细菌表面展示新系统、方法及应用的制作方法

专利名称：细菌表面展示新系统、方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，更具体地，涉及细菌表面展示技术领域，特别是指一种细菌表面展示新系统、方法及应用。

背景技术：
细胞表面定位分子在自然界中普遍存在，其表面定位过程由不同的细胞表面蛋白调控，并形成了很多生物学现象，比如细胞间的识别，信号转导，表面吸附，定殖，免疫反应等等。研究人员利用这些表面蛋白作为锚定元件将外源的多肽和蛋白与其融合，将其展示到细菌或病毒的表面从而达到一定的研究和应用目的。将外源蛋白定位表达在细菌表面后，可以直接用重组微生物进行后续实验操作，免去了目标蛋白的产物提取，纯化等一系列操作，而且如果展示的是抗原蛋白，由于抗原暴露在细胞表面，所以更有利于免疫系统的识别，而且外膜上的脂多糖等因子可以增强免疫反应，还可能作为锚定在细胞表面的目标蛋白的辅助因子而发挥作用(Lee J.S.，Shin K.S.，PanJ.G.，and Kim C.J.2000.Surface-displayed viral antigens on Salmonella carrier vaccine.Nat.Biotechnol.18645-648)。第一篇关于将外源多肽或蛋白利用遗传学方法融合到载体蛋白上，从而成功将它们展示的报道是在1986年分别由Freudl等(Freudl R.，MacIntyre S.，Degen M.，Henning U.，1986.Cell surface exposure of the outer membraneprotein OmpA of Escherichia coli K-12.J.Mol.Biol.188，491-494)以及Charbit等(Charbit A.，Boulain J.C.，Ryter A.，Hofnung M.1986.Probing the topology of abacterial membrane protein by genetic insertion of a foreign epitope；expression at the cellsurface.EMBO J.5，3029-3037)完成的。之后，许多不同的细菌表面展示系统被研究和开发出来，使得表面展示技术得到迅速的发展。
在所有被开发和研究的表面展示系统中，应用最广泛的一个系统是Lpp-OmpA系统，它是Georgiou和他的合作者在1992年构建的，他们利用Lpp-OmpA融合子成功的将β-内酰胺酶展示到大肠杆菌表面(Francisco J.A.，Earhart C.F.，Georgiou G.1992.Transport and anchoring of beta-lactamase to the external surface of Escherichia coli.Proc Natl Acad Sci USA 89(7)2713-7)，该系统由两部分组成1)E.coli主要外膜脂蛋白Lpp信号肽以及N端的九个氨基酸；2)E.coli外膜蛋白OmpA的46-159位氨基酸(包含跨膜区B3-B7)，外源蛋白与此系统的C末端融合。之后，研究者利用该系统展示了许多外源蛋白，使得该系统在生物催化，抗体制备，固定化细胞，生物传感器制备等方面都有应用。由于该系统避免了夹心法融合外源蛋白进行表面展示对外源蛋白的诸多限制，使得以E.coli为宿主用该系统进行展示的外源蛋白的大小达到了70kDa(Wan H.M.，Chang B.Y.，Lin S.C.2002.Anchorage of cyclodextringlucanotransferase on the outer membrane of Escherichia coli.Biotechnol Bioeng79(4)457-64)。利用该系统进行表面展示还有很多优点，比如，Lpp-OmpA系统具有高效的分泌信号肽和独特的跨膜结构，并提供了适宜的目标蛋白融合位点，而且其坚固的锚定结构能够准确的将外源蛋白定位在细胞表面。
鳗弧菌是一种重要的鱼类细菌性病原，可以在全世界范围内引起海水鱼和淡水鱼的流行性疾病，对鱼类养殖造成很大的损失。在鳗弧菌强毒株MVM425基础上通过DNA重组技术构建的鳗弧菌减毒株MVAV6203(保藏号为CCTCC NOM204066，保藏日为2004年9月15日，具体请参见中国专利ZL200410089496.0，申请日为2004年12月14日)，该减毒株毒力减弱了10000倍，对靶标和非靶标动物安全无毒，并对弧菌病具有较高的免疫保护力，是一株优秀的减毒活菌疫苗候选株。
因此，本发明人尝试构建并开发高效的细菌表面展示系统，旨在将来源于其他病原微生物的保护性抗原因子展示于该鳗弧菌减毒株表面，构建安全高效的鳗弧菌的多效价载体疫苗。


