专利名称：：基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种纳米
技术领域：
方法，特别是一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法。
背景技术：
：聚合酶链式反应(PCR)是一种在体外模拟自然DNA复制的核酸扩增技术。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR主要由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤反复的热循环构成即在高温(95。C)下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温(3755°C)情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度(72°C)下，以引物3'端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5'—3，方向延伸，合成丽A新链。这样，每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2"的指数形式迅速扩增，经过2530个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上。短短几十年，PCR技术因其特异性高、灵敏度高、简单快速、对样本的纯度要求低、可定量模板数等优点，在生物科学众多领域的应用日趋广泛。尽管PCR技术已经日益成为一个成熟的技术，但实际操作中，进行PCR扩增仍旧存在需改进的问题，如特异性、灵敏度、反应速度等问题。最突出的问题就是PCR扩增存在不同程度的非特异性。PCR作为一种体外模拟的DNA链式扩增反应，机制非常复杂，在链式反应过程中总是会发生一定程度的干扰副反应，如引物模板可能错配、引物结合形成二聚体等引起的扩增等等。科学家们从不同的角度来尝试解决这个问题，如从模板、引物、Mg2+浓度、退火温度等角度改善其特异性，或将增效剂如甲酰胺、甘油、二甲基亚砜，甜菜碱、氯化四甲基铵等引入PCR体系。但在实际应用中，效果却不尽如人意，甚至会抑制PCR的扩增过程。经对现有技术文献的检索发现，美国专利USPATENT5，646，019公开了"一种利于引发扩增核酸模板的制备方法"，该方法是在PCR体系里加入了耐热的单链结合蛋白(SSB)，SSB蛋白只结合单链DNA，但不结合双链DNA，通过结合并抑制含有单链的非特异性片段的扩增，从而实现了PCR扩增的优化。由于提取纯化SSB蛋白技术复杂，试剂纯度也要求很高，导致制备成本非常高，商品化试剂盒非常昂贵，价格是常规PCR试剂的6-7倍；同时为了保持单链结合蛋白的生物活性，要求严格贮存于一2(TC，并且其生物活性保持期限较短。
发明内容本发明针对现有技术的不足，提供一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应优化方法，使其在明显增高成本的情况下，提高PCR反应的扩增特异性和目标DNA的产量。本发明通过将有效量的纳米二氧化钛(Ti02)材料添加到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应，达到增加PCR反应的特异性，提高PCR目标产物的产量的效果；同时，由于纳米二氧化钛材料制备简便，成本低廉，易于保存，且优化材料易于从体系中分离，相比于其他生物分子添加材料SSB等成本大大降低。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明在聚合酶链式反应体系里加入纳米二氧化钛材料作为添加剂优化聚合酶链式反应。所述纳米二氧化钛材料，在制备聚合酶链式反应体系过程中加入。所述纳米二氧化钛材料的粒径在lnra200nm之间均可用于作为PCR的优化材料。所述纳米二氧化钛材料为胶体溶液，可以采用现有技术制备lnra200nm的样品；也可以直接购买商业化产品，如Sigma公司可提供25nm-100nm的纳米二氧化钛材料。在实际应用中，将有效量的纳米二氧化钛材料作为添加剂加入到聚合酶链式反应体系中进行PCR反应。所述有效量是指产生优化作用的有效用量范围。针对纳米二氧化钛材料的粒径不同，聚合酶链式反应体系不同，产生优化作用的所需添加的纳米二氧化钛有效用量范围是不同的。针对不同聚合酶链式反应体系，不同粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料有效用量范围通过以下方法进行确定通过对该特定粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料进行梯度稀释或浓縮，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该纳米二氧化钛材料的有效用量范围。