抗SAR-COV-2全人源单克隆抗体及其制法与应用的制作方法

抗sar-cov-2全人源单克隆抗体及其制法与应用
技术领域
1.本发明属于免疫学领域，具体地涉及抗sar-cov-2(covid-19)全人源单克隆抗体及 其制法与应用。


背景技术：

2.在2018年全球十大畅销药中，有8个是全人源或人源化单克隆抗体药物。排名第一的是 艾伯维公司治疗关节炎的抗tnfa单克隆抗体humira，这是一个全人源单克隆抗体，已经是 连续6年销售额100亿以上的药王。从1986年第一个单克隆抗体药物上市开始，单抗药物经 历了鼠源单抗药物(如orth℃lone okt3)、嵌合单抗药物(rituximab)、人源化单抗药物 (herceptin)和全人源单抗药物(humira)等阶段。由于人体出现抗鼠抗体反应(hama)， 鼠源单抗药物、嵌合单抗药物已经逐渐被淘汰，目前占据市场的单克隆抗体药物全都是人源 化单克隆抗体药物。与国际先进的人源抗体生产技术相比，深圳乃至全中国都有很大差距， 主要表现在人源抗体药物领域的创新能力薄弱，自主研发的品种少，目前还没有原创人源化 单克隆抗体药物上市的报道，庞大的抗体药物市场被国外药企占领。我国要改变落后局面， 争夺消费潜力巨大的国内外抗体药物市场，亟需攻克全人源单克隆抗体技术。
3.人源单克隆抗体在治疗炎症、癌症、流行性感冒特别是冠状病毒等方面具有高特异性的 显著疗效。covid-19是由一种sar-cov-2冠状病毒引起的急性呼吸道传染病，至今仍然缺 乏有效的药物和疫苗。新冠状病毒在入侵细胞时需要依赖病毒自身表达的特定分子与人细胞 上的受体结合，才能感染细胞，并进一步扩增。中和病毒的人源抗体是人b淋巴细胞产生的 某些特异抗体，能够与病毒表面的抗原结合，从而阻止该病毒黏附靶细胞受体，防止病毒侵 入细胞，能够高效防治sar-cov-2流行性感冒。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供一种抗sar-cov-2的抗体或其抗原结合片段，其特异性结 合sar-cov-2的s蛋白。
5.本发明一方面提供一种分离的抗sar-cov-2的抗体或其抗原结合片段；其具有如下任一 组的三个重链可变区的互补决定区(hcdr)和三个轻链可变区的互补决定区(lcdr)：
6.抗体2e5
7.2e5-hcdr1：gftfstyg seq id no：1；
8.2e5-hcdr2：iwydgssk seq id no：2；
9.2e5-hcdr3：ardpkttvttkmdv seq id no：3；
10.2e5-lcdr1：slrlyy seq id no：4；
11.2e5-lcdr:2：dkd seq id no：5；以及
12.2e5-lcdr3：nsrdssgnhlgvl seq id no：6；
13.或者
14.抗体2i3
15.2i3-hcdr1：gftfsnha seq id no：11；
16.2i3-hcdr2：isgsdgsa seq id no：12；
17.2i3-hcdr3：argnwessyafcdn seq id no：13；
18.2i3-lcdr1：qsvlyrsnskny seq id no：14；
19.2i3-lcdr:2：was seq id no：15；以及
20.2i3-lcdr3：lqhysfpft seq id no：16；
21.或者
22.抗体3i15
23.3i15-hcdr1：gftlssyg seq id no：21；
24.3i15-hcdr2：lgysgdsi seq id no：22；
25.3i15-hcdr3：arlwvasggddy seq id no：23；
26.3i15-lcdr1：qsvshy seq id no：24；
27.3i15-lcdr:2：dts seq id no：25；以及
28.3i15-lcdr3：qqrsiwplt seq id no：26；
29.或者
30.抗体4e17
31.4e17-hcdr1：gfafstya seq id no：31；
32.4e17-hcdr2：issgssti seq id no：32；
33.4e17-hcdr3：argrsyaladlpy seq id no：33；
34.4e17-lcdr1：qsissw seq id no：34；
35.4e17-lcdr:2：eas seq id no：35；以及
36.4e17-lcdr3：qqynsysslt seq id no：36。
37.本发明另一个方面提供了一种分离的抗sar-cov-2的抗体或其抗原结合片段，其中，抗 体抗体2e5的重链可变区和轻链可变区为：
38.2e5重链可变区：
39.qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfstygmhwvrqapgkglewvaviwydgssksyadsvkgrftvssddsknilylqmnslraedtavyycardpkttvttkmdvwgqgtt vtvss seq id no：7
40.2e5轻链可变区：
41.sseltqdpavsvalgqtvritcqgdslrlyyanwyqqkpgqapllviydkdnrpsgipd rfsgsssgstasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhlgvlfgggtkltvt seq id no：8；
42.或者，抗体2i3重链可变区和轻链可变区为：
43.2i3重链可变区：
44.evqllesggglvqpggslrlscvasgftfsnhamtwvrqapgkgldwvstisgsdgsanyadsvkgrviisrdnskntlylqmnslraedtavyycargnwessyafcdnwgqgtlv tvss seq id no：17
45.2i3轻链可变区：
46.divmtqspfslpvslgeratinckssqsvlyrsnsknylawyqqkpgqapklliywast rksgvpdrfsasgsgtdftltisslqpedvadyyclqhysfpftfgpgtkvglr seq id no:18；
47.或者，抗体3i15重链可变区和轻链可变区为：
48.3i15重链可变区：
49.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlssygmswvrqapgkglewvsglgysgdsiyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraadtavyycarlwvasggddywgqgtlvtv ss seq id no：27
