一株贝莱斯芽孢杆菌Z002、获取方法及其应用与流程

一株贝莱斯芽孢杆菌z002、获取方法及其应用
技术领域
[0001]
本发明属于微生物应用技术领域，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌z002、获取方法及其应用，具体涉及一株能实现高效防治烘烤期霉变病的贝莱斯芽孢杆菌z002，及其获取方法和在烤房烟草霉变病防治中的应用。


背景技术：

[0002]
烘烤期烟草霉变病是由米根霉(rhizopus oryzae)侵染引起的真菌性病害，可以为害烟叶叶柄、叶肉组织，以叶基霉烂型为主，发病率达30％以上，损失在20％左右。因此，烟草霉变病对烟叶生产的危害十分严重。
[0003]
对烘烤期烟草霉变病的防治方法有化学药剂、烘烤设备改进和生物防治等。
[0004]
化学防治方法虽然防治效果较好，但因其存在农药残留和容易产生耐药性等问题，影响烟叶的安全性，其应用受到限制。
[0005]
烘烤设备改进主要是基于现有烤房通风排湿效果差而进行的改进或建立新型烤房，该措施成本较高，需要一定时间的推广示范带动。
[0006]
生物防治由于其防效高、专一性强、环境友好，以及不易产生抗药性等优点，因而受到青睐。
[0007]
目前，用于防治烘烤期霉变病的微生物报道较少，仅有胶质芽孢杆菌(bacillus mucilaginosus)(cn110384247a)、组合微生物菌剂(cn110250209a)作为生防产品防治烘烤期烟草霉变病的报道。


技术实现要素：

[0008]
本发明的第一目的在于提供一株能实现高效防治烘烤期霉变病的贝莱斯芽孢杆菌z002。本发明的第二目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌z002的获取方法。本发明的第三目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌z002在烘烤期烟草霉变病防治中的应用。本发明的第四目的在于提供所述贝莱斯芽孢杆菌z002在烟草青枯病、黑胫病、灰霉病、菌核病、靶斑病、根腐病、赤星病防治中的应用。
[0009]
本发明的第一目的是这样实现的：
[0010]
一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，命名为z002，经生物学特性检测和16s rdna序列分析鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的一个株系，是从烟株组织中分离得到，已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为cctcc no：m 2020567。
[0011]
本发明的第二目的是这样实现的：
[0012]
一种所述贝莱斯芽孢杆菌的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
[0013]
a、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管中，加入400～700μl无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯
度稀释研磨后的组织液至10-4
，每梯度各取100～300μl匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
[0014]
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
[0015]
分离培养基成分以g/l计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，ph 6.8～7.5；
[0016]
b、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
[0017]
培养条件为：26～30℃，时间48～60h；
[0018]
筛选培养基成分以g/l计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000ml，ph 6.8～7.4；
[0019]
c、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002；
[0020]
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
[0021]
纯化培养基成分以g/l计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，ph 7.0～7.5。
[0022]
本发明的第三目的是这样实现的：
[0023]
一种所述贝莱斯芽孢杆菌z002在烟草霉变病防治中的应用，包括发酵、接种及防治工序，具体包括：
[0024]
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
[0025]
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
[0026]
斜面培养基成分以g/l计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，ph 7.0～7.5；
[0027]
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
[0028]
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
[0029]
种子培养液成分以g/l计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，ph7.0～7.5；
[0030]