当需要将纳米二氧化钛材料从反应后的PCR产物中分离出来时，可以采用转速高于12000rpm的离心机将样品离心3分钟以上，纳米二氧化钛材料会被离心聚沉至底部，吸取上清液即可达到分离目的。本发明与已有方法相比，具有优化扩增的效果显著，制备简便，成本低廉，易于保存，应用广泛的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，非特异性扩增基本消除，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。纳米Ti02胶体溶液可以长期保存在4r，并且没有失去活性的担心。商品化纳米二氧化钛价格(低于0.05元/反应)也比单链结合蛋白(0.48元/反应)便宜，试剂均一度好，易于保存和准确加样。本发明优化后的PCR反应体系不仅适用于控温精确的PCR仪，也适用于控温性能较差的PCR仪。本发明可以应用于各种PCR扩增、聚合酶延伸以及基于PCR方法基础的其他生化方法，尤其适用于一些较难扩增类型的PCR方法诸如一次扩增不成功而需要再扩增、高GC含量的扩增、人类基因组GAP的扩增、高背景低拷贝模板的扩增、古生物DNA扩增等等。本发明也适用于实时定量PCR反应。本发明可以用于基因检测与克隆、遗传分析、临床诊断、基因芯片以及新材料等领域。图1添加纳米Ti02材料对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化的效果图图2添加纳米Ti02材料对pfuDNA聚合酶进行的PCR反应的优化效果图具体实施例方式下面结合附图对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。'本发明适用的聚合酶链式反应体系可以是那些容易产生非特异性扩增的体系、GC含量高的扩增体系、模板数为低拷贝(小于103)的体系、复杂基因背景体系或包含上述数种因素的体系。例如，产生非特异性扩增的PCR再扩增体系可以作为一个典型的体系。PCR再扩增体系是指以第一次扩增的产物稀释后作为第二次扩增的模板，进行第二次扩增。当以第一次扩增的产物稀释1000倍作为第二次扩増的模板，且在常规PCR扩增体系下进行扩增时，会产生大量的非特异性扩增产物，而如果在该PCR体系中加入适量的特定粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料，则能够消除这些非特异性扩增，在琼脂糖凝胶电泳图上得到单一的目标产物。本发明适用的聚合酶链式反应体系也可是采用pfuDNA聚合酶的扩增体系。PCR体系的一般组成成份见于各种常用分子生物学工具书或各种商业聚合酶说明书。以Takara公司ExTaq酶为例，一个PCR扩增反应的组成为<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述的PCR反应的一般过程为(1)制备PCR反应体系，包括合适用量的DNA聚合酶、引物、模板、dNTP、PCR缓冲液等；(2)在PCR仪上以设定的程序进行PCR反应；(3)扩增完成后的产物进行检测。当该PCR反应需要优化时，可以在制备PCR反应体系过程中加入起优化作用的添加剂，如有效量的纳米二氧化钛材料。PCR产物检测可以采用多种检测方法，如对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，或对扩增后样品进行毛细管电泳检测，或在实时定量PCR仪上进行实时定量检测PCR的实时扩增过程。实施例1添加纳米Ti02材料对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化在进行一些目标模板很少或样品极其稀少的扩增实验时，常常会发现一次扩增无法得到目标条带，这时就需要进行再扩增，即用一次扩增得到的产物作为模板继续进行第二次的扩增，提高产物中目标条带的产量。但是用再扩增提高产量的同时也会形成一些非特异性的扩增。针对这种形成非特异性扩增的PCR再扩增情况，通过向PCR再扩增体系中添加有效量的纳米二氧化钛来实现对其的优化。具体而言，包括下列步骤-1、制备PCR体系进行第一次扩增。体系组成如下表TakaraExTaq酶(5U/ML)0.125HL10XPCR缓冲液(不含Mg"2.5叱dNTP底物(2.5mM)2叱Mg2+(25mM)1.引物p1(10,)0.5叱引物p2(10幽)0.5PL模板0.5PLH20补足总体积至25叱其中，模板为lambdaDNA，稀释为107copy>L，ExTaq酶购自Takara公司，扩增片段长度为283bp。