用于PAX1基因甲基化检测的荧光定量PCR检测试剂盒及其应用的制作方法

用于pax1基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及分子诊断领域，特别涉及一种用于pax1基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒及其应用。


背景技术：

[0002]
基因甲基化是肿瘤的早发事件，通过检测那些在正常组织和非癌变的其他病变组织中不发生甲基化，而只在肿瘤组织中发生甲基化的基因上的甲基化标志物，可以辅助诊断肿瘤，特别是在早诊肿瘤中发挥着作用。通过无创方法来辅助诊断肿瘤目前已经进入了临床应用阶段，例如通过外周血血浆中游离dna上的甲基化片段早诊大肠癌，通过尿液中游离dna上的甲基化片段早诊膀胱癌等。在这些甲基化无创早诊肿瘤的方法中，所检测的体液标本中，绝大多数都是正常组织细胞释放的游离dna，而由肿瘤细胞释放的游离dna只占非常小的比例，因此提高检测游离肿瘤细胞dna上的甲基化方法一直是研发者努力的方向。
[0003]
pax1隶属于配对盒基因家族,是一种重要的转录调控因子,pax1通过调控细胞增殖,诱导细胞定向迁移等参与胚胎发育过程中重要器官的形成.新近研究表明,pax1在宫颈癌组织中的甲基化频率非常高,且随病情的演变呈现明显的上升趋势.pax1甲基化检测与hpv检测相比具有更高的敏感性和特异性.开展pax1基因的甲基化检测有助于提高宫颈癌的检出率。
[0004]
荧光定量方法由于其方法的简便性，以及荧光定量pcr仪器的普及，在检测基因甲基化上发挥着重要作用。目前荧光定量方法检测甲基化片段，主要是利用亚硫酸盐处理后的dna序列，发生了甲基化的c碱基保持为c碱基，而不发生甲基化的c碱基转化成u碱基，从而可以根据亚硫酸盐转化后的序列差异来设计一对引物和一条探针来特异性检测甲基化。pcr扩增后产生了两条dna链的指数级的扩增，但目前的荧光定量pcr检测甲基化只针对其中的一条dna链设计探针进行了检测，而另外一条扩增出来的dna链没有进行利用。


