专利名称：一种检测dna,rna和超微量蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及采用DNA条码一纳米金一T7RNA转录扩增(Bio-DNA TMA) 方法检测DNA， RNA和超微量蛋白质的技术。
背景技术：
临床分子水平定量检测DNA， RNA和蛋白质已广泛应用于疾病诊断，疾病 疗效和预后的判断。目前一般釆用荧光定量PCR和RT-PCR， IVRNA转录介导 的杂交保护发光(TMA—HPA)检测DNA和RNA含量，发光ELISA检测微量 蛋白质。另外，还有一类不需靶分子扩增的核酸检测方法如分支DNA杂交技术 (bDNA)，捕获杂交技术(Hybrid Capture, HC)。近年以纳米材料发展的检测 DNA， RNA，微量蛋白质技术引人注目，如MirkinCA等发明的DNA条码一纳 米金技术(Bio-coded nanoparticles technology)检测DNA， RNA和超微量蛋白 质。各种技术都有其优缺点，核酸扩增技术灵敏度高，但易产生假阳性和假阴性， 并且实验条件要求高；杂交技术简便易自动化，重复好，但灵敏度较低，试剂成 本昂贵；纳米技术灵敏高，方便，成本较低，但定量需特需仪器，不易标准化和 大规模检测。发明内容为了吸取各方法的优点，避免其缺陷，本发明提供一种既具有PCR法的高 敏感性，又要避免PCR的缺陷，且简便易行的DNA条码一纳米金一T7RNA转 录扩增(Bio-DNATMA)方法检测DNA， RNA和超微量蛋白质，用于科研和 临床分子诊断。DNA条码一纳米金一T7RNA转录扩增(Bio-DNATMA)方法主要综合利用 纳米技术和TMA扩增技术的优点，克服各自的缺陷，建立的一种新的分子水平 检测DNA， RNA和超微量蛋白质技术。此技术首先利用磁珠捕获探针上的捕获 探针l(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测耙分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探 针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA，可 把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码DNA利用链亲和素一生物素系统可 结合3分子含T7RNA启动子的DNA序列，从而可用TMA技术定量检测条码 DNA，而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T7RNA启动子的DNA序 列，TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA，相应 地把条码DNA扩增一万倍。转录的RNA用高灵敏度的荧光染料RiboGreen荧 光光度法检测(可检测0.2ng的RNA)，通过上述三步放大反应，可把耙分子扩 增约3X1()S倍，可与PCR相媲美。Bio-DNATMA吸收了纳米金技术和TMA技术的扩增优点，灵敏度可达PCR 技术水平，理论上可检测一个耙分子。由于Bio-DNATMA不是直接扩增耙分子， 因而避免了PCR技术的假阳性问题，且操作简单，重复性好，易于大规模检测， 也不需要贵重仪器，成本相对较低。此技术可应用于检测DNA， RNA和超微量 蛋白质，特别是现在还没有成熟的分子水平检测体液中超微量蛋白质技术，因而 Bio-DNATMA具有广泛的应用价值。
图1为磁珠捕获探针和纳米结合探针的制备示意图；图2为磁珠捕获探针和纳米结合探针夹心ELISA检测靶DNA的过程示意图；图3为生物素一链亲和素桥连TMA的过程示意4为TMA扩增反应示意图；图5为RiboGreen荧光定量检测RNA的示意图；图6为Bio-DNATMA检测RNA原理示意图；图7为Bio-DNATMA检测超微量蛋白质的原理示意图。
具体实施方式
原理1.磁珠捕获探针的制备表面带有游离-NH3的磁珠，与末端带有-SH的捕获探4针l (3末端带有-SH，中间带有PEG和10个连续的A，作为间隔桥梁序列， 5末端为与检测靶DNA 3末端互补的18—25bp碱基序列)用戊二醛的方法 连接氨基和巯基，使捕获探针1标记到磁珠表面，制成磁珠捕获探针(图1)。2. 纳米结合探针的制备纳米金颗粒的金原子与5末端带有-SH的捕获探针2 和条码DNA (条码DNA/捕获探针2为100: 1)在水溶液中形成共价键，牢 固结合在纳米金的表面，逐步加NaCl到终浓度为0.3M，使捕获探针2和条 码DNA在纳米金表面伸展(捕获探针2其5末端带有-SH，中间带有PEG 和IO个连续的A，作为间隔桥梁序列，3末端为与检测耙DNA5末端互补的 18—25bp碱基序列；条码DNA其5末端带有-SH，中间带有10个连续的A， 作为间隔桥梁序列，3末端为 一段与检测DNA不互补且无关的18-25bp DNA， 并用生物素标记)，制备纳米结合探针(图l)。3. 生物素标记的含TV启动子的DNA序列的制备设计引物F: 5-BI0TIN-GAG AGA GGA TCC AAG TAC TAA TAC GAC TCA CTA TAG-3f5末端用生物素 标记，下划线部分为1V启动子序列)；R: 5-ATC TTG CAA GAA AAC AGA TGG CAAGCATGA CTC GAG GCG CCT TGT CCC AAG陽3 (下戈機部分为 T7 RNA酶终止序列).