50.3i15轻链可变区：
51.eivltqspatlslspgeratlscrasqsvshylawfqqksgqaprlliydtskratgtpa tfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsiwpltfgggtkleik seq id no:28
52.或者，抗体4e17重链可变区和轻链可变区为：
53.4e17重链可变区：
54.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafstyamnwvrqapgkglewvsyissgssti yyansvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargrsyaladlpywgqgtlvtv ss seq id no：37
55.4e17轻链可变区：
56.diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliyeasslesgvp srfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsyssltfgggtkveik seq id no:38
57.在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段为人源化抗体，更优选为全人源 化抗体。
58.在本发明的技术方案中，所述的抗体为igg1抗体。
59.在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合sar-cov-2表面s 蛋白。
60.在本发明的技术方案中，所述的抗体为单克隆抗体或多克隆抗体，优选为单克隆抗体。
61.在本发明的技术方案中，所述的抗体或其抗原结合片段特异性结合sar-cov-2表面s 蛋白。
62.本发明再一个方面提供了一种核苷酸序列，其编码如前述的抗体或其抗原结合片段。
63.本发明再一个方面提供了一种载体，包含前述的核苷酸序列。
64.本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，包含前述载体或载体组，优选地，所述宿主细 胞是原核的或真核的，更优选的选自酵母细胞、哺乳动物细胞或适用于制备抗体或其抗原结 合片段的其它细胞。
65.本发明再一个方面提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含如前述的抗体或其抗原结合片段。
66.本发明再一个方面提供了一种检测试剂，所述检测试剂包含如前述的抗体或其抗原结合 片段。
67.本发明再一个方面提供了上述抗体或其抗原结合片段作为检测试剂的用途，所述试剂用 于以下用途的试剂：酶联免疫吸附检测(elisa)、免疫印迹(western blot)、流式细胞术 (facs)、免疫组织化学(ihc)检测或者免疫pcr。
68.在上述在免疫学检测中，抗体或其抗原结合片段可单独或与通过化学键偶联，静电吸附 或者亲疏水性吸附，而连接缀合物包括辣根过氧化物酶(hrp)，碱性磷酸酶(ap)，生物素 (biotin)，异硫氰酸荧光素(fitc)，cy3、cy5、磁珠和琼脂糖等缀合物连接。
69.在本发明的技术方案中，检测试剂可用于非诊断或治疗目的检测。
70.本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其如前所述的分离的抗体或其抗原结合片段 和药物上可接受辅料。
71.在本发明的技术方案中，其中所述抗体或其抗原结合片段阻断或降低sar-cov-2的s 蛋白与受试者的细胞表面受体结合，所述细胞表面受体优选为细胞血管紧张素转化酶相关性 羧肽酶(ace2)。
72.本发明再一个方面提供了一种抗sar-cov-2的抗体或其抗原结合片段在制备预防、治疗 或缓解sar-cov-2感染的至少一种症状或适应症的药物中的用途。
73.在本发明的技术方案中，所述的药物为口服或注射制剂。
74.本发明再一个方面提供了一种预防、治疗或缓解sar-cov-2感染的至少一种症状或适应 症的方法，所述方法包括将前述任一项的抗体或其抗原结合片段或前述药物组合物施用于受 试者。
75.在本发明的技术方案中，其中所述至少一种症状或适应症选自下组：肺部炎症、肺泡损 伤、发热、咳嗽、呼吸困难、低血氧症、急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、凝血功能障碍、 代谢性酸中毒、鼻塞、流涕、咽痛、腹泻、器官衰竭、败血性休克和死亡。
76.在本发明的技术方案中，其中所述药物组合物或所述抗体或其抗原结合片段与第二治疗 剂组合施用。其中所述第二治疗剂选自下组：抗炎症药物(如皮质类固醇和非甾体抗炎症药 物)、抗病毒药物、针对sar-cov-2的s蛋白的不同的抗体、对于sar-cov-2的疫苗、抗生 素、膳食补充剂如抗氧化剂和治疗sar-cov-2感染的任何其他姑息疗法、缓解上述症状或适 应症的药物。
77.在本发明的技术方案中，其中所述药物组合物或所述抗体或其抗原结合片段通过皮下、 静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内施用。
78.有益效果
79.(1)本发明所述抗sar-cov-2抗体可以靶向结合sar-cov-2病毒的s蛋白，特异性高， 能有效阻断sar-cov-2病毒表面s蛋白与受试者细胞表面受体的结合。
80.(2)相比鼠源抗体，本发明全人源抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成 分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成 为治疗流感病毒的大分子药物。
81.(3)相较于现有技术提供的噬菌体展示技术制备抗sar-cov-2病毒人源单克隆抗体的 方法，本发明采用的单个b细胞开发抗sar-cov-2病毒的抗体具有操作简单快捷，生产的 人源抗体具有高亲和力和特异性等优点。
附图说明
82.图1为实施例1elisa实验结果图。
具体实施方式
83.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方 式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
84.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本 发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于
