专利名称：人博卡病毒实时荧光pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测人博 卡病毒的试剂盒。
背景技术：
冬季小儿呼吸道感染高发，其病原很复杂，除细菌、支原体、衣原体之外，很大一部分 为病毒。近20年来，新发现的30多种传染病的病原中， 一半以上是病毒，特别是婴幼儿急 性呼吸道感染的病原中，绝大部分为病毒。尽管如此，还有相当一部分婴幼儿急性呼吸道感 染的病原尚不清楚。在我国，小儿下呼吸道感染是住院治疗的首要原因，而小儿肺炎是引起 小儿死亡第5位的主要原因。美国每年约有250，000儿童因下呼吸道感染住院。在临床上， 有约12-39%的小儿下呼吸道感染病因不明。2005年8月，瑞典斯德哥尔摩市卡罗林斯卡大学 医院的科学家运用分子病毒筛査方法，首次在儿童呼吸道分泌物中发现了这种"非常普遍、 以前未知"的病原体，其基因序列与细小病毒科的牛(bovine)、犬(canine)细小病毒相近，他 们将这种病毒命名为人类博卡病毒(human bocavirus， HBoV) (Tobias Allander， Martti T. Ta咖i ， Margareta Eriksson, et al. Cloning of a human parvovirus by molecular screening of respiratory tract samples. PNAS. Sept. 2005， vol 102, p. 12891-128%)。 进一步的研究发现，该病毒与儿童急性下呼吸道感染有关。 一个月后，澳大利亚学者再次从 急性呼吸道感染的儿童中，检获同一种病毒(Sloots TP，McErlean DJ.Speicher KE. Arden MD. Nissen， and IM. Mackay. 2006. Evidence of human coronavirus HKU1 and human bocavirus in Australian children. J. Clin. Virol. 35:99-102.)。此后，荷兰、加拿大、美国、法国、 澳大利亚以及亚洲的中国、日本、韩国、泰国也相继报道了这种病毒的感染情况。
HBoV在呼吸道感染的患者样本中频繁被检测到。但它在呼吸道感染中所扮演的角色还 不清楚。苏格兰爱丁堡大学的Peter Simmonds博士在924例呼吸道感染者(主要来自婴幼儿 患者)中进行了HBoV筛查，研究发现朋oV感染频率仅次于呼吸道合胞病毒和腺病毒，列 第三位，且感染者几乎全部是婴幼儿。耶鲁大学医学院的Jeffrey S. Kahn博士通过将无呼 吸道感染症状的个体作为对照组，在儿童中进行朋oV筛査，发现在对照组个体中没有或极少 发现HBov，因此认为HBoV是导致婴幼儿上、下呼吸道疾病的病原体之一。尽管在这两次研 究中所涉及的人群范围较小，采用样本的婴儿都在同一年龄，样本都是在同一家医院的不同 时间抽取的，但它揭示了病毒和疾病之间统计学上的关联。
在临床上，朋oV不易区别于其他呼吸道病毒，正引起许多学者、专家的密切关注，其致病性、发病机制、传播途径、感染人群、机体的免疫反应等，尚需进行更多研究。
对HBoV感染的检测意义体现在以下几个方面(1)通过检测有(或无)呼吸道感染症状 个体的HBoV感染情况，阐明呼吸道感染与HBoV联系，了解临床病征相关性。(2)简单易行 的HBoV检测方法，便于在人群中进行大规模的HBoV筛査或流行病学调査，帮助我们了解这 种新病毒朋oV在其他人群中的感染、传播和季节分布情况。(3)为了解这种病毒的致病性和 发病机制提供了条件，对进一步研究防治措施和研制预防疫苗将起到积极作用。
目前朋oV诊断主要为血清学检査和分子生物学方法。如通过在昆虫细胞中表达特异性的
病毒抗原蛋白，建立人博卡病毒特异性抗体血清酶联免疫检测技术。该技术适合于人博卡病 毒感染的血清学诊断及大规模的血清流行病学调査。但是受方法本身灵敏度限制，对于病毒 含量较低的患者可能会出现检测的假阴性，自身免疫性疾病患者也可能出现假阳性。此外， 血清化验检测到的抗体只能代表现在或者过去有感染，而不能区别急性感染和慢性感染以及 治愈者，所以不适于作为急性感染的标志。