引物序列为pi:5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3';p2:5'-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3'。扩增条件为95'C预热3分钟；30个循环，每个循环包括94'C变性20秒，55。C退火30分钟，72。C延伸30秒；最后72。C延伸5min。对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，发现明亮的单一目标条带，说明第一次扩增结果良好。2、制备PCR再扩增体系。体系组成如上表，但不同的是模板为稀释IOOO倍的上述第一次扩增产物，引物序列依旧为pl:5'-GGCTTCGGTCCCTTCTGT-3';p2:5，-CACCACCTGTTCAAACTCTGC-3'。同时，加水补足为25叱之前，需要加入一定量的纳米二氧化钛胶体溶液。3、纳米Ti02优化材料制备优化材料纳米Ti02为胶体溶液，自制，粒径为3nm，浓度为11.33PgAiL，使用前需要在超净台中稀释IO倍后备用。4、向以上PCR体系中加入不同体积的纳米Ti02胶体溶液，使得每25叱PCR反应体系中纳米Ti02的质量分别为0.17化，0.23Pg，0.80Pg，1.72Pg，2.29^g，同时做不加优化介质的相应对照；最后用水补足到25化。5、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增程序与第一次扩增条件相同。6、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检査扩增条带，与对照体系进行比较。扩增结果如图1所示。从左至右依次为M:分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp);1为未加入纳米Ti02溶液的再扩增体系；2，3，4，5，6为分别加入0.17Pg，0.23^g，0.8(￥g，1.72化，2.29Pg纳米Ti02的再扩增体系；7为不加入模板的空白对照。可以看出加入纳米Ti02为0.17Pg1.72!^g的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，特别是纳米Ti02加入量为0.23化-0.804g时扩增得到明亮的单一目标带，而相应的未加入纳米Ti02的常规PCR体系扩增结果显示严重的杂带和后续拖尾，表明非特异性扩增严重。该PCR扩增结果显示了本发明对于PCR扩增有显著的优化效果，特别是可以提高扩增特异性和扩增产物的产量。实施例2添加纳米Ti02材料对非特异性扩增严重的再扩增PCR反应进行优化反应体系和具体过程同实施例1，所不同的是再扩增体系的模板采用的是稀释2000倍后的一次扩增产物，并且优化材料纳米Ti02的加入量为，每25APCR反应体系中纳米Ti02的质量分别为0.23Pg，O.化g，0.6[xg，0.8Pg，同时做不加纳米Ti02的空白对照。扩增结果表明加入纳米Ti02为0.23^g0.8^g的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，可以得到单一目标带。实施例3添加纳米Ti02材料对pfuDNA聚合酶进行的PCR反应的优化为了提高PCR反应的保真度，通常选用具有3'到5'的外切校正功能的pfuDNA聚合酶进行扩增，但是该酶的弱点是会导致产物产量降低，有时在常规扩增循环次数下甚至不能得到目标产物。针对一些pfuDNA聚合酶在常规扩增循环次数的PCR反应中不能得到目标产物的情况，通过向PCR体系中添加有效量的纳米二氧化钛来实现对其的优化，达到增加PCR扩增效率、提高扩增产物产量的目的。具体而言，包括下列步骤1、制备PCR体系，组成如下表<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>其中，模板为lambdaDNA，稀释为1(Tc叩yAiL，pfuDNA聚合酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司，扩增片段长度为792bp。引物序列为pl:5'-gcccagcaacagcacaac-3，；p2:5，-cccaccaacgggaaagaa-3，。2、纳米Ti02优化材料制备优化材料纳米Ti02为胶体溶液，自制，粒径为3nm，浓度为11.33Pg/A，使用前需要在超净台中稀释ioo倍后备用。3、向以上PCR体系中加入不同体积的纳米Ti02胶体溶液，使得每25叱PCR反应体系中纳米Ti02的质量分别为0.17化，0.23Pg，0.28Pg，0.3化g，0.5Wg，0.574g，同时做不加优化介质的相应对照；4、利用PCR技术对模板分子进行扩增，扩增条件为95'C预热2分钟；35个循环，每个循环包括95。C变性30秒，58。C退火30秒，72。C延伸lmin;最后72'C延伸2min。