专利名称：：一种hpce指纹图谱鉴别葛根药材的方法
技术领域：
：本发明涉及中药材的鉴别方法，具体是采用HPCE法建立葛根(/^mW。/ofetofWmd.)Ohwi)指纹图谱的鉴别方法。技术背景葛根是豆科植物野葛(户wera^fo6atofWUld.)Ohwi)的干燥根径，始载于我国汉代《神农本草经》，列为中品，是常用的传统中药，具解肌退热，生津，透疹，升阳止泻之功效，临床常用于外感发热头痛、项背强痛，口渴，消渴，麻疹不透，热痢>泄泻，以及高血压颈项强痛等症状。葛根在我国分布较广泛，资源很丰富。2005年以前，我国药典收载的葛根为豆科植物野葛Pue度ialobata(Wild.)Ohwi或甘葛藤P匿ariathomsonillBenth.的干燥根。2005年版中国药典开始将野葛和粉葛分开,并规定含量，野葛中葛根素含量不得少于2.4%;粉葛中葛根素的含量不得少于0.30%。药典中鉴定葛根的方法是外形观察和采用薄层色谱法定性检测药材中的葛根素，用高效液相色谱法检测药材中葛根素的含量。中药色谱指纹图谱方法是近年来研究较多的一种中药鉴别和质量控制方法，该方法在实现物质群体整体控制方面具有明显的优势，并得到了国际社会的认可。英国草药典、印度草药典、德国药用植物学会、加拿大药用及芳香植物学会均接受并收集了指纹图谱的质控方法。用"中药色谱指纹图谱方法"鉴别中药的真伪，控制其质量更能客观地反映中药物质基础的整体观，是更为科学、有效的质控方法。蔡光先等报道了5批不同地区的商品葛根30M乙醇超声提取物的HPLC指纹图谱，色谱条件是色谱柱为大连依利特公司HypersilBDSC18柱(4.6咖X200mm，5ym);流动相A(乙腈)％B(水)％:0-7min'2-98%;7-60min，26-74%。柱温为25。C;流速为l.0mLmin-1;检测被长为250nm，得到的指纹图谱共有峰共ll个。该方法用于鉴别葛根虽然具有供试品制备简单、精密度和重复性好等优点，但存在分析时间长、流动相有机溶剂用量比例大、出峰信息量少等不足(蔡光先，李顺祥，蒋炜.葛根超微饮片的HPLC指纹图谱研究，中南药学，2005:3(2):67-70.)。陈斌等等报道了10批不同地区的葛根30%乙醇热回流提取物的HPLC指纹图谱，色谱条件色谱柱为AgilentZORBAX80AExtend-C18分析柱(250画X46國，5um):流动相为759&水溶液与25%甲醇洗脱；流速l.Oralmin-1;柱温25。C;检测波长250nm;参比波长360nra;分析时间30min;供试品及参照物进样量各20y1，得到6个共有峰。该方法用于鉴别葛根虽然具有分析时间短、精密度和重复性好等优点，但存在流动相有机溶剂用量比例大、出峰信息量非常少等不足(陈斌，刘训红，蔡宝昌.葛根高效液相色谱指纹图谱的研究.时珍国医国药，2005，16(5):384-385)。陈士林等采用HPLC法研究报道了13批不同地区(IO批为安徽霍山葛根基地产品)的葛根30%乙醇热回流提取物的指纹图谱，色谱条件色谱柱为ZorbaxXDB-C18(4.6ramX250mra，5um);流动相为甲醇-水，梯度洗脱O-lOmin甲醇由25。/。升为30呢，20-50min甲醇由30呢升为80%，50-60min甲醇由8(W升为10(W;流速为O.5mL/min;检测波长为250咖;进样量为20yL，得到15个共有峰。该方法用于鉴别葛根虽然具有出峰信息量多、精密度和重复性好等优点，但存在流动相有机溶剂用量比例大、分析时间长等不足(陈士林，陈四保，杨大坚等.葛根高效液相指纹图谱的研究.中草药，2003,34(7):661-663)。
发明内容本发明的目的是提供一种鉴别葛根(A^ran'fl/o6atofWilld.)Ohwi)药材的方法。本发祖实现上述目的的技术方案是一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法，该方法由以下步骤组成取过3号筛的待检药材粉末，加入400-600倍30%乙醇，称重，8(TC超声30min，放冷后再称重，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45pm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液，按以下步骤进行高效毛细管电泳分析在压力为137.9kpa的条件下5秒钟时间内完成进样；接着在温度为2(TC的条件下于由体积比为5:1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，并以波长为240nra的紫外光检测分离物，得到所测药材的HPCE指纹图谱，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv;当所得到的指纹图谱具有以下特征峰时，即被检药材为葛根药材峰l:迁移时间为9.84min±0.22min，相对峰面积为3.59%±0.80%;