赤潮异弯藻的无菌处理方法与流程

[0001]
本发明涉及海洋微藻技术领域，具体涉及一种赤潮异弯藻的无菌处理方法。


背景技术：

[0002]
在海洋微藻的相关研究中，尤其要求实验相关藻株必须是无菌的藻株。细菌与微藻可能存在共生关系，在微藻的异养培养基中，细菌会快速生长并与微藻竞争培养基中的营养成分进而限制微藻的生长。微藻培养体系的无菌化状态是研究微藻对有机物的利用的必要前提，因为细菌分解的有机物可能会被藻利用，会使研究结果产生较大误差。所以在微藻培养体系的相对无菌化处理成为了微藻相关研究的关键步骤和基础。为了有效开展赤潮异弯藻的生物学研究，避免培养体系中细菌对实验结果的干扰，获得无菌藻株是一切研究顺利开展的前提。
[0003]
微藻无菌化实验中的除菌方法主要分为两类：物理方法和化学方法。物理方法主要包括涂布划线法、离心洗涤法、稀释滤过法、辐照法、毛细吸管法。化学方法主要包括抗生素法、化学消毒法。其中物理方法成本较高且只能用于初级阶段的应急处理，辐照法可能会同时杀灭微生物和藻类细胞。
[0004]
抗生素是微生物的代谢产物或合成的类似物，能抑制其他微生物的生长和存活，而对自身不会产生严重的影响。抗生素的主要作用是抑制细菌的生长，理想的微藻无菌化处理抗生素应该是抑菌作用强而对藻的影响较小的抗生素。不同类型抗生素对微藻的影响各异，其作为藻类遗传转化中的选择标记已被多次报道。青霉素、硫酸庆大霉素、氯霉素、链霉素、氨苄青霉素等都对微藻生长影响的研究也均有报道。链霉素属氨基糖苷类广谱抗生素，可抑制细菌蛋白质的生物合成，对静止期细菌的杀灭作用较强。在本实验中，链霉素和卡那霉素对赤潮异弯藻的生长有着明显的抑制作用。氨苄青霉素属β-内酰胺类抗生素，不同微藻对其敏感性存在差异，在本实验中，氨苄青霉素对赤潮异弯藻的生长无显著影响，同时对赤潮异弯藻培养液的除菌作用较好，所以我们选择氨苄青霉作为该藻的除菌抗生素。总体来说，使用氨苄青霉素能维持藻的生长状态，有效的抑制微藻培养液中细菌的生长，保持藻的活力，有利于开展后续相关，获得较为可靠的实验结果，为研究其赤潮形成机制奠定基础。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，采用氨苄青霉素对赤潮异弯藻进行无菌处理，可有效地排除微藻培养液内的细菌，使用氨苄青霉素能维持藻的生长状态，有效的抑制微藻培养液中细菌的生长，保持藻的活力，有利于开展后续相关，获得较为可靠的实验结果，为研究其赤潮形成机制奠定基础。。
[0006]
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：
[0007]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，包括以下步骤：
[0008]
(1)称取氨苄青霉素，添加无菌水混匀溶解，得氨苄青霉素溶液；将所得氨苄青霉
素溶液使用过滤膜进行过滤；
[0009]
(2)制备待除菌的赤潮异弯藻培养液；
[0010]
(3)将经过过滤后的氨苄青霉素溶液加入至待除菌的赤潮异弯藻培养液中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为200-800μg/ml，然后进行无菌化培养；
[0011]
(4)在无菌化培养过程中，定期进行赤潮异弯藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的氨苄青霉素溶液。
[0012]
优选地，步骤(1)中，通过0.22μm的过滤膜进行过滤，并分装于1.5ml的离心管中备用。
[0013]
优选地，步骤(1)中，氨苄青霉素溶液的母液浓度为200mg/ml。
[0014]
优选地，步骤(2)中，待除菌的赤潮异弯藻培养液的制备方法为：取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行藻种扩充培养，得到待除菌的赤潮异弯藻培养液。
[0015]
优选地，步骤(3)中，氨苄青霉素的终浓度为200μg/ml、400μg/ml、600μg/ml或800μg/ml。
[0016]
优选地，步骤(4)中，每7天进行一次藻培养液的扩培。
[0017]
优选地，步骤(4)中，取不再继续添加抗生素的赤潮异弯藻培养物培养7天，观察藻液是否浑浊，取0.2ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察是菌落的生长情况。
[0018]
本发明的有益效果是：
[0019]
在本发明中，赤潮异弯藻的无菌处理方法步骤简单，易于操作。其采用适宜的抗生素氨苄青霉素进行抗菌，且在无菌处理中，设置适宜的浓度以及定期的扩充培养，持续抗菌效果好，同时成本低，环保性高。本发明使用氨苄青霉素能维持藻的生长状态，有效的抑制微藻培养液中细菌的生长，保持藻的活力，有利于开展后续相关，获得较为可靠的实验结果，为研究其赤潮形成机制奠定基础。
[0020]
从经济节约和环保角度考虑，适合选用低终浓度的氨苄青霉素进行无菌处理，使藻培养物维持在一个相对无菌的状态，以满足基本实验要求。
附图说明
[0021]
图1为不同抗生素处理条件下赤潮异弯藻的细胞密度对比图。
[0022]
图2为添加抗生素氨苄青霉素1天后藻培养液的浑浊度图，其中左为对照组，右为氨苄青霉素(amp)处理组。
[0023]