分子生物学方法主要是根据保守区设计引物，再通过电泳对PCR扩增产物进行鉴定。荧 光定量PCR (FQ-PCR)用于病原学诊断，是PCR技术领域的一项创新，FQ-PCR直接检测HBoV 核酸，特异性强、敏感性很高，是目前诊断HBoV感染的主要方法。与血清学检测方法相比具 有以下的优势(1)具有更高的灵敏性，适用于鼻咽分泌物的检测。(2)针对病毒特异性序 列设计引物探针，与血清学检验所用的抗原片段相比，具有更高的特异性，避免了常规血清 学检测中与呼吸道病毒的交叉反应；(3)对病毒进行定量检测，可真实反映出患者体内病原 体拷贝数的高低和复制情况，有助于判断疾病预后，选择治疗方案及监测治疗效果等。(4) 可扩大检测人群范围，进行流行病学调査和病原体筛查；(5)将PCR的敏感性与探针杂交的 特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，降低了反应时间，简化了操作步骤；
(6)闭管检测不需PCR后处理，避免了由于样本间的交叉污染引起的假阳性和环境污染；(7) 实时检测技术可连续不断地检测PCR过程中荧光信号的变化，避免了传统PCR的"平台期效 应"，并且模板的定量不通过终产物，而由Ct值计算出，准确性和灵敏度均有提高。
本发明选取人博卡病毒(朋oV)基因组中保守序列作为扩增靶序列区域，设计特异性引 物和荧光探针，通过实时荧光PCR对HBoV进行实时荧光PCR检测，该方法相比其它方法有以 下几点优点(1)操作简单，耗时少，成本低，不需要电泳检测产物，从仪器上读出数据对 检测样本定量；(2)可一次检测大量样本，敏感性高于血清学检测方法，可获得病毒载量， 从而用于了解病毒载量与临床症状的关系。临床研究结果表明检测人博卡病毒(HBoV)为 小儿下呼吸道感染的临床病因快速诊断、治疗提供新的依据，对于确认其在中国的流行分布 和进一步了解这种新病毒将起积极作用。
发明内容
本发明的目的是在于提供一种利用实时荧光PCR技术定性或定量检测人博卡病毒的试剂 盒，该试剂盒包括(l)DNA提取试剂、核酸扩增反应体系、纯水、定量参考品、阴性质控品、 阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒。
本发明的目的是这样实现的(1)针对人博卡病毒保守序列设计的能够与靶多核苷酸结 合的寡核苷酸引物和寡核苷酸探针；(2)将寡核苷酸探针标记上荧光发生基团，使所说的荧 光发生基团与被扩增的靶多聚核苷酸间接结合，(3)选择适宜于PCR扩增的反应体系和荧光检 测体系；(4)确定荧光发生基团所产生的荧光量，分析循环扩增后产生的荧光量以确定耙多 核苷酸的存在及定量。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所述的核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、 2'-脱氧核苷三磷酸、能够与双链靶多聚核苷酸的第一条链结合的正向寡核苷酸引物、能够 与双链靶多聚核苷酸的第二条链结合的反向寡核苷酸引物、能够与耙多聚核苷酸结合并且两 末端分别结合有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所述的与靶多核苷酸结合的寡核苷酸引物，其特 征在于扩增反应所使用的正向和反向寡核苷酸引物的序列分别是5' - GAG GGG AGA GGA AGA GAC ACT G - 3' (SEQ ID NO: l)和5， - GCA AGA CGA TAG GTG GCT GAT - 3， (SEQ ID NO: 2)。
根据本发明的一个优选实施方案，其中所述的寡核苷酸探针的序列是5' X-TCATCACAG GAG CAG GAG CCG CA - Y 3' ; (SEQ ID NO: 3)。其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括 能够与靶多核苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探 针。
根据本发明的一个优选实施方案，进一步包括(1)确定样品中的靶多核苷酸经扩增后 所产生的荧光达到基线以上的固定阈值时所需的闳循环次数；(2)将已确定的样品中耙多核 苷酸的阈循环次数与标准溶液中已知量靶多核苷酸的阈循环次数相比较，以计算出样品中靶 多核苷酸的量。
根据本发明的一个优选实施方案，所述的试剂盒，其特征在于定量参考品包含下列序列 或80%同源的核苷酸序列ATCGGGGAAAAAAGACAATAGAACAAATCCATACACTGTATTCAGTCAACACAGAGCTTCCA。
根据本发明提供的试剂盒，对人博卡病毒进行检测，该方法包括下列步骤
(1) 用DNA提取试剂进行阴、阳性质控品和待测样本(痰液、鼻咽抽提液或咽拭子抽 提液)的DNA提取。DNA提取试剂除本发明提及的方法外，还可以使用其他成熟的DNA提取方 法和试剂盒。