以pcDNA-HCCR质粒(HCCR基因cDNA克隆入 pET-30a表达质粒)为模板，PCR扩增HCCR基因的500bp序列，扩增产物 纯化后作为生物素标记的含IV启动子的DNA序列。4. Bio-DNATMA法检测靶DNA原理磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶 DNA3末端互补，纳米结合探针捕获探针2与检测DNA5末端互补，在杂交 缓冲液中夹心法结合靶DNA，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤， 去除未结合的纳米结合探针和其他杂质(图2)。再加入杂交缓冲液重悬磁珠， 以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37°C，温育30分钟， 磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物 素标记的含T7启动子的DNA序列(图3)。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA 聚合酶和四种核苷酸(UTP， ATP， GTP,CTP)， 37°C，温育3小时，转录RNA(图4)， RNA的量与检测耙DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen 荧光染料荧光光度计定量检测(图5)。5. Bio-DNATMA法检测DNA的扩增原理第一次扩增直径200nm的纳米结合探针可结合约10000条DNA条码，可 把靶DNA放大104倍。第二次扩增;每一条条码DNA可通过链亲和素结合3条 生物素标记的含T7启动子的DNA序列，放大3倍。第三次扩增每一条含T7 启动子的DNA序列在T7RNA聚合酶作用下，3小时可合成约10"个RNA分子， 此步放大104倍。RiboGreen荧光染料最低能够检测0.2ngRNA，约对应于108个 500bp的RNA分子。 一分子检测靶DNA通过三次放大反应可放大到3 X 108倍， 恰够RiboGreen荧光染料检测最低极限，因而理论上Bio-DNA TMA法可检测到 一分子耙DNA。6. Bio-DNA TMA法检测RNA原理磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶 RNA3末端互补，纳米结合探针上捕获探针2与检测靶RNA5末端互补，在 杂交缓冲液中夹心法结合靶RNA，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗 漆，去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入杂交缓冲液重悬磁珠， 以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37°C，温育30分钟， 磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素，生物 素标记的含1V启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA聚 合酶和四种核苷酸(UTP,ATP,GTP,CTP)， 37°C，温育3小时，转录RNA， RNA的量与检测耙DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧 光光度计定量检测(图6)。7. Bio-DNATMA法检测超微量蛋白的原理与检测DNA， RNA不同的是，用 针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗，分别替代捕获探针1和捕获探 针2，制备磁珠捕获探针和纳米结合探针。磁珠捕获探针上的抗体1与纳米 结合探针上抗体2夹心法结合靶蛋白，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液， 并洗涤，去除未结合的纳米结合探针和其他杂质。再加入结合缓冲液重悬磁 珠，以及链亲和素，生物素标记的含T7启动子的DNA序列，37°C，温育30 分钟，磁铁吸附磁珠捕获探针，去上清液，并洗涤，去除未结合的链亲和素， 生物素标记的含T7启动子的DNA序列。加入T7RNA聚合酶缓冲液，T7RNA 聚合酶和四种核苷酸(UTP, ATP, GTP， CTP)， 37°C，温育3小时，转录RNA， RNA的量与检测靶DNA含量成正比。转录的RNA用RiboGreen荧光染料荧 光光度计定量检测(图7)。实施例l: DNA的检测1. 引物设计以检测EBV的Bamffl-W片段DNA为例(NCBI genbankaccession No: Ml5973)。检测Bamffl-W片段DNA的序列2091 CCATCCCTGA AGACCCAGCG GCCATTCTCT CTGGTAACGA GCAGAGAAGA AGTAGAGGCC CGCGGCCATT GGGCCCAGAT TGAGAGACCA GTCCAGGGGC CCGAGGTTGG AGCCAGCGGG CACCCGAGGT CC 2222。