图3为添加抗生素氨苄青霉素11天后藻培养液的生长状态，其中左为对照组，右为氨苄青霉素(amp)处理组。
[0024]
图4为经抗生素氨苄青霉素处理后平板菌落生长图，其中左为对照组，右为氨苄青霉素(amp)处理组。
具体实施方式
[0025]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部
分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026]
下述实施例中，藻种来源：赤潮异弯藻heterosigma akashiwo ccma369来自厦门大学藻种库。
[0027]
实施例1：
[0028]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，包括以下步骤：
[0029]
(1)称取氨苄青霉素，添加无菌水混匀溶解，得氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液的母液浓度为200mg/ml；将所得氨苄青霉素溶液通过0.22μm的过滤膜进行过滤，并分装于1.5ml的离心管中备用。
[0030]
(2)制备待除菌的赤潮异弯藻培养液，具体包括以下步骤：取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行藻种扩培，得到待除菌的赤潮异弯藻培养液。
[0031]
(3)将过滤后的氨苄青霉素溶液加入待除菌的赤潮异弯藻培养体系中，在无菌化的培养体系中，氨苄青霉素的终浓度为200μg/ml。
[0032]
(4)在无菌化培养过程中，每7天进行一次赤潮异弯藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的氨苄青霉素溶液。
[0033]
取不再继续添加抗生素的赤潮异弯藻培养物培养7天，观察藻液是否浑浊，取0.2ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察菌落的生长情况。
[0034]
实施例2：
[0035]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，包括以下步骤：
[0036]
(1)称取氨苄青霉素，添加无菌水混匀溶解，得氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液的母液浓度为200mg/ml；将所得氨苄青霉素溶液通过0.22μm的过滤膜进行过滤，并分装于1.5ml的离心管中备用。
[0037]
(2)制备待除菌的赤潮异弯藻培养液，具体包括以下步骤：取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行扩培，得到待除菌的赤潮异弯藻培养液。
[0038]
(3)将过滤后的氨苄青霉素溶液加入至待除菌的赤潮异弯藻培养液中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为400μg/ml，然后进行无菌化培养。
[0039]
(4)在无菌化培养过程中，每7天进行一次赤潮异弯藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的氨苄青霉素溶液。
[0040]
取不再继续添加抗生素的赤潮异弯藻培养物培养7天，观察藻液是否浑浊，取0.2ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察菌落的生长情况。
[0041]
实施例3：
[0042]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，包括以下步骤：
[0043]
(1)称取氨苄青霉素，添加无菌水混匀溶解，得氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液的母液的浓度为200mg/ml；将所得氨苄青霉素溶液通过0.22μm的过滤膜进行过滤，并分装于1.5ml的离心管中备用。
[0044]
(2)制备待除菌的赤潮异弯藻培养液，具体包括以下步骤：取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，
以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行扩培，得到待除菌的赤潮异弯藻培养液。
[0045]
(3)将经过过滤后的氨苄青霉素溶液加入至待除菌的赤潮异弯藻培养液中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为600μg/ml，然后进行无菌化培养。
[0046]
(4)在无菌化培养过程中，每7天进行一次赤潮异弯藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的氨苄青霉素溶液。
[0047]
取不再继续添加抗生素的赤潮异弯藻培养物培养7天，观察藻液是否浑浊，取0.2ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察菌落的生长情况。
[0048]
实施例4：