(2) 将提取的DNA和定量参考品加入到含有核酸扩增反应体系的反应管中，进行PCR扩 增，使用荧光定量PCR检测仪进行检测。
(3) 利用定量参考品制备的标准曲线通过软件分析确定待测样品对应的浓度。 根据本发明提供的用于人博卡病毒检测的荧光定量PCR试剂盒，其中有一条两端标记有荧
光基团和淬灭基团的特异性荧光探针，它设计为与目标序列上游引物和下游引物之间的序列 配对。荧光基团连接在探针的5'末端，而淬灭基团则在3'末端。当完整的探针与目标 序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3'端的淬灭基团接近而被淬灭。但在进行延伸反应 时，聚合酶的5'外切酶活性将探针进行酶切，使得荧光基团与淬灭基团分离。随養扩增循 环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系。 对人博卡病毒的定量可以与定量参考品的循环域值(CT， Threshold cycle)比较得出，利用 定量参考品制备的标准曲线，直接得到待测样本的起始拷贝数。
本发明所述的试剂盒，针对人博卡病毒培养困难，病毒核酸难以通过传统的方法进行定 量，使用体外克隆的全长博卡病毒质粒制备标准曲线，用于待测样本的核酸绝对定量；此外， 针对人博卡病毒检测中的特殊性，对核酸扩增反应体系中引物探针浓度、Mg"浓度以及反应的 退火温度等均进行了优化，结合荧光定量PCR技术，用于人博卡病毒的定量检测，通过优化方 案，反复实验，建立了定量检测人博卡病毒的方法，并研制出用于人博卡病毒核酸定量检测 的试剂盒，该试剂盒的检测的灵敏度至少可达到1000拷贝/ml病毒粒子。
本发明与现有技术相比，具有下列优点
(1) 特异性更强，灵敏度更高。
(2) 全封闭反应，提取病毒DNA后，直接用于PCR检测，避免了污染发生；
(3) 检测速度快，整个过程仅需3 4小时；
(4) 操作简单，可控性强，可进行大批量样品检测，有利于产业化。
图l显示检测人博卡病毒时不同浓度样本的扩增曲线，三个标本的Ct值分别是9.91、 18.18、 21.33,扩增曲线为S形，均能够判定为阳性。图2显示五个阴性标本的扩增曲线，均不具S形特征，能够判定为阴性。
图3显示两个阴性标本的扩增曲线，与荧光检测阈值线没有交点，能够判定为阴性。
图4显示定量检测时的扩增曲线，针对模板数为103 108拷贝/ml进行PCR分析，结果表明
试剂盒具有很高的灵敏度，可达1000拷贝/ml。
图5显示定量检测时Std curve窗口下的标准曲线，绘制得到的标准曲线相关系数达到
0.9975。
图6显示阳性标本灵敏度实验的检测曲线，结果表明试剂盒具有很高的灵敏度，可达IOOO 拷贝/ml。
图7显示阳性标本重复性实验的检测曲线，结果表明试剂盒具有良好的重复性。
具体实施例方式
下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
实施例h人博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒及其使用
(1) 制备包括下列组成成分的试剂盒DNA提取液(500yl /管)l管、PCR反应管IO 管、纯水(2000ul/管)l管、强阳性质控品(50ul /管)l管、临界阳性质控品(50u1/ 管)l管、阴性质控品(50ul/管)l管。
其中DNA提取液由异硫氰酸胍、氢氧化钠、SDS等物质组成。PCR反应管内为核酸扩增反应 体系，由引物、探针、耐热DNA聚合酶、dNTPs等组成。本发明的试剂盒中使用带有目的基因 片段的重组质粒作为强阳性质控品，其浓度为lX105拷贝/ml，使用带有目的基因片段的重组 质粒作为临界阳性质控品，其浓度为lX102拷贝/ml，并使用生理盐水作为阴性质控品。
(2) 标本采集、运送和保存负压下吸取痰液，置于低温冰箱(一7(TC或一2(TC)冷冻 保存。如集中检验，标本需在(TC以下环境中运送并于24小时内送达实验室。
(3) 检测步骤和结果分析
痰液吸取50ul待检样本至1. 5ml离心管中，直接加入50 u 1 DNA提取液充分混匀。 10(TC加热处理10分钟(误差不超过l分钟)后，12,000rpm离心5分钟，取上清液2yl 用于PCR反应。
将强阳性质控品6000rpm离心15秒，加入稀释液450 ul，充分混匀后标示为105。然后另 取3支新的0.5ml离心管，对标准品依次进行10倍梯度稀释(分别标示为104、 103、 102)， -20 'C保存备用。
