柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记及其应用和检测方法与流程

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本发明涉及分子生物学领域，具体涉及一种抗性基因分子标记，尤其涉及一种柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记及其应用和检测方法。


背景技术：

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柑橘全爪螨panonychus citri(mcgregor)是一种重要的世界性发生和危害的害螨，可取食危害112种寄主植物，但以柑橘类果树为主。该螨广泛分布于亚洲、欧洲、非洲、南北美洲等柑橘产区，一年发生多代，每年4-6月和9-11月柑橘抽梢期发生严重。目前对柑橘全爪螨的治理仍以化学防治为主。然而，由于长期大量且不合理的用药，加之柑橘全爪螨繁殖力强、发育历期短和世代重叠严重等特性，导致该螨对多种常用杀螨剂产生了抗药性。
[0003]
哒螨灵作为一种典型的线粒体复合物电子传递链抑制剂(metis)，对叶螨的卵、幼螨、若螨和成螨均有效，故自上世纪投入商业化使用以来，在世界范围内被用于多种害螨的防治：二斑叶螨、苹果全爪螨、柑桔全爪螨和截形叶螨等。因哒螨灵杀螨剂被长期大量使用，田间抗性问题日益凸显，严重地区其已丧失杀螨毒力。但对于哒螨灵抗性机理的研究少之又少，该杀螨剂靶标于线粒体呼吸链复合物i发挥作用。复合物i又称nadh脱氢酶(nadh dehydrogenase)，位于线粒体内膜，是电子传递链5个复合物中最大的一个复合物，其中psst是复合物i的一个亚基，目前还没有一种分子标记能快速检测柑桔全爪螨对哒螨灵的抗性。