酸序列分别如下所示：
94.抗体2e5
95.2e5-hcdr1：gftfstyg seq id no：1；
96.2e5-hcdr2：iwydgssk seq id no：2；
97.2e5-hcdr3：ardpkttvttkmdv seq id no：3；
98.2e5-lcdr1：slrlyy seq id no：4；
99.2e5-lcdr:2：dkd seq id no：5；以及
100.2e5-lcdr3：nsrdssgnhlgvl seq id no：6；
101.或者
102.抗体2i3
103.2i3-hcdr1：gftfsnha seq id no：11；
104.2i3-hcdr2：isgsdgsa seq id no：12；
105.2i3-hcdr3：argnwessyafcdn seq id no：13；
106.2i3-lcdr1：qsvlyrsnskny seq id no：14；
107.2i3-lcdr:2：was seq id no：15；以及
108.2i3-lcdr3：lqhysfpft seq id no：16；
109.或者
110.抗体3i15
111.3i15-hcdr1：gftlssyg seq id no：21；
112.3i15-hcdr2：lgysgdsi seq id no：22；
113.3i15-hcdr3：arlwvasggddy seq id no：23；
114.3i15-lcdr1：qsvshy seq id no：24；
115.3i15-lcdr:2：dts seq id no：25；以及
116.3i15-lcdr3：qqrsiwplt seq id no：26；
117.或者
118.抗体4e17
119.4e17-hcdr1：gfafstya seq id no：31；
120.4e17-hcdr2：issgssti seq id no：32；
121.4e17-hcdr3：argrsyaladlpy seq id no：33；
122.4e17-lcdr1：qsissw seq id no：34；
123.4e17-lcdr:2：eas seq id no：35；以及
124.4e17-lcdr3：qqynsysslt seq id no：36。
125.在一些实施方式中，该抗体2e5的重链可变区氨基酸序列如seq id no:7所示，或该序 列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
126.qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfstygmhwvrqapgkglewvaviwydgssksyadsvkgrftvssddsknilylqmnslraedtavyycardpkttvttkmdvwgqgtt vtvss seq id no：7
127.且
128.该抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:8所示，或该序列经替换、缺失或添加一 个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列 sseltqdpavsvalgqtvritcqgds
lrlyyanwyqqkpgqapllviydkdnrpsgipdrfs gsssgstasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhlgvlfgggtkltvt seq id no：8。
129.在一些实施方式中，该抗体2i3的重链可变区氨基酸序列如seq id no:17所示，或该 序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
130.evqllesggglvqpggslrlscvasgftfsnhamtwvrqapgkgldwvstisgsdgs anyadsvkgrviisrdnskntlylqmnslraedtavyycargnwessyafcdnwgqgtlv tvss seq id no:17
131.且
132.该抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:18所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
133.divmtqspfslpvslgeratinckssqsvlyrsnsknylawyqqkpgqapklliywast rksgvpdrfsasgsgtdftltisslqpedvadyyclqhysfpftfgpgtkvglr seq idno:18。
134.在一些实施方式中，该抗体3i15的重链可变区氨基酸序列如seq id no:27所示，或该 序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
135.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlssygmswvrqapgkglewvsglgysgds iyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraadtavyycarlwvasggddywgqgtlvtv ss seq id no:27
136.且
137.该抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:28所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
138.eivltqspatlslspgeratlscrasqsvshylawfqqksgqaprlliydtskratgtpa tfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsiwpltfgggtkleik seq id no:28。
139.在一些实施方式中，该抗体4e17的重链可变区氨基酸序列如seq id no:37所示，或该 序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；
140.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafstyamnwvrqapgkglewvsyissgssti yyansvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargrsyaladlpywgqgtlvtv ss seq id no:37
