗传稳定性，分别在接种后第5、7和9天在同一片系统叶片上取样，利用rt-pcr检测异源病毒插入片段是否稳定存在。为检测异源病毒插入片段是否稳定存在，在cmv
fny
rna2的异源片段插入序列的上下游设计引物cm-fny2-2510-f(seq id no.7)和cm-fny2-2760-r(seq id no.8)，进行rt-pcr检测。引物cm-fny2-2510-f对应于cmv
fny
rna 2的2510-2529位，引物cm-fny2-2760-r互补于cmv
fny
rna 2的2740-2760位。
[0066]
结果分析：pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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接种中烟100第5、7、9天，在系统叶片中可以利用rt-pcr检测到病毒的复制信号，根据扩增片段的大小判断插入的pvx片段仍然存在(图6)。
[0067]
实施例5.质粒载体pcb301-cmv
fny-r2-2bpt-pvx
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的交叉保护效果测试
[0068]
利用实例4中的方法，接种cmv
fny
rna1/rna2-2bpt-pvx
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/rna3进行交叉保护测试。接种弱毒突变体的10d后，分别用靶标强毒cmv和pvx侵染预先接种弱毒突变体的植株和未预先接种弱毒突变体的植株，测试其交叉保护效果。
[0069]
结果分析：cmv和pvx强毒直接接种前期未接种突变体的中烟100，整体矮小，表现深浅绿相间花叶症状，以及典型的cmv侵染导致的鼠尾状发病特征；预接种cmv
fny
rna1/
rna2-2bpt-pvx
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/rna3的中烟100再进行靶标强毒(cmv+pvx)的接种，株高与健康对照基本一致，生长状态良好，只存在微弱花叶症状，说明预接种rna1/rna2-2bpt-pvx
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/rna3的中烟100对cmv+pvx有较好的交叉保护防治效果，为兼抗pvx的cmv弱毒疫苗(图7)。
[0070]
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。