发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种细菌表面展示新系统、方法及应用，该细菌表面展示新系统能在细菌细胞表面成功展示目标蛋白，可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面，特别用于在鳗弧菌减毒株的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种细菌表面展示新系统，包括编码目标蛋白的基因序列，其特点是，还包括负责跨膜定位和转运的鳗弧菌核苷酸序列，所述基因序列位于所述鳗弧菌核苷酸序列的C端，所述鳗弧菌核苷酸序列编码的蛋白包括鳗弧菌外膜脂蛋白的信号肽和鳗弧菌外膜蛋白的跨膜锚定序列，所述跨膜锚定序列连接所述信号肽和所述目标蛋白。
所述鳗弧菌外膜脂蛋白为Wza蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述鳗弧菌核苷酸序列为编码所述Wza蛋白的信号肽及N端的前11个氨基酸的核苷酸序列和编码所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
在本发明的第二方面，提供了一种利用上述的细菌表面展示新系统在细菌的细胞表面展示目标蛋白的方法，其特点是，包括以下步骤 a.将所述细菌表面展示新系统构建入表达载体上，获得重组表达载体； b.将所述重组表达载体导入宿主菌中进行表达，获得融合蛋白，所述融合蛋白包括所述信号肽、所述跨膜锚定序列和所述目标蛋白。
所述鳗弧菌外膜脂蛋白为Wza蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
所述鳗弧菌核苷酸序列为编码所述Wza蛋白的信号肽及N端的前11个氨基酸的核苷酸序列和编码所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌为大肠杆菌或鳗弧菌。
所述表达载体是pUC18，所述宿主菌为大肠杆菌Top10或鳗弧菌减毒株MVAV6203，所述目的蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
在本发明的第三方面，提供了上述细菌表面展示新系统在活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面的应用。
所述活疫苗是鳗弧菌多效价载体疫苗。
本发明的有益效果如下 1)本发明属于基于鳗弧菌自身元件的表面展示系统，采用鳗弧菌外膜脂蛋白Wza蛋白和鳗弧菌外膜蛋白Omporf1，OmpU或Omp26La的融合子为载体，利用Wza的N-端信号肽，Omporf1，OmpU或Omp26La的跨膜锚定序列，成功将迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白展示到鳗弧菌减毒株MVAV6203的细胞表面，为进一步开发安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗打下了坚实的基础。
2)利用本发明的细菌表面展示新系统，通过Wza的N-端信号肽，Omporf1，OmpU或Omp26La的跨膜锚定序列，可以将异源蛋白(特别是具有免疫保护力的抗原蛋白)成功地展示到细胞表面，以增强和优化目标蛋白的生物学功能，增加所用宿主菌株的生物学功能，本发明在抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂的开发和全细胞生物催化方面等其他众多领域具有潜在的应用价值。



图1是本发明的质粒pUC18ΔE的载体图谱，是将pUC18载体多克隆位点中的EcoR I位点的第四位碱基通过无义点突变的方法从T变为C，从而使得EcoR I位点被去掉的产物。
图2是本发明的质粒porf1G和pUG的载体图谱，是将omporf1或ompU基因片段和目的基因gfp基因片段overlap后的片段选用Kpn I-BamH I酶切位点分别与图1所示的质粒pUC18ΔE连接得到的产物，其中在omporf1或ompU基因片段与gfp基因片段中间引入了Nsi I和EcoR I的位点。
图3是本发明的质粒pWorf1G和pWUG的载体图谱，是将wza基因片段选用Sac I-Kpn I酶切位点分别与图2所示的质粒porf1G或pUG连接得到的产物。
图4是本发明的质粒pW26La的载体图谱，是将wza基因片段和omp26La基因片段overlap后的片段选用Sac I-BamH I酶切位点与图1所示的质粒pUC18ΔE连接得到的产物，其中在omp26La基因片段下游引物中引入了Nsi I，EcoR I和BamH I的位点。
图5是本发明的质粒pWorf1B，pWUB和pW26LaB，是将目标基因eseB片段选用EcoR I-BamH I酶切位点分别与图3所示的质粒pWorf1G，pWUG或图4所示的质粒pW26La连接得到的产物。
图6是本发明的重组质粒pWorf1G和pWUG的构建流程图。
图7是本发明的重组质粒pW26LaB的构建流程图。