141.且
142.该抗体的轻链可变区氨基酸序列如seq id no:38所示，或该序列经替换、缺失或添加 一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列
143.diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliyeasslesgvp srfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsyssltfgggtkveik seq id no:38。
144.经elisa实验验证，本发明所述抗sar-cov-2全人源单克隆抗体可以靶向结合 sar-cov-2病毒的s蛋白。本发明所述抗体为全人源性单克隆抗体，相比鼠源抗体，全人源 抗体的基因完全来源于人的基因，没有其他种属的成分，在人体内不发生抗鼠抗抗体等毒副 作用，具有更好的生物相容性，更适合和更有潜力成为治疗流感病毒的大分子药物。
145.另一方面，本发明提供编码本发明所述的抗sar-cov-2全人源单克隆抗体的基因。在一 些实施方式中，所述基因包含编码具有上述所示的氨基酸的核苷酸序列。
146.在一些具体实施方式中，该核苷酸序列如下所示(以下序列仅为示例性，本领域技术人 员根据具体的氨基酸序列，可以设计其他可以翻译为所需氨基酸序列的核苷酸序列)：
147.编码抗体2e5重链可变区的核苷酸序列为：
148.caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtagtaaatcctat gcagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagcgacgattccaagaatatattgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacg gctgtctattactgtgcgagagatccaaagacaacggtgactacaaaaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca seq id no：9
149.编码抗体2e5轻链可变区的核苷酸序列为：
150.tcgtctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagactctattatgcaaactggtaccaacagaagccaggacaggcccctctacttgtcatctatgataaagacaaccggccctcagggatcccagaccgattct ctggctccagctcaggaagcacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatctgggggttctcttcggcggcgggaccaagctgaccgtcacagta seq id no：10。
151.编码抗体2i3重链可变区的核苷酸序列为：
152.gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcctggtgcagccgggggggtccctgagactctcctgtgtcgcctctggattcacctttagcaaccatgccatgacgtgggtccgccaggctccaggaaagggactggattgggtctcaactataagcggcagtgatggaagcgcaaattacg cagactccgtgaagggccgggttatcatctccagagacaattccaagaacacactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacgg ccgtatattactgtgcgagggggaattgggagagttcttatgccttctgtgataactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no：19
153.编码抗体2i3轻链可变区的核苷酸序列为：
154.gacatcgtgatgacccagtctccattctccctgcctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacaggtccaacagtaagaactacttagcttggtatcagcagaaaccaggacaggctcctaagttgctcatttactgggcctctacccgtaaatcc ggggtccctgaccgattcagtgccagcgggtctgggacagatttcactctcaccataagcagcctgcaacctgaggatgtggcagattattactg ccttcaacattatagttttcctttcacttttggccctgggaccaaagtgggcctcaga seq id no：20。
155.编码抗体3i15重链可变区的核苷酸序列为：
156.gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtcccttagactctcctgtgcagcctctggattcacccttagttcctatggcatgagttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggccttggttatagtggtgatagtatatactacgcag actccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgagagccgcggacacggcc gtatattattgtgcgagactttgggtcgcaagtggtggagatgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no： 29
157.编码抗体3i15轻链可变区的核苷酸序列为：
158.gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtcgttgtctccaggggagagagccaccctctcctgcagggccagtcagagtgttagccactacttagcgtggtttcaacagaaatctggccaggctcccaggctcctcatctatgatacatccaagagggccactggcaccccagc cacattcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcggtttattactgccagcagcgtagcatctggcctctcactttcggcggagggaccaaactggagatcaaa seq id no：30。