技术实现要素：

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本发明的目的是针对柑桔全爪螨对哒螨灵抗性检测的分子领域的空白，提供一种柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记，所述分子标记为pcpsst_h107r突变。
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所述pcpsst_h107r突变中野生型pcpsst基因的cds序列如seq idno:1所示。
[0006]
编码所述pcpsst_h107r突变的基因序列如seq id no:4所示。
[0007]
所述突变为纯合突变。
[0008]
本发明的另一目的是提供上述任一项的分子标记在柑桔全爪螨对哒螨灵敏感种群和抗性种群分类中的应用。
[0009]
本发明的另一目的是提供一种扩增上述任一项的分子标记的特异性引物对，所述引物对为pcpsst_f/r，引物序列如下：
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pcpsst_f:5
’-
tgaaccggctcgacaaaatg-3’，
[0011]
pcpsst_r:5
’-
ttgagctgatgcttgtcgttt-3’。
[0012]
本发明的再一目的是提供一种柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记的检测方法：先提取待测柑桔全爪螨的总dna，以总dna为模板用权利要求6中的特异性引物对进行pcr扩增，得到扩增产物psst基因片段，分析pcr扩增产物是否含有权利要求1所述的分子标记，即可判断待测柑桔全爪螨是对哒螨灵的敏感种群还是抗性种群。
[0013]
上述技术方案中，分析pcr扩增产物是否含有上述的分子标记的具体方法为：将
pcr扩增产物进行测序，与上述任一的柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记进行序列比对，如果pcr扩增产物为pcpsst_h107r纯合突变，说明检测的柑桔全爪螨为哒螨灵抗性种群。
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提取待测柑桔全爪螨的总dna的方法为：将待测柑桔全爪螨放入离心管中，加入ste buffer和proteinase k，用研磨棒充分研磨螨体，37℃水浴孵育30min，震荡10s后，95℃水浴5min，离心，所获得上清作为pcr扩增模板。
[0015]
所述pcr扩增的反应体系为12.5μl 2
×
primestar max premix、引物对的正、反向引物各1μl、2μldna模板，补充ddh2o至25μl；
[0016]
所述pcr扩增的反应条件为：98℃预变性2min；98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸30s、30次循环；最后72℃延伸5min。
[0017]
本发明的有益效果是：首次确定了柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记，建立了快速检测柑桔全爪螨对哒螨灵抗性的分子标记的方法，本发明方法避免了传统dna提取步骤的复杂及危险性，消除了传统dna纯化过程中所必需的耗时耗力的去蛋白、有机溶剂提取、透析以及乙醇沉淀等实验步骤，避免了有机试剂对人体的危害，本发明方法操作简单，可同时检测大量样本，可快速有效的检测柑桔全爪螨田间种群是否存在h107r突变及突变比例，可快速有效的评估相应位点在某地理种群中的突变频率，为柑桔全爪螨对哒螨灵杀螨剂的田间抗性提供一种分子检测手段。
附图说明
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图1是以敏感品系为例验证引物对pcr扩增后的目的片段电泳图。
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图2是psst亚基基因部分片段atgatgcac碱基峰图。
[0020]
图3是psst亚基基因部分片段atgatgcac及atgatgcgc碱基峰图。
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图4是psst亚基基因部分片段atgatgcgc碱基峰图。
具体实施方式
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下面结合实施例对本发明作进一步说明，但并不因此而限制本发明。
[0023]
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
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主要试剂及来源：
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ste buffer：100mmnacl、10mm tris-hcl、1mm edta。
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tris-hcl(sigma-aldrich公司，德国)
[0027]
edta(sigma-aldrich公司，德国)
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proteinase k：(qiagen公司，德国)
[0029]2×
primestar max premix(takara公司，日本)
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其余试剂如未表明，均为本领域常规试剂，均可商购获得。
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实施例1
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敏感品系：室内敏感品系2016年采自于西南大学柑橘研究所苗圃内，并在实验室长期多代饲养，期间未接触任何药剂，其对哒螨灵的lc
50
值保持较低水平，为0.131mg/l。
[0033]
田间种群：选取我国南方主要柑桔产区：四川(大英，安岳)、重庆万州、湖北秭归、广西(南宁，桂林)和云南玉溪共7个地区的田间柑桔全爪螨进行检测，每个园区随机选取至少10棵树，采集多于5000头用于生物测定并同时采集雌成螨保存于无水乙醇中用于后续
dna的提取。对敏感品系和前述7个田间种群进行生物测定，结果如表1所示，相对于室内敏感品系，各地区田间的柑桔全爪螨种群对哒螨灵都已产生不同程度抗性，其中安岳和南宁种群的lc
50
值均超过2000mg/l，分别为：2614和2214mg/l。
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表1
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实施例2田间快速检测柑桔全爪螨对哒螨灵的抗性
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利用实施例1得到从田间采集的不同地区田间柑桔全爪螨，根据近似物种抗性突变位点所处的位置，对柑桔全爪螨进行抗性标记检测：
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1)制备pcr扩增模板：将采集的柑桔全爪螨单头雌成螨置于1.5ml无核酶离心管中作为样本，并12000rpm，1min离心至管底，加入20μl ste buffer(dna提取液：100mm nacl，10mm tris-hcl，1mm edta)和0.5μlproteinase k(50mg/ml)，用研磨棒充分研磨螨体，37℃水浴孵育30min，震荡10s后，95℃水浴5min，12000rpm离心3min，所获得上清作为pcr扩增模板。
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2)pcr扩增：pcr反应体系：12.5μl 2
×
primestar max premix、8.5μl无核酸酶水、引物对的正、反向引物各1μl、2μl步骤1)制备的pcr扩增模板，共25μl。反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s、55℃退火15s、72℃延伸30s，30次循环、最后72℃延伸5min，12℃保存。
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通过近似物种序列比对和人工查找，在柑桔全爪螨基因组数据库中找到psst亚基基因。野生型柑桔全爪螨psst亚基基因的cds序列为seq id no:1所示。
[0041]
反应体系中所用引物对是基于柑桔全爪螨psst亚基基因序列设计的。引物对为pcpsst_f/r，引物序列如下：
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pcpsst_f:5
’-
tgaaccggctcgacaaaatg-3’(seq id no:2)，
[0043]
pcpsst_r:5
’-
ttgagctgatgcttgtcgttt-3’(seq id no:3)。
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3)凝胶电泳：吸取少量pcr反应产物用1.5％琼脂糖凝胶进行电泳检测。
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泳道出现目的条带：具有psst基因片段的目的条带(550bp)。图1所示为部分敏感品系扩增结果(单头提取检测，呈现部分结果，同时验证上述引物对的可行性)。
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4)pcr产物测序及突变分析：将剩余pcr产物送华大基因公司进行测序，分析测序结果。用bioedit软件打开序列文件，分析碱基峰图，明确碱基是否存在突变，且突变是纯合突变还是杂合突变，截取野生型atgatgcac(氨基酸mmh)或突变型atgatgcgc(氨基酸mmr)片段峰图(峰图用四种颜色的波形代表四种碱基的信号强度；正常的峰图，波峰与波谷清晰，
峰与峰之间的距离均匀；比较理想的测序结果在底部应该没有杂峰干扰，若某碱基处出现杂峰干扰，可认为等位基因在该碱基处存在snp杂合)，对应峰图如图2、3、4所示，分别统计突变类型数目，结果如表2所示(表2中的数字的分母为试螨头数，分子为相应碱基类型螨数)，各地区柑桔全爪螨田间种群出现不同比例突变，纯合突变与抗性水平的呈现一定相关性。突变型柑桔全爪螨psst亚基基因的cds序列为seq id no:4所示。
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表2
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