图8a是分别含有质粒pWorf1G和pWUG的重组菌Top10/pWorf1G和Top10/pWUG被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；E/Worf1G菌株Top10/pWorf1G；E/WUG菌株Top10/pWUG；E/GGFP胞内表达菌株Top10/pG。
图8b是分别含有质粒pWorf1G和pWUG的重组菌Top10/pWorf1G和Top10/pWUG被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；E/Worf1G菌株Top10/pWorf1G；E/WUG菌株Top10/pWUG；E/GGFP胞内表达菌株Top10/pG。
图9a是分别含有质粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重组菌Top10/pWorf1B、Top10/pWUB和Top10/pW26LaB被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；E/Worf1B菌株Top10/pWorf1B；E/WUB菌株Top10/pWUB；E/W26LaB菌株Top10/pW26LaB；E/BEseB胞内表达菌株Top10/pB。
图9b是分别含有质粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重组菌Top10/pWorf1B、Top10/pWUB和Top10/pW26LaB被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；E/Worf1B菌株Top10/pWorf1B；E/WUB菌株Top10/pWUB；E/W26LaB菌株Top10/pW26LaB；E/BEseB胞内表达菌株Top10/pB。
图10a是分别含有质粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重组菌AV/pWorf1B，AV/pWUB或AV/pW26LaB被展示到细胞表面的ELISA验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；A/Worf1B菌株AV/pWorf1B；A/WUB菌株AV/pWUB；A/W26LaB菌株AV/pW26LaB；A/BEseB胞内表达菌株AV/pB。
图10b是分别含有质粒pWorf1B、pWUB和pW26LaB的重组菌AV/pWorf1B，AV/pWUB或AV/pW26LaB被展示到细胞表面的Western-blot验证结果。OM外膜蛋白组分；CP胞内蛋白组分；A/Worf1B菌株AV/pWorf1B；A/WUB菌株AV/pWUB；A/W26LaB菌株AV/pW26LaB；A/BEseB胞内表达菌株AV/pB。

具体实施例方式 本发明首先构建细菌表面展示新系统首先获得所需的鳗弧菌核苷酸序列以及目标蛋白基因序列，然后依次连接，获得融合序列。
所述目标蛋白基因序列是指编码所希望在细胞表面展示的蛋白的基因序列。
上述的鳗弧菌核苷酸序列以及目标蛋白基因序列的获得可以采用PCR扩增、直接合成或其他合适方式获得，可以采用酶切连接、over-lap PCR扩增或其他合适方式将上述序列连接获得融合蛋白。
本发明的鳗弧菌外膜脂蛋白Wza蛋白、鳗弧菌外膜蛋白Omporf1、OmpU或Omp26La来源于鳗弧菌Vibrio anguillarum MVM425，该菌株具有以下特征 兼性厌氧，弧形状，极生单鞭毛，革兰氏阴性，最适生长温度25～28℃，0％NaCl和高于6～7％NaCl不生长，过氧化氢酶和氧化酶阳性，可利用柠檬酸盐，赖氨酸脱羧酶和鸟氨酸脱羧酶阴性，葡萄糖不产气，蔗糖发酵产酸，可产淀粉酶、脂酶和酪蛋白酶，脲酶阴性，青霉素抗性阳性，O1血清型。
本发明所用的Wza蛋白的分子量为42.8kDa，其信号肽和N端的前11个氨基酸如SEQ ID NO1所示，所用的Omporf1蛋白的分子量为7.4kDa，其6-50位氨基酸如SEQ IDNO2所示，OmpU蛋白的分子量为35.4kDa，其180-238位氨基酸如SEQ ID NO3所示，Omp26La蛋白的分子量为28.2kDa，其80-158位氨基酸如SEQ ID NO4所示。
利用上述的细菌表面展示新系统在宿主菌的细胞表面展示目标蛋白时，实现方式可以将其置于载体上，比如质粒pUC18；所用的宿主菌可以是大肠杆菌Escherichiacoli.(E.coli)、鳗弧菌或其它细菌宿主，比如大肠杆菌Top10或鳗弧菌减毒株MVAV6203。
本发明利用鳗弧菌外膜脂蛋白和鳗弧菌外膜蛋白构建的一系列表面展示新系统，能将目标蛋白成功展示到细菌表面，可增强和优化目标蛋白的生物学功能，或增加所用宿主菌株的生物学功能。本发明拓宽了鳗弧菌减毒株的应用范围，为构建减毒活疫苗提供了技术支持，也拓展了细菌表面系统的开发研究，为其在众多领域的广泛应用打下了基础。