峰2:迁移时间为10,12min±0.28niin，相对峰面积为0.47%±0.14%;峰3:迁移时间为10.26min±0.29min，相对峰面积为4.32%±1.24%;峰4:迁移时间为10.43rain士0.31min，相对峰面积为0.51%±0.13%;峰5:迁移时间为13.04min土0.39min，相对峰面积为2.16%±0.62%;峰6:迁移时间为13.25min士0.43rain，相对峰面积为7.01%±1.78%;峰7:迁移时间为13.73min，相对峰面积为O.77%±0.23;峰8:迁移时间为14.22min土0.51min，相对峰面积为2.63%±0.58%;峰9:迁移时间为14.39min士0.55min,相对峰面积为2.47%±0.66%;峰10:迁移时间14.94min士0.59min;相对峰面积为55.88%±14.58%:峰11:迁移时间为15.07min±0.62min，相对峰面积为3.00%±0.77%;峰12:迁移时间为15.75min±0.66min，相对峰面积为3.59%±0.73%;峰13:迁移时间为17.93min土0.79min，相对峰面积为2.73%±0.62%;峰14:迁移时间为18.84min±0.86min，相对峰面积为5.8%±1.04%;峰15:迁移时间为19.04min±0.91min，相对峰面积为3.63%±0.74%;峰16:迁移时间为21.69min土1.06min，相对峰面积为1.45%±0.42%，其中峰10和峰13分别为葛根素和大豆苷元的特征峰。本发明方法所述的指纹图谱中的16个特征峰是将11批分别来自山东、河南、安徽(2批)、吉林、湖北、湖南、广东、广西、江西、四川各个产区的葛根按照相同条件提取和高效毛细管电泳分离所获得的指纹图谱中共有的特征峰，能较全面反映葛根的成分组成特点，可用于鉴别葛根。本发明人还发现在所述的指纹图谱中，葛根的重要的有效成分葛根素和大豆苷元分别占总峰面积的55.88%±14.58%和2.73%±0.62%，因此，本领域的技术人员可以根据这一特征利用本发明方法检测葛根的品质。本发明方法所建立的葛根指纹图谱峰分离良好，易于辨认，尤其主峰葛根素与前后峰分离良好，有利于指标成分的定量分析。此外，本发明方法还具有样品制备方法简便、易于掌握；所需分析时间短，出峰信息量多；有机溶剂的用量少，经济环保等优点。图1是葛根素对照品的高效毛细管电泳图谱。图2是大豆苷元对照品的高效毛细管电泳图谱。图3是葛根药材高效毛细管电泳标准指纹图谱。图4是11批来自全国不同产区葛根的高效毛细管电泳指纹图谱，其中Sl:山东崂山采集，S2:购于广州健禾饮片公司(标注产地河南)，S3-S4:购自安徽亳州，S5:购自吉林长春，S6:购自湖北武汉，S7:购自湖南长沙，S8:广东清远采集，S9:购自广西南宁，S10:购自江西南昌，Sll:购自四川成都。图5是山东崂山葛根样品高效毛细管电泳图谱，色谱峰所标数字依次代表峰号、迁移时间、峰面积百分率。图6广州市售粉葛样品高效毛细管电泳图谱，色谱峰所标数字依次代表峰号、迁移时间、峰面积百分率。图7山东葛根指纹图谱与广州市售粉葛图谱相似性比较，其中Sl表示山东葛根图谱；S2表示粉葛图谱。具体实施方式例l本发明方法标准图谱的构建及特征峰的确定1仪器、样品、试药1.1仪器P/ACEMDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCApTM(75iJmX60cm，有效长度50cm)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。1.2样品ll批葛根样品，分别来自山东、河南、安徽(2批)、吉林、湖北、湖南、广东、广西、江西、四川等药材公司。经鉴定均为葛根(尸"eraWa/o6aWfWilld.)Ohwi)的干燥根径。1.3试药葛根素、大豆苷元对照品(中国药品生物制品检定所提供)，色谱分析用试剂为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。2方法与结果2.1将葛根素和大豆苷元分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析将葛根素、大豆苷元溶于甲醇配制成一定浓度的对照品溶液，分别进行高效毛细管电泳采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5:1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20。C，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得葛根素和大豆苷元的标准电泳图，如图1和图2所示。