(1)，捕获探针1: 5—GGG CTT GGC CGG GTC TAA -PEG- AAA AAA AAA A- SH-(C6)-3.(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。 (2),捕获探针2: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA GGG ACC GGG TGC TGG-3(下划线部分与EBV BamHI-W片段DNA结合)。(3 )条码DNA: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TCA ACT CGTAGCT-Biotin-3.(4)阳性检测靶DNA:以EBV BamHI-W片段DNA为模板，合成一段阳性对 照引物，5—CCA GCA CCC GGT CCC TCC AAA AAA AAA TTA GAC CCG GCC AAG CCC-3(下划线为桥联序列)。2. 磁珠捕获探针的制备(1)取lml直径lpm表面带有游离-NH3的磁珠，加4ml PBS (O.OIM， pH 7.4) 充分摇匀，用磁铁吸附磁珠，去上清；重复三次，去上清。(2) 用PBS配制新鲜的5X戊二醛溶液。(3) 在磁珠中加入新鲜配制的5ml5X戊二醛溶液，充分摇匀，放在旋转摇床， 室温摇3小时。(4) 用磁铁吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清， 重复三洗次。(5) 加入50D的捕获探针1 (过量)，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇24 小时。(6) 用磁铁吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清， 重复三洗次。(7) 加入1M的甘氨酸5ml，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时，封 闭非结合位点。(8) 用磁铁吸附磁珠，去上清；加5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清，重复三洗次。最后用lmlPBS重悬，4'C保存。(9) 260 nm测定OD值，验证捕获探针1是否标记上。2. 纳米结合探针的制备(1) 捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解，按条码DNA/捕获探针2为 100: 1的比例混匀。(2) 取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入总量为50D的条码DNA和捕 获探针2混和液，充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。(3) 加热至60度，加入5MNaC150ul， 10%SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床 摇2h。加热至60度，加5M NaCl 50ul混匀，室温旋转摇床摇2h;重复四次。 使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。(4) 10000rpm离心IO分钟，去上清；加入PBS含0.3 M NaCl， 0.1%SDS， 重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5mlPBS含5% BSA 0.3 MNaCl， 0.1% SDS重悬，37°C，摇2h， 封闭未结合位点。10000rpm离心IO分钟，去封闭液， 力口lmlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS)重悬，4'C保存。(5) 260 nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。(6) 260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根据560nm OD值估算纳米金的数量。(7) 取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取lul点在醋酸纤维薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封闭2h;加 HRP标记的链亲和素，37°C 30分钟，用PBS含0.3MNaCl， 0.1^SDS洗膜四 次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。3. Bio-DNA TMA法检测EBV DNA:(1) ，取EDTA抗凝血桨500W，用QIAamp DNA Blood MiniKit (Qiagen)试剂 盒提取DNA，用50Pl纯水洗脱。(2) ， 50W样本DNA， 50W阳性对照DNA， 50W PBS阴性对照，分别加入10W 5 X杂交液(含0.5XSDS， 5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯烷酮，5g牛血清白蛋白V, 1. 