为更好的理解本发明的内容，下面以鳗弧菌外膜脂蛋白Wza和鳗弧菌外膜蛋白Omporf1，OmpU或Omp26La为例，作进一步说明。
实施例1 细菌表面展示新系统的构建和目标蛋白表面展示的检测 1.细菌表面展示型系统的构建 1.1选取要构建展示系统的各基因片段并通过PCR克隆； 1.2回收各基因片段 从所要研究的对象上回收目标基因片段，采用TIANGEN公司的胶回收试剂盒进行回收。琼脂糖凝胶电泳结束后，EB染色，在长波紫外灯上迅速切下目的条带，装入Eppendorf管并称取重量，加入3倍体积的溶胶液PN，50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；将得到的溶液加入吸附柱中离心(12,000rpm离心30sec)，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中；向吸附柱中加入700μl漂洗液PW，12,000rpm离心30sec，倒掉废液，再用500μl漂洗液PW12,000rpm离心30sec，倒掉废液。将离心吸附柱放回收集管中，12,000rpm离心2min，尽量出去漂洗液，再将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干后，将其放到一个干净地离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加不少于30μl的洗脱缓冲液EB buffer，室温放置2min，12,000rpm离心1min收集含目的片段的DNA溶液，电泳检测回收DNA浓度。
1.3将pUC18载体多克隆位点中的EcoR I位点的第四位碱基通过无义点突变的方法从T变为C。扩增AflIII-Sac I位点中的pUC18片段，并在PCR扩增的下游引物中将EcoR I位点处的第四位碱基从T变为C，再将此片段通过AflIII-Sac I双酶切，将pUC18也通过这两个酶切，回收纯化大片段和含有AflIII-Sac I位点的目的片段，将目的片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到质粒载体pUC18ΔE。
1.4将omporf1或ompU基因和gfp基因同时正向与pUC18ΔE质粒连接。将ompof1和gfp基因或ompU和gfp基因通过overlap PCR的方法连接到一起，再将此连接片段通过Kpn I和BamH I酶切，将pUC18ΔE也通过这两个酶切，回收纯化大片段和含有Kpn I-BamH I位点的目的片段，将目的片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到质粒porf1G或pUG，将质粒porf1G和pUG分别用Sac I-Kpn I双酶切，将wza也经此两个酶切后，回收纯化得到含有Sac I-Kpn I位点的目的片段，将目的片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到大肠杆菌重组菌。
1.5将wza基因和omp26La基因同时正向与pUC18ΔE质粒连接。将wza和omp26La基因通过overlap PCR的方法连接到一起，再将此连接片段通过Sac I和BamH I酶切，将pUC18ΔE也通过这两个酶切，回收纯化大片段和含有Sac I-BamH I位点的目的片段，将目的片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到质粒pW26La，将质粒pW26La用EcoR I和BamH I酶切，将也用这两个酶切并回收纯化后的目的基因片段与切割后的质粒用T4 DNA连接酶16℃连接过夜，CaCl2转化法转化Top10，得到大肠杆菌重组菌。
1.6鳗弧菌重组菌的构建 接种鳗弧菌MVAV6203于5ml高盐LB培养液中过夜培养，再按1∶100转接100ml高盐LB培养液，于30℃以200rpm振荡培养至OD600的值为0.6时，离心收集菌体，将菌体在冰浴中放置一段时间，使细胞尽可能接近0℃，并用272mM的蔗糖缓冲液洗涤菌体三次，再用适量蔗糖缓冲液(1ml)悬浮菌体，使其菌液浓度为1×109/ml，得到电转化感受态细胞。取100μl感受态菌悬液于一个0.2cm的电转化杯(Bio-Rad公司产品)中，加入一定浓度的供体质粒DNA10μl，混匀后在冰浴上放置10min，用GenepulserTM型电脉冲仪(Bio-Rad公司产品)进行电脉冲。电脉冲参数选定为脉冲场强V＝2kV/cm，脉冲时间为3ms。电脉冲完毕后，加入800μl LB培养液于电转杯中，并转入1.5ml的离心管中在30℃200rpm恢复培养3h后，涂布于LB琼脂抗性平板，置于30℃培养。氨苄为200μg/ml。