b、接种：在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂按照每杆烟50～200ml用喷雾器烟叶叶柄伤口处；
[0031]
c、调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤7～11d，即可实现烤房烟草霉变病的有效防控。
[0032]
本发明的第四目的是这样实现的：
[0033]
一种所述贝莱斯芽孢杆菌z002在烟草青枯病、黑胫病、灰霉病、菌核病、靶斑病、根腐病、赤星病中的应用，具体包括：
[0034]
筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌米根霉菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草青枯病菌、黑胫病菌、灰霉病菌、菌核病菌、靶斑病菌、根腐病菌、赤星病菌菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
[0035]
培养条件为：26～30℃，时间48～60h；
[0036]
筛选培养基成分以g/l计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000ml，ph 6.8～7.4。
[0037]
本发明的有益效果：
[0038]
本发明所述贝莱斯芽孢杆菌z002可应用于烘烤期烟草霉变病的防治，具有以下优点：
[0039]
1、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002是一种烘烤期烟草霉变病的高效生防菌，对烟叶调制过程中霉变病的相对防效在80％以上；
[0040]
2、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002能在含有0～85g/l nacl，ph 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，具有良好的抗逆性，能充分适应烟叶调制过程中的温、湿度环境变化和水、热交换特点，定殖效果好，活性高；
[0041]
3、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002大量存在于烟株组织与植烟土壤中，来源广泛，易于分离、培养；
[0042]
4、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002生产工艺简单，成本低廉，施用便利，且所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002处理的烟叶无农药残留，对人、畜无害，有利于该菌株的工业化生产和应用普及；
[0043]
5、本发明所述贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002具有广谱性杀菌作用，对包括烟草青枯病菌(ralstonia pseudosolanacearum)、烟草黑胫病菌(phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病菌(fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(alternaria alternata)均具有较强的抑菌能力，即对上述7种烟草病害具有是较好的生防潜力。
附图说明
[0044]
图1：实施例1的贝莱斯芽孢杆菌z002与米根霉对峙培养菌落形态对比图。
[0045]
图2：实施例2的贝莱斯芽孢杆菌z002培养24h及培养48h的菌落形态。
[0046]
图3：利用mega7软件构建的系统发育树。
具体实施方式
[0047]
下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
[0048]
一株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002，已在中国典型培养物保藏中心保藏，其保藏编号为cctcc no：m 2020567。
[0049]
所述菌株为革兰氏阳性，芽孢椭圆形中生或端生，不膨大，芽孢比菌体小，存在于菌体中，在培养基上菌落呈圆形，直径2～4mm，扁平，中间无凸起，乳白色，有光泽，边缘不整齐，为好氧菌。所述菌株可在含有0～85g/l nacl，ph 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃。
[0050]
所述菌株对烟草霉变病菌(rhizopus oryzae)、烟草青枯病菌(ralstonia pseudosolanacearum)、烟草黑胫病菌(phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病菌(fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(alternaria alternata)具有较强的抑制能力。
[0051]
所述菌株对烘烤期烟草霉变病的相对防效在80％以上。
[0052]
所述菌株的获取方法，包括分离、筛选及纯化工序，具体包括：
[0053]
a、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株组织0.4～0.6g，与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管中，加入400～700μl无菌水，用组织研磨器研磨2～4min，频率为20～40r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4
倍，每梯度各取100～300μl匀浆液涂分离培养基，每处理重复4次。25～30℃黑暗培养36～72h后根据菌落形态、颜色等不同挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化,挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