5M NaCl, 0. 5M Tris-Hcl， pH 8. 0) 95。C5min，取出马上加入50W磁珠捕获 探针和50W纳米结合探针，6(TC10min，然后55'C旋转杂交2小时。(3) 磁分离器吸附磁珠30秒，弃去上清液，加入500WPBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)洗3次。(4) 磁珠重悬于50liaPBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)，依次加入50W链亲和 素(终浓度为5Pg/ml， 50W生物素标记的含T7启动子的DNA序列(终浓度为 250ng/ml) 37°C，摇动30min。 PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)，同上洗4次。(5) 磁珠重悬于50WT7RNA转录液(1XT7RNA转录缓冲液，60UT7RNA聚 合酶，RNA酶抑制剂200U， 1.25MM NTP)， 37°C，摇动3小时。(6) 加入20W RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释 200倍为工作液)，激发光为485mn，发射光535nm测定荧光。4.标准曲线的制作(1) 把阳性检测靶DNA用PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)倍比稀释，使终浓度 依次为10。/ml ， 10Vml,l()2/ml， 103/ml, 104/ml, 105/ml, 106/ml， 107/ml，按 上面步骤操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。(2) 取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。(3) 样品结果从标准曲线计算得去。实施例2: RNA的检测1. 引物设计以检测HCV的RNA为例(NCBI accession No: EU482888,检测对 应序列nt 1-216)。(1)， 捕获探针l: 5—AAC TAC TGT CTT CAC GCA GAA AGC -PEG- AAA AAAAAA A- SH-(C6)-3.(下划线部分与HCV 5-UTR nt 1-18 RNA结合)。 (2),捕获探针2: 5—SH"C6) -AAA AAA AAAA隱PEG- CCC AAC ACT ACT CGG CTA G-3(下划线部分与HCV 5-UTR nt 198-216 RNA结合)。(3 )条码DNA: 5 — SH國(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TC A ACT CGT AGCT-Biotin-3.(4)阳性检测靶RNA: WHO HCV标准品。2. 磁珠捕获探针的制备(1)取lml直径l!im表面带有游离-NH3的磁珠，力卩4ml PBS (O.OIM， pH 7.4，) 充分摇匀，用磁铁吸附磁珠，去上清；重复三次，去上清。(2) 用PBS配制新鲜的5X戊二醛溶液。(3)在磁珠中加入新鲜配制的5ml5X戊二酸溶液，充分摇匀，放在旋转摇床, 室温摇3小时。(4〉用磁铁吸附磁珠，去上清；力卩5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清， 重复三洗次。(5) 加入50D的捕获探针1 (过量)，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇24 小时。(6) 用磁铁吸附磁珠，去上清；力n5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清， 重复三次。(7) 加入1M的甘氨酸5ml，充分摇匀，放在旋转摇床，室温摇3小时，封 闭非结合位点。(8) 用磁铁吸附磁珠，去上清；力卩5mlPBS充分摇匀，磁铁吸附磁珠，去上清， 重复三洗次。最后用lmlPBS (含RNA酶抑制剂100U)重悬，4°〇保存。(9) 260 nm测定OD值，验证捕获探针1是否标记上。 2.纳米结合探针的制备(1) 捕获探针2和条码DNA引物用纯水溶解，按条码DNA/捕获探针2为 100: 1的比例混匀。(2) 取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入总量为50D的条码DNA和捕 获探针2混和液，充分摇匀。室温旋转摇床摇过夜。(3) 加热至60度，加入5MNaC150ul， 10%SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床 摇2h。加热至60度，加5M NaCl 50ul混匀，室温旋转摇床摇2h;重复四次。 使NaCl终浓度为0.3M。观察溶液颜色为紫红色。(4) 10000卬m离心10分钟，去上清；加入PBS含0.3MNaCl， 0.1%SDS， 重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5mlPBS含5X BS夂0.3 MNaCl， 0.1% SDS重悬，37°C，摇2h，封闭未结合位点。