2目标蛋白表面展示的检测 2.1将上述得到的鳗弧菌重组菌进行外膜蛋白组分的抽提 菌体蛋白由以下方法制备将含有质粒的大肠杆菌Top10菌株接种在含100μg/ml氨苄青霉素的LB低盐液体培养基，200rpm 37℃培养过夜，作为一级种，第二天将一级种按1∶100(v/v)接种于含有50ml工作浓度的LB低盐(Amp)培养基的250ml三角瓶中，作为二级种，37℃200rpm摇床培养至OD600＝0.6，加入诱导剂IPTG至终浓度0.5mmol/l，于37℃诱导表达12h，收获菌体。对含有质粒的鳗弧菌MVAV6203菌株接种在含200μg/ml氨苄青霉素的LB高盐液体培养基，200rpm 30℃培养过夜，作为一级种，第二天将一级种按1∶100(v/v)接种于含有50ml工作浓度的LB高盐(Amp)培养基的250ml三角瓶中，作为二级种，30℃200rpm摇床培养24h，收获菌体。对收获的菌体10000g离心2min，PBS洗涤三次以后，重悬在1.5ml Tris-HCl-NaCl(50mM，pH8.0，containing 0.3％NaCl)缓冲液中，将此重悬液在冰浴中超声破菌5min至菌体完全破碎，将得到的菌体裂解液在4℃10000g离心5min以去除未裂解的细胞和细胞碎片。为得到全部的膜蛋白，将上清液在4℃20000g超速离心1h(Sigma，Osterode，Germany)，则得到的上清为可溶的胞内蛋白成分，沉淀为全部的膜蛋白。为了得到外膜成分，将沉淀重悬在0.4ml HEPES(10mM，pH7.4)缓冲液中，再和0.4ml含有2％SLS的HEPES缓冲液(10mM，pH7.4)混匀以溶解内膜，将此混合液在室温下放置30min后再在4℃20000g超速离心1h，从而得到外膜蛋白颗粒，上清中为内膜蛋白，再重复一次外膜成分的提取步骤将得到较纯的外膜蛋白。
2.2 ELISA检测外膜、胞内蛋白组分 胞内蛋白组分和外膜蛋白组分都先稀释到相同的OD(OD280＝1.0)。然后在每个ELISA板孔中加入50μl各组分溶液，4℃包被过夜，次日，弃去孔内溶液，用PBST缓冲液洗3次，每孔加入200μl含有3％BSA的PBST于37℃封闭1h，后弃去孔内溶液，用PBST缓冲液洗3次，加入稀释到适当倍数的兔抗一抗，37℃孵育1.5h，用PBST缓冲液洗3次以后细胞抗体复合物再与1∶5000(v/v)稀释的辣根过氧化氢酶结合的羊抗兔二抗(Jackson公司产品)37℃孵育1h，PBST洗3次以后，每孔加入100μl单组分可溶型TMB底物显色液(天根公司产品)37℃作用10-30min，每孔再加入100μl 1MH2SO4终止反应，每孔的吸光值用酶标仪(Bio-Red公司产品)于450am的波长下检测。其中以胞内表达该蛋白的菌为阴性对照。
2.3 SDS-PAGE凝胶的制备 取30％凝胶母液(29.2％丙烯酰胺，0.8％甲叉双丙烯酰胺)2ml，1.5M Tris-HCl，pH8.8，1.3ml，10％SDS 50μl，超纯水1.6ml，10％过硫酸铵50μl，TEMED 2μl，混匀后注入垂直板电泳制胶器中，加封一层水，于室温下聚合1h左右即为12％的分离胶。倾去上层的水，取30％凝胶母液330μl，1M Tris-HCl，pH6.8，250μl，10％SDS20μl，超纯水1.4ml，10％过硫酸铵20μl，TEMED 2μl，混匀后注入分离胶上层，插入电泳梳板，于室温下聚合1h。
2.4 Western-blot检测各蛋白组分 将稀释到相同的OD(OD280＝1.0)的胞内和外膜蛋白组分取等体积和上样缓冲液(10％SDS，10％2-硫醇，pH6.8 0.3M Tris-HCl，0.05％溴苯酚蓝，50％甘油)混匀，在12％的SDS-PAGE胶中进行电泳，之后将切除浓缩胶的分离胶用电转仪(Bio-Red公司产品)在90V电压下的电转缓冲液(25mmol/l Tris-HCl，192mmol/l甘氨酸，20％甲醇)中电转移3h到PVDF膜上，将电转好的膜取出，在37℃PBS-T-BSA溶液(含0.05％土温和1％BSA的PBS缓冲液)中封闭1h之后进行免疫检测将PVDF膜在37℃与稀释到适当倍数的兔抗一抗孵育1.5h，然后用1∶5000(v/v)稀释的辣根过氧化氢酶结合的羊抗兔二抗标记，37℃孵育1h，用PBS-T溶液洗过之后，加入100μl单组分沉淀型TMB底物显色液，37℃作用15min进行显色，再用1M H2SO4终止反应，观察结果。其中以胞内表达该蛋白的菌为阴性对照。