5、对扩增后的DNA样品进行琼脂糖凝胶电泳检测，检査扩增条带，与对照体系进行比较。扩增结果如图2所示。从左至右依次为M:分子量标记(Takara公司DL2000，分别为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp);1为未加入纳米Ti02的体系;2-7为分别加入0.17^g，0.23^g，0.28Pg，0.3他，0.51Pg，0.57^g纳米Ti02的体系；8为不加入模板的空白对照。可以看出未加入Ti02胶体溶液的PCR体系没有得到可检测的扩增产物，表明使用pfuDNA聚合酶时在常规的扩增次数(35次时)得到的产物量很少；而相应的加入纳米Ti02的体系逐渐出现了越来越明亮的目标条带，当纳米Ti02加入量为0.23Pg-0.57Pg时扩增得到单一目标带，更适宜的范围在0.23!^0.34l^g。该PCR扩增结果显示了本发明对于使用pfuDNA聚合酶的PCR扩增具有显著的增强效率和提高产量的效果。实施例4添加纳米Ti02材料对pfuDNA聚合酶进行的PCR反应的优化反应体系和具体过程同实施例3，所不同的是加入的模板量增加为1.5叱，并且优化材料纳米Ti02的加入量为，每25叱PCR反应体系中纳米Ti02的质量分别为0.23Pg，0.25Pg，0.30Pg，0.3扭g，同时做不加纳米Ti02的空白对照。扩增结果表明加入纳米Ti02为0.23Pg0.3化g的体系PCR扩增结果中非特异性扩增明显减少，可以得到单一目标带。权利要求1.一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征在于，在聚合酶链式反应体系里加入纳米二氧化钛材料优化聚合酶链式反应，所述纳米二氧化钛材料，其粒径在1nm～200nm之间。2.根据权利要求1所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，所述纳米二氧化钛材料为胶体溶液。3.根据权利要求1所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，所述纳米二氧化钛材料，其有效量范围确定方法为对该设定粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料进行梯度稀释或浓縮，以浓度梯度方式加入到该聚合酶链式反应体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该纳米二氧化钛材料的有效用量范围。4.根据权利要求3所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，针对粒径为3nm的纳米二氧化钛和产生非特异性扩增的聚合酶链式反应体系，产生优化作用的纳米二氧化钛材料有效用量范围为每25化聚合酶链式反应体系0.17Pg-1.72Pg。5.根据权利要求3所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，针对粒径为3nm的纳米二氧化钛和产生非特异性扩增的聚合酶链式反应体系，产生优化作用的纳米二氧化钛材料有效用量范围为每25叱聚合酶链式反应体系0.23^g-0.80Pg。6.根据权利要求3所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，针对粒径为3nm的纳米二氧化钛和使用pfuDNA聚合酶的聚合酶链式反应体系，产生优化作用的纳米二氧化钛材料有效用量范围为每25叱聚合酶链式反应体系0.227Pg-0.567Pg。7.根据权利要求3所述的基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，其特征是，针对粒径为3nm的纳米二氧化钛和使用pfuDNA聚合酶的聚合酶链式反应体系，产生优化作用的纳米二氧化钛材料有效用量范围为每25化聚合酶链式反应体系0.227Hg-0.340Pg。全文摘要一种基于纳米二氧化钛材料的聚合酶链式反应的方法，通过向PCR体系中添加有效量的纳米二氧化钛材料来实现对PCR扩增的优化。针对不同粒径纳米二氧化钛材料，和不同聚合酶链式反应，通过对该特定粒径或粒径范围的纳米二氧化钛材料进行梯度稀释或浓缩，以浓度梯度方式加入到该PCR体系中，以实际扩增达到优化目的的范围为所需该纳米二氧化钛材料的有效用量范围。本发明具有优化扩增的效果显著，制备简便，成本低廉，易于保存，应用广泛，优化材料易于从体系中分离的优点。扩增产物的特异性得到显著提高，在某些反应中产物的产量也得到明显的提高。文档编号C12N15/09GK101182515SQ200710170429公开日2008年5月21日申请日期2007年11月15日优先权日2007年11月15日发明者张晓东,曹雪雁,杨文超,樊春海,钧胡申请人:上海交通大学