10000rpm离心IO分钟，去封闭液， 加l mlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS ， RNA酶抑制剂100U)重悬，4。C保 存。(5) 260 nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。(6) 260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根据560nm OD值估算纳米金的数量。(7)取上面制备好的纳米结合探针lOul，倍比稀释，取lul点在醋酸纤维薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封闭2h;加 HRP标记的链亲和素，37°C 30分钟，用PBS含0.3 MNaCl， 0.1XSDS洗膜四 次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。3. Bio-DNA TMA法检测HCV RNA:(1) ，取EDTA抗凝血桨500W，用QIAamp RNA Blood MiniKit (Qiagen)试剂 盒提取RNA，用50W无RNA酶纯水洗脱。(2) ， 50W样本RNA， 50W阳性对照HCV RNA， 50W PBS阴性对照，分别加入 10W 5X杂交液(含0.5XSDS， 5g聚蔗糖，5g聚乙烯吡咯垸酮，5g牛血清白 蛋白V， RNA酶抑制剂500U ，1.5M NaCl,O. 5M Tris-Hcl, pH 8.0) 65°C， 15min，取出马上加入5tmi磁珠捕获探针和50W纳米结合探针，60。Cl0min， 然后55"C旋转杂交2小时。(3) 磁分离器吸附磁珠30秒，弃去上清液，加入500f4PBS (0.3MNaCl， 0.1 XSDS,RNA酶抑制剂100U)洗3次。(4) 磁珠重悬于50WPBS (0.3MNaCl， 0.1 %SDS , RNA酶抑制剂100U)， 依次加入50W链亲和素(终浓度为5Pg/ml， 50W生物素标记的含T7启动子的 DNA序列(终浓度为250ng/ml) 37。C，摇动30min。 PBS (0.3MNaCl， 0.1% SDS， RNA酶抑制剂IOOU)，同上洗4次。(5) 磁珠重悬于50WT7RNA转录液(1XT7RNA转录缓冲液，60UT7RNA聚 合酶，RNA酶抑制剂200U ， 1.25MM NTP)， 37'C，摇动3小时。(6) 加入2(mi RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释 200倍为工作液)，激发光为485nm，发射光535nm测定荧光。4. 标准曲线的制作(1)把WHOHCV标准品用PBS (0.3MNaCl， 0.1%SDS)倍比稀释，使终浓 度依次为10Vml ， 10Vml ,102/ml, 103/ml, 104/ml ， 105/ml, 106/ml, 107/ml， 按上面步骤操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。(2) 取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。(3) 测定样品结果从标准曲线计算得去。实施例3:微量蛋白的检测1. 引物设计以检测血清Her-2蛋白为例。(1) 条码DNA: 5 — SH-(C6) -AAA AAA AAA A-PEG- GGA TTC TCA ACT CGTAGCT-Biotin-3.2. 抗Her-2单抗(克隆号6E2， Oncogene Sciences)包被ELISA板(1) Her-2单抗用pH9.0的碳酸盐缓冲液稀释成l^g/ml, 100W/孔，4。C过夜。(2) 去包被液，加5X奶粉200W/孔，4-C过夜，封板。(3) 去封闭液，用PBST缓冲液洗3次，放4r备用。 2.纳米结合抗体的制备(1) 条码DNA引物用纯水溶解，混匀。(2) 取5ml直径100nm的纳米金溶液，加入50D的条码DNA和500ng/ml Her-2单抗(克隆号A18， Oncogene Sciences)混和，充分摇匀。室温旋转摇床 摇过夜。(3) 加入5MNaCl 50ul, 10%SDS 50ul，混匀，室温旋转摇床摇2h。加5MNaCl 50ul混匀，室温旋转摇床摇2h;重复四次。使NaCl终浓度为0.3 M。观察溶液 颜色为紫红色。(4) 10000rpm离心10分钟，去上清；加入PBS含0.3 MNaCl， 0.1%SDS， 重悬。同样离心洗涤3次，最后加入用5mlPBS含5X BSA^ 0.3 MNaCl， 0.1% SDS重悬，37°C，摇2h，封闭未结合位点。10000rpm离心IO分钟，去封闭液， 力口lmlPBS (含0.3MNaCl， 0.1%SDS)重悬，4。C保存。(5) 260 nm测定OD值，验证条码DNA和捕获探针2是否标记上。280 nm 测定OD值，验证Her-2单抗是否标记上。(6) 260nm-800nm光谱扫描，在560nm处有一高吸收峰(100nm金特征吸收 峰)，根据560mnOD值估算纳米金的数量。