实施例2绿色荧光蛋白的细菌表面展示新系统的构建、展示与检测 根据所需要展示的目标蛋白和其它所需的核苷酸序列设计引物，并在引物两端引入合适的酶切位点。以质粒pUC18为模板，引物pUCF和pUCR扩增得到pCU18质粒上的一段序列，并在下游引物中将EcoR I位点的第四位碱基进行突变，利用两端的AflII和Sac I位点将它连到经过同样酶切的pCU18片段中，得到突变了EcoR I位点的pCU18ΔE(图1)；以鳗弧菌MVM425基因组为模板，利用引物omporf1F和omporf1R扩增得到所需的Omporf1蛋白的一段编码序列，利用引物ompUF和ompUR扩增得到所需要的OmpU蛋白的一段编码序列，以mTn5gusA-pgfp12质粒为模板，gfpF和gfpR为引物扩增得到gfp序列，再通过overlap PCR的方法将ompof1片段和gfp片段或ompU片段和gfp片段融合到一起，Kpn I和BamH I位点被用来将这两个融合片段分别连到pCU18ΔE的相应位点内，得到重组质粒porf1G和pUG(图2)；以鳗弧菌MVM425基因组为模板，利用引物wzaF和wzaR扩增得到所需的Wza蛋白的一段编码序列，利用Sac I和Kpn I位点，将它连到质粒porf1G或pUG上，得到重组表达质粒pWorf1G和pWUG(图3)。将pWorf1G和pWUG分别转入Top10中。通过对表达的Top10/pWorf1G和Top10/pWUG菌抽提外膜蛋白组分并分别做ELISA(图8a)和Western-blot(图8b)验证知GFP蛋白被成功展示到外膜上。证明了系统Wza-Omporf1和Wza-OmpU都可以在大肠杆菌宿主中将外源胞内蛋白展示到外膜上，在抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂的发展和全细胞生物催化的发展等领域有潜在的应用价值。
设计合成的引物 pUCF5’-CCACATGTTCTTTCCTGCGT-3’ pUCR5’-TCCGAGCTCGAGTTCGTAATCATGGTC-3’ 反应条件为94℃30s，55℃30s，72℃55s，共30个循环，72℃7min。
wzaF5’-GGTGAGCTCAATGTCAAAAAAGTAT-3’ wzaR5’-CGGGGTACCTGCGGCATTTTTTTCGCCTGTA-3’ 反应条件为94℃30s，50℃30s，72℃20s，共30个循环，72℃7min。
omporf1F5’-CAGCGGGGTACCCCGATCGCACTATTAGCATCTT-3’ omporf1R5’-AGCCATGAATTCCGGATGCATTGCCGTTACTGTACCTACT-3’ 反应条件为94℃30s，51℃30s，72℃20s，共30个循环，72℃7min。
ompUF5’-CAGCGGGGTACCCCGAATGCAGATGGCTACTCT-3’ ompUR5’-AGCCATGAATTCCGGATGCATTTGACCATCAACAAAAGTACC-3’ 反应条件为94℃30s，50℃30s，72℃20s，共30个循环，72℃7min。
gfpF5’-CCGGAATTCATGGCTAGCAAAGGAG-3’ gfpR5’-CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCATGCCATG-3’ 反应条件为94℃30s，51℃30s，72℃55s，共30个循环，72℃7min。
实施例3 EseB抗原蛋白的细菌表面展示新系统的构建、展示与检测 迟钝爱德华氏菌是一种在淡水鱼类和海洋鱼类中可以引起出血性败血病的病原菌，它在水环境中有一个很广泛的感染宿主范围，而且对于许多动物甚至人都有一定的感染性。EseB蛋白来自于致病性的迟钝爱德华氏菌，为细菌III型分泌系统中的膜元件蛋白，有报道称EseB蛋白的缺失可以使迟钝爱德华氏菌的毒性降低，证明其与细菌致病性相关(Srinivasa Rao P.S.，Yamada Y.，Tan Y.P.，Leung K.Y.2004.Use ofproteomics to identify novel virulence determinants that are required for Edwardsiellatarda pathogenesis.Mol Microbiol 53(2)，573-586)。
以鳗弧菌MVM425基因组为模板，利用引物omp26LaF和omp26LaR扩增得到所需要的Omp26La蛋白的一段编码序列，利用前面得到的所需的Wza蛋白的一段编码序列，再通过overlap PCR的方法将wza片段和omp26La片段融合到一起，Sac I和BamH I位点被用来将此融合片段连到pCU18ΔE的相应位点内，得到重组质粒pW26La(图4)；以克隆有迟钝爱德华氏菌EseB蛋白编码基因eseB的质粒pPRoD为模板，PCR扩增eseB的基因，获得符合预期大小(600bp)的特异性扩增产物，回收该产物，利用其两端的EcoR I和BamH I位点直接分别克隆到也经过相同酶切的pWorf1G，pWUG或pW26La质粒上，得到含有融合基因wza/omporf1/eseB，wza/ompU/eseB或wza/omp26La/eseB的重组质粒pWorf1B，pWUB或pW26LaB(如图5所示)。将pWorf1B，pWUB或pW26LaB分别转入Top10和鳗弧菌MVAV6203中。通过对表达的Top10/pWorf1B，Top10/pWUB，Top10/pW26LaB以及AV/pWorf1B，AV/pWUB，AV/pW26LaB菌抽提外膜蛋白组分并分别做ELISA(图9a和图10a)和Western-blot(图9b和图10b)验证知EseB蛋白不管是在大肠杆菌Top10宿主中还是鳗弧菌MVAV6203宿主中都被成功展示到外膜上，证明了Wza-Omp26La系统在大肠杆菌和鳗弧菌宿主中都可以将外源蛋白展示到外膜上，同时证明了Wza-Omporf1和Wza-OmpU系统还可以在鳗弧菌宿主中将外源胞内蛋白展示到外膜上。本研究将EseB作为一个潜在的具有保护力的抗原蛋白，将其与Wza-Omporf1/OmpU/Omp26La展示系统相融合，并展示于鳗弧菌减毒株的细胞表面，有望研制并开发出同时针对鳗弧菌和迟钝爱德华氏菌感染的的多效价载体活疫苗。