[0054]
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
[0055]
分离培养基成分以g/l计为：蛋白胨3.0～7.0，牛肉膏2.0～4.0，氯化钠6.0～10.0，琼脂15～18，ph 6.8～7.5；
[0056]
b、筛选：采用平板对峙法，用直径0.5～0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌菌丝块贴接于筛选培养基平皿中心，两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照。恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复；
[0057]
培养条件为：26～30℃，时间48～60h；
[0058]
筛选培养基成分以g/l计为：马铃薯180～220，葡萄糖18～25，琼脂15～18，加蒸馏水至1000ml，ph 6.8～7.4；
[0059]
c、纯化：将筛选出的菌株用纯化培养基平板进行划线纯化，获得长势旺盛的单菌落，即贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002；
[0060]
培养条件为：25～30℃，时间40～55h；
[0061]
纯化培养基成分以g/l计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，ph 7.0～7.5。
[0062]
步骤a所述的烟株组织为烟株的叶片或茎。
[0063]
步骤a所述的烟株组织优选为烤烟“红花大金元”的叶片和/或茎，其植烟土壤为烤烟“红花大金元”的植烟土壤。
[0064]
步骤a所述的分离优选将0.4g烟株组织，与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管中，加入600μl无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。获得组织匀浆。
[0065]
步骤a所述的室温指的是20～25℃。
[0066]
步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
[0067]
步骤b所述的烟草霉变病病原为米根霉(rhizopus oryzae)。
[0068]
步骤b所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
[0069]
步骤c所述的培养条件优选为28℃，时间48h。
[0070]
一种贝莱斯芽孢杆菌z002在烟草霉变病防治中的应用，包括发酵、接种及防治工序，具体包括：
[0071]
a、发酵：首先将贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002接种到斜面培养基上，得到发酵种子；
[0072]
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
[0073]
斜面培养基成分以g/l计为：蛋白胨8.0～12.0、牛肉浸膏2.0～4.0、氯化钠4.0～6.0、琼脂15.0～19.0，ph 7.0～7.5；
[0074]
然后将发酵种子接种到种子培养液中，接种量为3～5v/v％，摇瓶装液量为25～35v/v％，得到发酵菌剂；
[0075]
培养条件为：25～30℃，时间48～72h；
[0076]
种子培养液成分以g/l计为：胰蛋白胨8.0～12.0、酵母浸膏4.0～6.0、氯化钠4.0～6.0，ph 7.0～7.5；
[0077]
b、接种：在烟叶编制成杆前或编制后，将发酵菌剂稀释1～4倍，按照每杆烟50～200ml进行喷施；
[0078]
c、调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤7～11d，即可实现烟草霉变病的有效防控。
[0079]
步骤a所述的发酵，摇瓶转速为180～225r/min。
[0080]
步骤a所述的培养条件优选为28℃，时间24h。
[0081]
步骤a所述的发酵菌剂的有效活菌数为1
×
10
10
～1
×
10
12
cfu/ml。
[0082]
步骤b所述的接种也可以在编制过程中、装烟过程中或烘烤前进行。
[0083]
步骤b及步骤c所述的烟叶包括烤烟、雪茄烟、白肋烟或晒烟中的任一种。
[0084]
步骤b及步骤c所述的烟叶优选烤烟。
[0085]
步骤b所述的调制指的是由鲜烟叶到干烟叶的过程，具体为烤烟的烘烤过程、晾晒烟的晾晒及烟叶的调制后陈化过程。
[0086]
步骤c所述的调制，对于在编制过程中的烟叶，无需设定特殊调制条件，对于在装烟过程中或烘烤前接种的烟叶，需控制菌剂喷施量不宜超过150ml/杆，并按正常调制条件烘烤7～11d。
[0087]
步骤c所述的调制，喷施过发酵菌剂的烟叶保持7～11d的调制时间后，烟草霉变病相对防效在80％以上。
[0088]
下面结合具体的实施例对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明：
[0089]
实施例1
[0090]
——贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002的获取
[0091]
a、分离：取经检验表面灭菌彻底的烟株茎部组织0.4g，与灭菌钢珠一并放入2ml灭菌离心管中，加入600μl无菌水，用组织研磨器研磨3min，频率为30r/s。梯度稀释研磨后的组织液至10-4
，每梯度各取200μl匀浆液涂分离培养基(蛋白胨5.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠8.0g，琼脂15.0g，ph 7.0)，每处理重复4次。28℃黑暗培养48h后根据菌落形态、颜色等不同