(7) 取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取lul点在醋酸纤维薄 膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl， 0.1%SDS) 37。C封闭2h;加 HRP标记的链亲和素，37°C 30分钟，用PBS含0.3 M NaCl， 0.1^SDS洗膜四 次，加DAB显色。验证条码DNA标记效率。(8) 取上面制备好的纳米结合探针10ul，倍比稀释，取lul点在醋酸纤维薄膜上，37。C烤干，用5%的奶粉(含0.3 M NaCl, 0.1%SDS) 37。C封闭2h;加 HRP标记的抗鼠IgG， 37°C 30分钟，用PBS含0.3 M NaCl， 0.1 %SDS洗膜四 次，加DAB显色。验证Her-2单抗标记效率。3. Bio-DNA TMA法检测血清Her-2蛋白(1)， 100W血清，100W阳性对照Her-2蛋白，鮮l PBS阴性对照，分别力口 入包被好的ELISA板中，再加入100W纳米结合抗体，37t:摇床摇120min。(3) 弃去孔中液体，加入200WPBST (0.3MNaCl， 0.1%SDS， 0.1%Tween 20)洗4次。(4) 依次加入50W链亲和素(终浓度为5Pg/ni1， 50W生物素标记的含T7启 动子的DNA序列(终浓度为250ng/ml) 37°C，摇动30min。 PBST同上洗4次。(5) 加入50M1T7RNA转录液(1 X T7RNA转录缓冲液，60U T7RNA聚合酶， RNA酶抑制剂200U ， 1.25MM NTP), 37°C， 3小时。(6) 加入20W RiboGreen工作液(Invitrogen试剂盒带的TE缓冲液稀释 200倍为工作液)，激发光为485nm，发射光535nm测定荧光。4. 标准曲线的制作(1)把Her-2蛋白(Oncogene Sciences)倍比稀释，使终浓度依次为lpg/ml ， 10pg/ml,100pg/ml, lng/ml， 10ng/ml, 100ng/ml, 1000ng/ml。按上面步骤 操做，每一浓度做三个平行孔，测定荧光。(2) 取三个孔的荧光均值的对数与浓度对数做标准曲线。(3) 测定样品结果从标准曲线计算得去。
权利要求
1. 一种检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，按照以下步骤进行(1)制备磁珠捕获探针1以及结合有生物素标记的条码DNA的纳米结合探针2；(2)利用磁珠捕获探针上的捕获探针1，以及纳米结合探针上捕获探针2在液相中夹心ELISA检测靶分子；(3)利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；(4)加入链亲和素以及生物素标记的含RNA启动子的DNA序列，使条码DNA与生物素标记的含RNA启动子的DNA序列结合；(5)利用磁铁吸附磁珠，洗涤去除杂质；(6)对含RNA启动子的DNA序列进行转录后检测转录的RNA产物。
2. 按权利要求1所述的检测DNA， RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于 所述的纳米结合探针2为纳米金探针。
3. 按权利要求1或2所述的检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于 用作检测DNA时，磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶DNA 3末端或者5末 端互补，纳米结合探针捕获探针2则相应地与检测DNA的另外一个末端互 补。
4. 按权利要求1或2所述的检测DNA，RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于 用作检测RNA时，磁珠捕获探针上的捕获探针1与检测靶RNA 3末端或5末端 互补，纳米结合探针上捕获探针2则相应地与检测靶RNA的另外一个末端互 补。
5. 按权利要求1或2所述的检测DNA， RNA或超微量蛋白质的方法，其特征在于 用作检测蛋白质时，磁珠捕获探针上的捕获探针l以及纳米结合探针上捕获探 针2分别是针对检测靶蛋白的两株结合位点不同的单抗。
全文摘要
本发明公开了一种检测DNA，RNA和超微量蛋白质的方法，首先利用磁珠捕获探针上的捕获探针1(可为核酸或抗体)与纳米结合探针上捕获探针2(可为核酸或抗体)在液相中夹心ELISA检测靶分子，再利用磁铁吸附磁珠，很容易去除未结合的探针和其他杂质。由于纳米结合探针结合成千上万的生物素标记的条码DNA，可把检测靶分子成千上万倍放大；每分子条码DNA利用链亲和素—生物素系统可结合3分子含T<sub>7</sub>RNA启动子的DNA序列，从而可用TMA技术定量检测条码DNA，而条码DNA与靶分子含量成正比。对特定的含T<sub>7</sub>RNA启动子的DNA序列，TMA技术可在3小时内按一分子DNA模板转录出约1万分子RNA，相应地把条码DNA扩增一万倍。
文档编号G01N33/577GK101250585SQ200810027100
公开日2008年8月27日 申请日期2008年3月28日 优先权日2008年3月28日
发明者刘万里, 宋立兵, 曾木圣 申请人:广州市搏克生物技术有限公司