2.2将全国各产地的葛根分别按下述方法制备供试品溶液并进行高效毛细管电泳分析将来自山东的葛根分别磨成粉，过3号筛，称取O.lg,置带塞锥形瓶中，精密加入30%乙醇印ral,称定重量，8(TC超声30min，放冷，再称重，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45pm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa,进样时间为5秒，接着在由体积比为5:1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为2(TC，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱；其余各产地的葛根同样按上述方法制备指纹图谱，所得图谱如图3所示a经过统计，11批葛根的共有峰为16个，迁移时间及峰面积百分率见表l，得标准指纹图谱，如图4所示，与葛根素和大豆苷元的标准指纹图谱比较，确定迁移时间为14.94min，RSD=3.97°/O017.93min，RSD^4.39X的特征峰分别是葛根素和大豆苷元，且经统计发现两者的峰面积均约占总峰面积的55.88%和2.73%。表l:葛根药材指纹图谱特征峰迁移时间及峰面积百分率(n=ll)峰<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2葛根的鉴定以及本发明方法的精密度、稳定性和重现性试验1仪器、样品、试药1.1仪器P/ACETMMDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCApm(75lJmX60cm，有效长度50cni)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。1.2样品产于山东崂山的葛根2方法2.1鉴别将葛根分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析称取待测药材粉末(过3号筛)0.8g，置带塞锥形瓶中，精密加入30M乙醇50ml，称定重量，8(TC超声30inin，放冷，再称重，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45pm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，进样时间为5秒，接着在由体积比为5:1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为2(TC，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱。该批葛根的指纹图谱如图5所示，具有迁移时间分别为9.69min，9.97min，10.11min,10.28min,12.89min,13.10min，13.58min，14.07min，14.24min，14.79min，14.92min，15.60min，17.78min，18.69min，18.89min，21.54min;峰面积百分率为3.36%，0.40%，4.32%，0.39%，2.24%，7.14%，0.97%，2.68%，2.61%，55.42%，3.25%，2.16%,3.43%,6.08%，3.85%，1.50%的特征峰，判断为葛根，判断结果与实际相符。2.2本发明方法的精密度、稳定性和重现性试验2.2.1本发明方法的精密度试验按2.1方法制备葛根供试品溶液，并按2.1电泳条件连续进样5次，将所得色谱图进行相似度比较，5次进样的相似度(中位数)结果表明相似度均在0.99上，说明精密度良好。2.2.2本发明方法的稳定性试验按2.1方法制备葛根供试品溶液，并按2.1电泳条件，分别在O、6、12、24、36h进样分析，将所得色谱图进行相似度(中位数)比较，结果表明相似度均在0.99以上，说明样品在试验时间内稳定性好。2.2.3本发明方法的重现性试验取同一批葛根6份，分别按2.1方法制备供试品溶液，并按2.1电泳条件，将所得色谱图进行相似度(中位数)比较，结果表明相似度均在0.99以上，说明本方法重现性好。例3对比例应用1仪器、样品、试药1.1仪器P/ACETMMDQ毛细管电泳系统(美国，Beckman)，二极管阵列检测器，毛细管为eCApTM(75pmX60cm,有效长度50cm)。采用国家药典委员会指定的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版》进行指纹图谱分析。1.2样品来自广州市售粉葛2.1鉴别将市售粉葛分别按下述方法进行高效毛细管电泳分析精密称取粉葛粗粉0.8g，置带塞锥形瓶中，精密加入30X乙醇50ml,称定重量,8(TC超声30min，放冷，再称重，用30%乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45pm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液进行高效毛细管电泳采用压力进样法进样，进样压力为137.9kpa，迸样时间为5秒，接着在由体积比为5:1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv，分离过程中控制温度为20'C，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，获得所测药材的指纹图谱，见图9。