设计合成的引物 omp26LaF5’-GCCGCAGGTACCCCGTTCTTTGGTAACACA-3’ omp26LaR5’-CGGGATCCAGCCATGAATTCCGGATGCATGACATGGAAGTAGTTAACG-3’ 反应条件为94℃30s，50℃30s，72℃25s，共30个循环，72℃7min。
eseBF5’-CCGGAATTCATGACTGTCAATAC-3’ eseRR5’-CGGGATCCTTAGCGGATATTCTGGG-3’ 反应条件为94℃30s，57℃30s，72℃45s，共30个循环，72℃7min。
所以，利用Wza-Omporf1、Wza-OmpU或Wza-Omp26La的融合子作为载体，可以将目标蛋白定位表达于细菌表面，既可增强和优化目标蛋白的生物学功能，也可增加所用宿主菌株的生物学功能，在活疫苗发展，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂的发展和全细胞生物催化的发展等众多领域都具有潜在的应用价值。
综上所述，本发明的细菌表面展示新系统能在细菌细胞表面成功展示目标蛋白，可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面，特别用于在鳗弧菌减毒株的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗。
需要说明的是，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，以上所述的是本发明的具体实施例及所运用的技术原理，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改而不背离本发明的精神与范围，这些等价形式同样落在本发明的范围内。
序列表
<110>华东理工大学
<120>细菌表面展示新系统、方法及应用
<160>4
<210>1
<211>44
<212>PRT
<213>鳗弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>SIGNAL
<222>(1)..(44)
<223>外膜脂蛋白Wza蛋白的信号肽和N端前11个氨基酸序列
<400>1
Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Ser Ser Met Ser Lys Lys Tyr Leu Pro
1 510 15
Leu Ile Ile Ala Ser Val Val Leu Thr Gly Cys Thr Ile Pro Gly Ser
20 25 30
His Leu Pro Thr Gly Glu Lys Asn Ala Ala Gly Thr
35 40
<210>2
<211>45
<212>PRT
<213>鳗弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(45)
<223>外膜蛋白Omporf1蛋白的6-50位氨基酸序列
<400>2
Ile Ala Leu Leu Ala Ser Phe Ala Phe Gly Gly Val Ala Met Ala Ala
15 10 15
Val Glu Glu Thr Thr Thr Ala Ser Thr Thr Gly Gly Ala Ala Gly Gly
20 25 30
Thr Ala Ala Thr Thr Ala Ala Val Gly Thr Val Thr Ala
35 40 45
<210>3
<211>59
<212>PRT
<213>鳗弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(59)
<223>外膜蛋白OmpU蛋白的180-238位氨基酸序列
<400>3
Asn Ala Asp Gly Tyr Ser Leu Ser Ala Ile Tyr Ala Ile Gly Asp Thr
15 10 15
Gly Val Lys Leu Gly Ala Gly Tyr Ala Asp Gln Asp Thr Ala Ala Asn
20 25 30
Ala Ser Ser Asp Gln Tyr Met Leu Ala Ala Ser Tyr Ala Ile Ser Asp