挑取单菌落，重新于分离培养基上划线纯化，挑取划线培养的单菌落移入分离培养基试管斜面保存；
[0092]
b、筛选：采用平板对峙法，用直径0.8cm的打孔器将烟草霉变病菌菌丝块贴接于筛选培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000ml，ph 7.2)平皿中心，在距菌饼中心3.5cm的两侧对称划线接种内生细菌，以只接烟草霉变病菌米根霉菌丝块的处理为对照。28℃恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复。
[0093]
c、纯化：将筛选到的菌株用纯化培养基(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15g，ph 7.2)平板进行划线纯化，置于28℃培养48h，获得长势旺盛的单菌落。
[0094]
试验结果：结果从208株烟草内生细菌中筛选出一株对烟草霉变病具有良好抑菌能力的菌株，命名为z002。菌株z002与米根霉(rhizopus oryzae)对峙培养时，米根霉的气生菌丝体稀疏，仅在菌饼周围形成菌丝，而在对照平板中菌丝已布满培养皿；米根霉在平板内的生长也受到限制，菌株z002拮抗米根霉在培养基内的生长可形成的平均抑菌带为6.67mm(表1和图1)。菌株z002不仅抑制米根霉气生菌丝的生长，还抑制菌丝在培养基内的生长，说明菌株z002可能通过多种机制抑制米根霉。
[0095]
表1 z002菌株对烟草霉变病的拮抗作用试验结果
[0096][0097]
实施例2
[0098]
——贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002的鉴定与保藏
[0099]
(1)贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002的鉴定
[0100]
对上述选育的菌株z002，通过常规方法进行生物学分析与分子生物学方法鉴定。分子鉴定方法如下：细菌基因组dna的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。pcr扩增选用引物f27/r1492，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体peazy-t5 zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞dh5α，挑取菌落以m13f/m13r为引物进行菌落pcr鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。
[0101]
试验结果记录如下：
[0102]
1、培养特征：该菌株于28℃在na平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，扁平中心无凸起，边缘不整齐，表面干燥，褶皱不明显(见图2)；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。上述形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断z002菌株为芽孢杆菌。
[0103]
2、形态特征：该菌株于28℃培养，在显微镜下，芽孢中生或端生，椭圆形，不膨大，芽孢比菌体小。抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。菌体平均大小为0.50～0.70
μm
×
2.1～2.9μm，革兰氏染色为阳性。
[0104]
3、稳定性特征：该菌株可在含有0～85g/l nacl，ph 3.0～10.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，最适宜生长温度为28～35℃，最适宜ph值为7.0～7.2。
[0105]
4、16s rdna序列分析：将该菌株的16s rdna序列与ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)收录的序列比对，其与芽孢杆菌属的16s rdna序列同源性达到，其与标准菌株bacillus velezensis cr-502序列同源性为99.71％，与bacillus nematocida模式菌株b-16序列同源性为99.51％，与bacillus subtilis模式菌株ncib 3610、bacillus siamensis模式菌株kctc 13613序列同源性为99.52％，与bacillus amyloliquefaciens模式菌株dsm 7序列同源性为99.39％。运用ncbi在线分析工具blastn比对rrna/its数据库，发现z002菌株16s rdna序列与bacillus velezensis菌株fzb42序列同源性最高为99.60％。利用mega7软件构建系统发育树，结果(见图3)z002菌株与贝莱斯芽孢杆菌fzb42聚为一支，说明z002为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，并且是一个新株系。
[0106]
该菌株通过序列比对和生物学特性将z002菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。
[0107]
本发明所述的z002菌株其16s rdna序列见序列表。
[0108]
(2)贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002的保藏
[0109]