表2山东葛根HPCE指纹图谱与广州巿售粉葛图谱<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注Sl代表葛根指纹图谱，Sl(min)迁移时间Sl(%)峰面积百分率S2代表广州市售粉葛指纹图谱，S2(min)迁移时间S2(%)峰面积百分率从表2可以看出，广州市售粉葛与葛根只有8个共有峰，可见本发明葛根的HPCE指纹图谱是葛根特有的，本发明所述的方法可用于葛根的鉴定。权利要求1、一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法，该方法由以下步骤组成取过3号筛的待检药材粉末，加入400～600倍30％乙醇，称重，80℃超声30min，放冷后再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液，按以下步骤进行高效毛细管电泳在压力为137.9kpa的条件下5秒钟时间内完成进样；接着在温度为20℃的条件下于由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，得到所测药材的HPCE指纹图谱，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv；当所得到的HPCE指纹图谱具有以下特征峰时，即被检药材为葛根药材峰1迁移时间为9.84min±0.22min，相对峰面积为3.59％±0.80％；峰2迁移时间为10.12min±0.28min，相对峰面积为0.47％±0.14％；峰3迁移时间为10.26min±0.29min，相对峰面积为4.32％±1.24％；峰4迁移时间为10.43min±0.31min，相对峰面积为0.51％±0.13％；峰5迁移时间为13.04min±0.39min，相对峰面积为2.16％±0.62％；峰6迁移时间为13.25min±0.43min，相对峰面积为7.01％±1.78％；峰7迁移时间为13.73min，相对峰面积为0.77％±0.23；峰8迁移时间为14.22min±0.51min，相对峰面积为2.63％±0.58％；峰9迁移时间为14.39min±0.55min，相对峰面积为2.47％±0.66％；峰10迁移时间14.94min±0.59min，相对峰面积为55.88％±14.58％；峰11迁移时间为15.07min±0.62min，相对峰面积为3.00％±0.77％；峰12迁移时间为15.75min±0.66min，相对峰面积为3.59％±0.73％；峰13迁移时间为17.93min±0.79min，相对峰面积为2.73％±0.62％；峰14迁移时间为18.84min±0.86min，相对峰面积为5.8％±1.04％；峰15迁移时间为19.04min±0.91min，相对峰面积为3.63％±0.74％；峰16迁移时间为21.69min±1.06min，相对峰面积为1.45％±0.42％，其中峰10和峰13分别为葛根素和大豆苷元的特征峰。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的指纹图谱中迁移时间H.94min土0.59min，相对峰面积为55.88%±14.58%的峰为葛根素的特征峰，迁移时间为17.93min士0.79min，相对峰面积为2.73%±0.62%的峰为大豆苷元的特征峰。全文摘要本发明提供了一种HPCE指纹图谱鉴别葛根药材的方法，该方法为取过3号筛的待检药材粉末，加入400～600倍30％乙醇，称重，80℃超声30min，放冷后再称重，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，粗滤，滤液用0.45μm微孔滤膜过滤，取滤液作为进样液，按以下步骤进行高效毛细管电泳在压力为137.9kpa的条件下5秒钟时间内完成进样；接着在温度为20℃的条件下于由体积比为5∶1的40mmol/L硼砂与甲醇组成的电泳缓冲液中分离25min，并以波长为240nm的紫外光检测分离物，得到所测药材的HPCE指纹图谱，其中前5min的分离电压是25kv，后20min的分离电压是22kv；当所得到的指纹图谱具有如摘要附图所示的16个特征峰时，即被检药材为葛根药材。文档编号G01N30/86GK101241116SQ20081002677公开日2008年8月13日申请日期2008年3月13日优先权日2008年3月13日发明者孙学刚,罗庆群,魏凤环申请人:南方医科大学