然后分别取待检样品(每份2ul)、同样体积的定量质控品和阴性质控品，加样于PCR反应 管中进行PCR扩增。PCR循环条件是93。C预变性3分钟，93°C 30秒，55°C 45秒，进行40次循环，在反应的延伸阶段检测荧光信号。
反应结束后保存检测数据文件。调节分析参数，使标准曲线(Std curve )窗口下的标 准曲线图达到最佳(即相关系数的绝对值〉0.95)(参见附图5)。阳性标本的荧光扩增曲线呈S 形，且与设定的阈值线有一交点(参见附图l)，而阴性标本的荧光曲线为不规则的折线，不 是S形曲线(参见附图2和附图3)。最后由仪器自动分析装置计算出未知标本的测定数值(Qty)， 即标本中博卡病毒的DNA含量(参见附图4和附图5)。
实施例2:灵敏度测试
具体步骤同实施例l，不同的是所用标本为确定阳性的标本并测定浓度。提取核酸后用本 发明的试剂盒进行PCR扩增，每一份标本设置多个复管。在扩增的同时由仪器自动监测并收集 荧光信号的变化。结果表明试剂盒具有很高的灵敏度，可达1000拷贝/ml。(参见附图6)。
实施例3:重复性测试
具体步骤同实施例l，不同的是所用标本为确定阳性、不同浓度的标本提取核酸后用本发 明的试剂盒进行PCR扩增，每一份标本设置多个复管。在扩增的同时由仪器自动监测并收集荧 光信号的变化。反应结束后分析，应用本发明的试剂盒检测结果，此结果表明i式剂盒具有良 好的重复性。(参见附图7)。
以上内容是结合具体的优选实施方式对本发明所作的进一歩详细说明，不能认定本发明 的具体实施只局限于这些说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本 发明构思的前提下，如做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。序列表
〈110>中山大学达安基因股份有限公司
〈120〉人博卡病毒实时荧光PCR检测试剂盒
<140>
<141〉
<160>4
〈210> 1 <211〉 22 <212> DNA <213>人工序列 <220>
<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作PC財广增的引物。 <400〉 1
g3gggg3g恥g肪g3gacac t g
<210〉 2
<211> 21 〈212〉画 <213>人工序列 <220〉
<223〉根据特定核苷酸序列设计，以用作PCR扩增的引物。
<400〉 2
gcaagacgataggtggctgat
<210> 3 <211> 23 <212>腿 <213>人工序列<223>根据特定核苷酸序列设计，以用作检测荧光信号的探针。 〈400> 3
tcatcacaggagcaggEigccgcEL
权利要求
1、一种利用实时荧光PCR技术定性或定量检测人博卡病毒的试剂盒，该试剂盒包括(1)DNA提取试剂、核酸扩增反应体系、纯水、定量参考品、阴性质控品、阳性质控品，和(2)分隔并集中包装这些试剂瓶或管的包装盒，其中核酸扩增反应体系包括耐热DNA聚合酶、2’-脱氧核苷三磷酸、正向寡核苷酸引物、反向寡核苷酸引物、寡核苷酸探针、含有镁离子的缓冲液，其特征在于扩增反应所使用的正向和反向寡核苷酸引物的序列分别为5’-GAGGGGAGAGGAAGAGACACTG-3’和5’-GCAAGACGATAGGTGGCTGAT-3’。
2、 根据权利要求1的试剂盒，其特征还在于寡核苷酸探针的序列为5' X-TCATCACAGGAGCAGGAG CCGCA - Y 3'，其中X/Y表示荧光标记检测体系，包括能够与靴多核 苷酸结合并且两末端分别结合的有荧光发生基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸探针。
3、 根据权利要求l的试剂盒，其特征还在于可应用于人博卡病毒快速定性或定量检测。
全文摘要
本发明涉及一种实时荧光PCR检测试剂盒，特别是涉及利用实时荧光PCR技术检测人博卡病毒的试剂盒。本试剂盒操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，可对多种类型标本中人博卡病毒进行定性或定量检测，用于早期诊断、流行病学研究等多个领域。
文档编号G01N21/64GK101550452SQ20081002710
公开日2009年10月7日 申请日期2008年3月31日 优先权日2008年3月31日
发明者乔颖飒, 瑰 何, 何蕴韶, 朱振宇, 明 李, 王方金 申请人:中山大学达安基因股份有限公司