通过上述鉴定结果，确认菌株z002为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的一个株系，命名为z002。已于2020年10月5日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，中国典型培养物保藏中心，邮编：430072)，其保藏编号为cctcc no：m 2020567。贝莱斯芽孢杆菌z002的16s rdna序列提交至genbank，序列登录号为mw064126。
[0110]
实施例3
[0111]
——贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002对烘烤期烟草霉变病的防治试验试验在云南省大理州下关市凤仪镇进行，烟草品种为“红花大金元”，烟叶为中部叶片。
[0112]
试验方法：
[0113]
a、发酵：从-80℃超低温冰箱活化菌株z002于斜面培养基(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，ph 7.0)，置于28℃恒温培养箱培养48h；挑取一环菌接种于含有10ml种子培养液(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，ph 7.0)的50ml离心管内，置于28℃恒温培养箱培养24h；再将种子液转接至含有1000ml发酵培养基中(蛋白胨10.0g、牛肉浸膏3.0g、氯化钠5.0g、琼脂15.0g，ph 7.0)，置于28℃恒温培养箱培养72h，得到发酵菌剂；
[0114]
b、接种：试验在大理州下关市凤仪镇进行，在烟叶编制成杆编制后，将发酵菌剂按照每杆烟200ml，用喷雾器喷施于叶柄的伤口处，并以发酵培养基喷施叶柄的处理为对照，每处理10杆烟，每处理重复3次；
[0115]
c、调制：喷施过发酵菌剂的烟叶按正常调制程序烘烤9d，调制完毕后调查各处理的发病等级，并计算病情指数和相对防效。烟叶发病程度按病害等级划分为0、1、3、5、7和9级(表2)，病情指数＝100
×
∑(各级病株数
×
各级代表值)/(调查总株数
×
最高级代表值)，生防菌相对防效＝100
×
(对照组病情指数-处理组病情指数)/(对照组病情指数)。
[0116]
表2烟叶霉烂病病情等级划分
[0117]
病情等级霉变发生情况0正常烟叶1烟柄发霉小于1cm，叶片不发病3烟柄发霉大于1cm，叶片不发病5烟柄发霉，且叶片发霉面积达1％～25％以上7烟柄发霉，且叶片发霉面积达26％～50％以上9烟柄发霉，且叶片发霉面积达50％以上
[0118]
试验结果：由表3数据可知，菌株z002对烘烤期烟草霉变病的防治效果较好。经烟叶编制成杆后喷施z002发酵液的处理，烘烤后调查病情指数为7.40；而喷施发酵液培养基的处理病情指数为62.96。结果表明，经z002菌剂发酵液处理烟叶的叶柄，可有效防治烟草霉变病的发生，相对防效达88.23％。
[0119]
表3菌株z002对烟草霉变病防效的对比试验结果
[0120]
处理病情指数相对防效(％)z002液体制剂7.40b88.23％ck62.96a-[0121]
实施例4
[0122]
——贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002对烘烤期烟草霉变病的防治试验
[0123]
实施例4除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例3相同。
[0124]
1、试验在云南省大理州南涧县南涧镇进行，烟叶为烤烟品种“红花大金元”的上部叶片。
[0125]
2、试验在烟叶编制成杆后，采用菌株z002发酵液2倍稀释液，用喷雾器按75ml/杆喷施于叶柄处。
[0126]
3、试验中菌株z002发酵液共处理80杆烟；对照不经任何处理以自然发病。
[0127]
表4菌株z002对烟草霉变病防效的对比试验结果
[0128][0129]
试验结果：试验共处理80杆烟，其中57杆未发病，23杆病害等级为1级，发病率为28.75％，病情指数为3.19；对照共81杆，其中11杆未发病，40杆为1级，剩余30杆为3级，发病率为86.42，病情指数为17.83。上述结果表明z002发酵液2倍稀释液对烘烤期烟草霉变病具有较好的防治效果，相对防效为82.08％。贝莱斯芽孢杆菌z002对烘烤期烟草霉变病防治的效果较好，具有较好的开发潜力。
[0130]
实施例5
[0131]
——贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)z002对7种烟草病原菌的抑制试验
[0132]
实施例5除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实施例1相同。
[0133]
1、试验中取烟草青枯病菌(ralstonia pseudosolanacearum)液稀释至10-4
，取200μl涂布于筛选培养基平板，置于超净台晾干，用无菌牙签挑取待测生防细菌的单菌落接种于筛选培养基表面距培养皿中心2.50cm的距离处，每皿对称接种4点，晾干后正置于28℃培养箱培养48h。
[0134]
2、试验中分别以烟草黑胫病菌、烟草灰霉病菌、烟草菌核病菌、烟草靶斑病菌、烟草根腐病菌、烟草赤星病菌为指示菌，检测z002菌株对上述病原菌的抑菌能力。
[0135]
试验结果：从表5可见，贝莱斯芽孢杆菌z002对供试的7种重要的烟草病害病原菌均具有较强的抑菌作用，对烟草赤星病菌、菌核病菌的抑菌作用超强。说明z002菌株对烟草青枯病菌(ralstonia pseudosolanacearum)、烟草黑胫病菌(phylophthora nicotianae)、烟草灰霉病菌(botrytis cinerea)、烟草菌核病菌(sclerotinia sclerotiorum)、烟草靶斑病菌(thanatephorus cucumeris)、烟草根腐病菌(fusarium oxysporum)、烟草赤星病菌(alternaria alternata)均有较强的抑制能力，即对上述7种烟草病害具有较好的生防潜力。
[0136]
表5贝莱斯芽孢杆菌z002对7种烟草病原菌的抑制能力
[0137]