[0049]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，包括以下步骤：
[0050]
(1)称取氨苄青霉素，添加无菌水混匀溶解，得氨苄青霉素溶液，氨苄青霉素溶液的母液的浓度为200mg/ml；将所得氨苄青霉素溶液通过0.22μm的过滤膜进行过滤，并分装于1.5ml的离心管中备用。
[0051]
(2)制备待除菌的赤潮异弯藻培养液，具体包括以下步骤：取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度，以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行藻种扩培，得到待除菌的赤潮异弯藻培养液。
[0052]
(3)将过滤后的氨苄青霉素溶液加入至待除菌的赤潮异弯藻培养液中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为800μg/ml，然后进行无菌化培养。
[0053]
(4)在无菌化培养过程中，每7天进行一次赤潮异弯藻培养液的扩培，扩培时追加同等终浓度的氨苄青霉素溶液。
[0054]
取不再继续添加抗生素的赤潮异弯藻培养物培养7天，观察藻液是否浑浊，取0.2ml藻培养液进行2216e琼脂培养基平板涂板，观察菌落的生长情况。
[0055]
实施例5：
[0056]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，与实施例1不同的是，步骤(3)中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为400μg/ml。
[0057]
实施例6：
[0058]
一种赤潮异弯藻的无菌处理方法，与实施例2不同的是，步骤(3)中，在培养液中，氨苄青霉素的终浓度为600μg/ml。
[0059]
实验例：
[0060]
对比实验：
[0061]
(1)配制氨苄青霉素(amp)、卡那霉素(kana)、链霉素(str)，氨苄青霉素的母液浓度为200mg/ml，卡那霉素及链霉素的母液浓度为100mg/ml。称取2g氨苄青霉素，添加10ml无菌水混匀溶解，通过0.22μm的过滤膜进行过滤，分装于1.5ml的离心管中备用，卡那霉素及链霉素的配制方法参考氨苄青霉素的配制方法。
[0062]
(2)取赤潮异弯藻培养液原液，使用sedgewick-rafter counting cell计数板进行藻细胞计数，确定原液藻细胞浓度。以5000cells/ml的接种量为起始浓度进行扩培。
[0063]
设置两种处理方式：
①
3种抗生素单独添加至藻培养液中，分为amp(氨苄青霉素)处理组、kana(卡那霉素)处理组、str(链霉素)处理组；
②
3种抗生素混合添加至藻培养液中，为混合处理组。以未添加抗生素处理的藻培养液为对照组。每个处理组设置3个重复，以驯化的第一天记为第0天，共培养7天。每天使用sedgewick-rafter counting cell计数板
进行细胞计数，计算浓度。
[0064]
(3)在无菌化培养过程中，每7天进行一次藻培养液的扩培，追加同等终浓度的抗生素。
[0065]
培养至第3天时，取处理后的赤潮异弯藻培养液和未处理的赤潮异弯藻培养液各0.2ml涂布2216e琼脂培养基平板，28℃培养48h，观察有无细菌菌落的出现。
[0066]
(4)根据每种抗生素处理后的藻细胞的浓度及其生长状态，选择适宜的抗生素种类用于赤潮异弯藻培养液无菌化处理。
[0067]
经抗生素处理后的藻培养液进行培养时，观察藻培养液的清澈程度、计算藻细胞生长浓度，与未经抗生素处理的藻细胞培养液形成对照。
[0068]
处理结果：
[0069]
1、三种抗生素处理3天后(指数生长期)的结果：
[0070]
本方法首先对三种抗生素处理赤潮异弯藻的方法进行重复，由图1可见4个处理组在和对照组进行浓度对比时，氨苄青霉素(amp)的处理对赤潮异弯藻细胞的生长无显著影响，卡那霉素(kana)、链霉素(str)及三种抗生素的混合处理都显著抑制了藻细胞的生长，不同抗生素处理条件下赤潮异弯藻的细胞密度对比如图1所示。
[0071]
由此可知，对于上述几种抗生素，最适于赤潮异弯藻进行相对无菌化处理的抗生素是氨苄青霉素(amp)。
[0072]
2、处理1天后藻培养液的浑浊度：
[0073]
与对照组相比，经氨苄青霉素(amp)处理1天后的赤潮异弯藻培养液的水体变得更加清澈，藻细胞的生长状态更好，如图2所示。
[0074]
3、培养11天后藻培养液的生长活力：
[0075]
如图3所示，经氨苄青霉素(amp)处理11天后的赤潮异弯藻培养体系和对照组相比，藻细胞仍然具有生长活力，而对照组的藻细胞已经退化沉淀，所以使用低浓度的氨苄青霉素(amp)进行赤潮异弯藻培养液无菌化处理不仅能够使藻培养液相对无菌化满足实验室的实验要求，还可以使藻细胞的具有更久的生长活力，对藻细胞的生长有促进作用。
[0076]
4、经抗生素处理后平板菌落：
[0077]
如图4所示，涂布处理组和对照组的赤潮异弯藻藻液于2216e琼脂培养基平板，可以发现氨苄青霉素(amp)处理组与对照组相比，在平板上几乎无杂菌生长，说明氨苄青霉素对赤潮异弯藻培养液中的杂菌有很好的抑制效果。
[0078]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。