35 40 45
Phe Tyr Phe Ala Gly Thr Phe Val Asp Gly Gln
50 55
<210>4
<211>79
<212>PRT
<213>鳗弧菌(Vibrio anguillarum)
<220>
<221>TRANSMEM
<222>(1)..(79)
<223>外膜蛋白Omp26La蛋白的80-158位氨基酸序列
<400>4
Phe Phe Gly Asn Thr Gly Asp Val Val Asn Leu Gly Thr Tyr Leu Thr
15 10 15
Gly Ser Gly Val Thr Tyr Asp Gln Asp Ser Ala Asn Ser Val Lys Gly
20 25 30
Met Asp Lys Arg Lys Ala Thr Ile Asp Leu Gly Leu Asn Ala Asp Ile
35 40 45
Ala Leu Gly Asp Gly Thr Val Ser Thr Tyr Phe Gln His Asp Ile Leu
50 55 60
Asn Glu Asn Lys Gly Tyr Lys Thr Gly Val Asn Tyr Phe His Val
65 70 7权利要求
1.一种细菌表面展示新系统，包括编码目标蛋白的基因序列，其特征在于，还包括负责跨膜定位和转运的鳗弧菌核苷酸序列，所述编码目标蛋白的基因序列位于所述鳗弧菌核苷酸序列的C端，所述鳗弧菌核苷酸序列编码的蛋白包括鳗弧菌外膜脂蛋白的信号肽和鳗弧菌外膜蛋白的跨膜锚定序列，所述跨膜锚定序列连接所述信号肽和所述目标蛋白。
2.如权利要求1所述的细菌表面展示新系统，其特征在于，所述鳗弧菌外膜脂蛋白为Wza蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
3.如权利要求2所述的细菌表面展示新系统，其特征在于，所述鳗弧菌核苷酸序列为编码所述Wza蛋白的信号肽及N端的前11个氨基酸的核苷酸序列和编码所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段。
4.如权利要求3所述的细菌表面展示新系统，其特征在于，所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
5.一种利用权利要求1所述的细菌表面展示新系统在细菌的细胞表面展示目标蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤
a.将所述细菌表面展示新系统构建入表达载体上，获得重组表达载体；
b.将所述重组表达载体导入宿主菌中进行表达，获得融合蛋白，所述融合蛋白包括所述信号肽、所述跨膜锚定序列和所述目标蛋白。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述鳗弧菌外膜脂蛋白为Wza蛋白，所述鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述鳗弧菌核苷酸序列为编码所述Wza蛋白的信号肽及N端的前11个氨基酸的核苷酸序列和编码所述Omporf1蛋白的6-50位氨基酸的核苷酸片段\编码OmpU蛋白的180-238位氨基酸的核苷酸片段\编码Omp26La蛋白的80-158位氨基酸的核苷酸片段，所述宿主菌为大肠杆菌或鳗弧菌。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述表达载体是pUC18，所述宿主菌为大肠杆菌Top10或鳗弧菌减毒株MVAV6203，所述目标蛋白是迟钝爱德华氏菌的EseB抗原蛋白。
9.如权利要求1所述的细菌表面展示新系统在活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述活疫苗是鳗弧菌多效价载体疫苗。
全文摘要
本发明提供了一种细菌表面展示新系统，包括编码目标蛋白的基因序列和负责跨膜定位和转运的鳗弧菌核苷酸序列，目标蛋白的基因序列位于鳗弧菌核苷酸序列的C端，鳗弧菌核苷酸序列编码的蛋白包括鳗弧菌外膜脂蛋白的信号肽和鳗弧菌外膜蛋白的跨膜锚定序列，跨膜锚定序列连接信号肽和目标蛋白，鳗弧菌外膜脂蛋白为Wza蛋白，鳗弧菌外膜蛋白为Omporf1蛋白，OmpU蛋白或Omp26La蛋白，本发明的细菌表面展示新系统能在细菌细胞表面成功展示目标蛋白，可用于活疫苗开发，抗体制备，多肽文库筛选，环境生物吸附剂开发和全细胞生物催化方面，特别用于在鳗弧菌减毒株的基础上构建安全高效的鳗弧菌多效价载体疫苗。
文档编号C12N15/09GK101182516SQ20071017063
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月20日 优先权日2007年11月20日
发明者琴 刘, 张元兴, 朝 杨, 王启要 申请人:华东理工大学