技术实现要素：

[0005]
为了解决上述问题，本发明提供一种用于pax1基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒，所述试剂盒包括一对甲基化扩增引物和二条甲基化检测探针，所述一对甲基化扩增引物用于扩增pax1基因启动子到第1-3外显子的序列中一段cpg序列富集区域，该段cpg序列富集区域是一个pcr反应所扩增的序列，该段cpg序列富集区域中具有至少8个甲基化的cpg序列；所述二条探针分别用于检测pcr扩增产物的正链和负链，两条探针都使用相同的荧光报道基团和淬灭基团。
[0006]
在一种实施方式中，在所述一对甲基化扩增引物扩增的一个pcr反应所扩增的序列内，所述至少8个甲基化的cpg序列中至少2个甲基化的cpg序列用于检测pcr扩增产物的正链探针，至少2个甲基化的cpg序列用于检测pcr扩增产物的负链探针。
[0007]
在一种实施方式中，所述pax1基因启动子到第1-3外显子的序列中一段cpg序列富
集区域长度在200个碱基序列内。
[0008]
在一种实施方式中，所述一对甲基化扩增引物用于扩增pax1基因转录起始碱基上游98至下游53碱基的一段cpg序列富集区域，该区域序列为seq id no:1：no:1：其中以下划直线的序列为引物序列，划波线序列和虚线为探针序列；在该区域中具有3个和3个cpg序列可分别用于两条甲基化扩增引物，和该区域中具有4个和2个cpg序列可分别用于两条甲基化检测探针。
[0009]
在一种实施方式中，所述一对甲基化扩增引物的上游引物是seq id no:2：cggggaggggggcgttggggc，下游引物是seq id no:3：ccgattaaaaaaaattcgtctaaccg；所述两条甲基化检测探针中正向探针是seq id no:4：tgttaattcgcgcgttttcgg，和反向探针是seq id no:5：ctacaacgtacgaaaatca。
[0010]
在一种实施方式中，本发提供上述试剂盒在检测宫颈癌中的应用。
[0011]
在本发明中，充分利用针对pax1甲基化片段扩增得到的pcr产物双链，每条链都能产生反应信号，因此可以提高检测pax1甲基化片段的灵敏度。
附图说明
[0012]
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0013]
图1是本发明的用于靶基因甲基化检测的荧光定量pcr检测试剂盒的反应原理图，其中两个实体的黑点就表示甲基化的cpg岛；和
[0014]
图2是阴道镜病理确认为宫颈癌的宫颈刷液中提取的dna所进行的甲基化荧光定量pcr反应结果图。
具体实施方式
[0015]
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合以下实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
[0016]
如图1所示，本发明通过分析靶基因启动子到第1-3外显子的序列找到cpg序列相对富集的区域，该段cpg序列富集区域是一个pcr反应所扩增的序列，该段cpg序列富集区域中具有至少8个甲基化的cpg序列；所述二条探针分别用于检测pcr扩增产物的正链和负链，两条探针都使用相同的荧光报道基团和淬灭基团。
[0017]
该段cpg序列富集区域中序列长度通常在200个碱基序列内，以保证较高的扩增效率。如果一个pcr反应所扩增的序列大于200个碱基，会显著降低扩增效率。
[0018]
两条探针都使用相同的荧光报道基团和淬灭基团，这样两条探针就充分利用了pcr扩增双链的每一条链，使得甲基化荧光定量的灵敏度理论上加倍。本发明中探针例如可以是taqman探针、beacon分子信标探针，和基于荧光共振能量转移的荧光dna探针。
[0019]
一、本发明的反应体系
[0020]
1.反应体系
[0021]
成分终浓度gotaq缓冲液1хdntp(包括dutp)0.5mm eachmgcl23mm上游引物0.4μm下游引物0.4μm靶基因正链探针0.15μm靶基因负链探针 actb上游引物0.1μmactb下游引物0.1mactb正链探针0.075μmactb负链探针0.075μmgotaq热启动酶0.5μl亚硫酸盐处理的dna模板6μl补水至20μl
[0022]
其中actb是内参基因。
[0023]
2.荧光定量pcr反应条件
[0024][0025]
二、pax1基因甲基化从宫颈刷液中检测宫颈癌
[0026]
pax1基因位于chr20:21,705,659-21,715,982正链，本发明扩增pax1基因起始位置为pax1基因转录起始碱基上游98至下游53碱基共计151个碱基的pcr产物。以下划直线的序列为引物序列，划波线序列和虚线为探针序列。
[0027][0028]
本实例实施方式一(本发明1)中，所设计的引物和探针序列如下：
[0029]
pax1-上游引物cggggaggggggcgttggggc(seq id no:2)含有3个cg碱基pax1-下游引物ccgattaaaaaaaattcgtctaaccg(seq id no:3)含有3个cg碱基pax1-正链探针fam-tgttaattcgcgcgttttcgg-bhq1(seq id no:4)含有4个cg碱基pax1-负链探针fam-ctacaacgtacgaaaatca-bhq1(seq id no:5)含有2个cg碱基
[0030]
以上同时使用正向探针up和反向探针lp，up上含有4个cg碱基；lp上含有2个cg碱基。
[0031]
在本实例实施方式二(本发明2)中，引物同上，以上同时使用正向探针up和反向探针lp，up上含有2个cg碱基；lp上含有2个cg碱基。
[0032]
本实例实施方式二(本发明2)中，所设计的引物和探针序列如下：
[0033]
pax1-上游引物cggggaggggggcgttggggc(seq id no:6)含有3个cg碱基pax1-下游引物ccgattaaaaaaaattcgtctaaccg(seq id no:7)含有3个cg碱基pax1-正链探针fam-tgttaattcgcgtgtttttgg-bhq1(seq id no:8)含有2个cg碱基pax1-负链探针fam-ctacaacgtacgaaaatca-bhq1(seq id no:9)含有2个cg碱基
[0034]
与此作为比较之一(比较1)，引物同上，没有用到正向up探针，只用了反向探针lp；
[0035]
pax1-lpfam-ctacaacgtacgaaaatca-bhq1(seq id no:10)含有2个cg碱基
[0036]
与此作为比较之二(比较2)，引物同上，没有用到反向lp探针，只用了正向探针up；
[0037]
pax1-upfam-tgttaattcgcgcgttttcgg-bhq1(seq id no:11)含有4个cg碱基
[0038]
与此作为比较之三(比较3)，引物同上，同时用到正向up探针和反向lp探针，但总的cg碱基数少于4个cg碱基。
[0039][0040]
当同时设计正向探针和反向探针，就可以充分利用pcr扩增产生双链，产生较高的灵敏度；而当1条探针含有大于等于2个cg序列时，就能充分区分甲基化和非甲基化的dna，产生较高的特异性。
[0041]
临床应用案例。取经过阴道镜和组织活检确认的宫颈癌患者和低级别病变癌患者宫颈刷液各20例，用磁珠法提取宫颈刷液中的dna，把dna经过亚硫酸盐转化后，进行甲基化荧光定量pcr反应。荧光定量ct≤40，定为甲基化反应阳性；ct>40，定为甲基化反应阴性。比较本发明方案和3种其他设计方案在通过宫颈刷液诊断宫颈癌的灵敏度和特异性，结果见表4。
[0042][0043]
可见本发明组较其他比较组，在灵敏度和特异性上都有提高。
[0044]
取1例经过阴道镜病理学确认的宫颈癌患者的宫颈刷液2ml，用磁珠法提取宫颈刷液细胞中dna，把dna经过亚硫酸盐转化后，进行甲基化荧光定量pcr反应，比较双探针和单探针的荧光定量反应曲线在灵敏度上的表现，结果见图2。采用的是本发明2双探针(实线)和比较1传统单探针(虚线)进行比较的结果。尽管本发明1和传统单探针都检出阳性结果，但经过双探针反应，ct值较单探针反应提前了1.5个循环，相当于灵敏度提高了2的1.5次方，等于灵敏提高了2.8倍。另外，本发明1和本发明2的结果比较中，两者具有类似的灵敏度，本发明1的相对于比较1灵敏度提高了3.2倍。
[0045]
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
[0046]
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。