159.编码抗体4e17重链可变区的核苷酸序列为：
160.gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgc
agcctctggattcgccttcagtacctatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtggtagtagtaccatatactacgcaa actctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctg tgtattactgtgcgagaggtcggagttacgcattagctgacttgccgtactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no：39
161.编码抗体4e17轻链可变区的核苷酸序列为：
162.gacatccagatgacccagtctccatccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagagtattagtagctggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgaggcgtctagtttagaaagtggggtcccatcaaggt tcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgactttgcaacttattactgccaacagtataatagttattcttcgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacga seq id no：40。
163.本发明抗体的重链可变区和轻链可变区序列中，其中下划线部分区域中的显示的是cdr 区。
164.另一方面，本发明提供含如上所述基因的载体。
165.再一方面，本发明提供含如上所述基因或如上所述载体的细胞。
166.再一方面，本发明提供一种产生所述抗sar-cov-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆 抗体的能够特异性结合sar-cov-2的生物活性片段的方法，该方法包括培养含编码抗 sar-cov-2全人源单克隆抗体的重轻链的上述基因或上述载体的基因工程细胞或直接培养 上述细胞，收集，纯化得所述抗sar-cov-2全人源单克隆抗体。
167.现有技术中存在采用噬菌体展示技术制备抗sar-cov-2病毒人源单克隆抗体的方法，尽 管该方法具有生产成本低、不经过免疫和细胞融合等繁琐工作的优点，但是其缺点也比较明 显，从非免疫抗体库中获得的抗体往往亲和力不足、受外源基因转化率的限制、抗体库的库 容量不足以涵盖动物的抗体多样性等。本发明从病人的血液中分离分泌功能抗体的b细胞， 然后提取rna和合成cdna，从中克隆分泌目的抗体的基因，最后重组和表达全人源单克隆 抗体。该技术操作简单快捷，生产的人源抗体具有高亲和力和特异性，此外，可进一步采用 改进的从记忆b细胞中分离具有中和病毒功能或杀伤肿瘤功能的本发明所述单克隆抗体技 术，更是大大减少了繁琐操作和成本。
168.另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含本发明所述的抗sar-cov-2全人源单克 隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合sar-cov-2的生物活性片段。
169.另一方面，本发明提供所述的抗sar-cov-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的 能够特异性结合sar-cov-2的生物活性片段或所述的药物组合物在制备用于治疗由 sar-cov-2病毒引起的疾病的药物中的应用。
170.另一方面，本发明提供一种检测sar-cov-2病毒水平的试剂盒，其含有本发明所述的抗sar-cov-2全人源单克隆抗体或来源于该单克隆抗体的能够特异性结合sar-cov-2的生物 活性片段；在一些实施方式中，所述的试剂盒还含有第二抗体和用于检测的酶或荧光或放射 标记物，以及缓冲液；所述第二抗体例如为抗本发明所述单克隆抗体的抗抗体。
171.为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现结合具体实施例对本 发明的技术方案进行以下详细说明，应理解这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明 的范围。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方
法为所属领域 熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
172.实施例1
173.(1)构建稳定表达cd40l的nth-3t3细胞系(3t3-cd40l)
174.利用慢病毒建立3t3-cd40l饲养细胞。构建慢病毒表达载体plvx-cd40l，转染293t 细胞，转染第四天收集病毒上清液。活化nih-3t3细胞，培养3代后用慢病毒感染，继续培 养并传代3次。利用流式细胞仪进行分选fitc荧光强度在mfi附近的细胞，重新加入至培 养瓶中，37℃，5％co2培养箱中培养和检测，其是将表达cd40l的3t3细胞和空载体plvx(带 有zxgreen)转染的3t3细胞分别用带有apc的抗cd40l染色，然后上流式细胞仪分析。结 果发现，所有3t3-cd40l饲养细胞都表达cd40l。当细胞长到80％～90％时，消化收集细胞， 浓度为每毫升1
×
107细胞。置于辐射仪中进行5000rads辐射，冻存液重悬细胞，浓度为每毫 升3.5
×
107细胞，分装1ml在冷冻小管，液氮冻存(可以保存2年)。
175.(2)记忆b细胞的分选和活化
176.用淋巴分离液分离和冻存曾经感染sar-cov-2病毒的康复病人的pbmc，每管 10～50
×
106细胞，冻存在液氮罐中。配制pbmc流式染色液，其成分如下表1所示
177.表1 pbmc流式染色液
178.抗体体积(μl)cd19-pe-cy70.5igm-pe1.0iga-apc2.5igd-fitc2.5pbs-1％(wt/vol)bsa43.5
179.解冻pbmc，加入上述pbmc流式染色液并在流式细胞仪上分选，分选出cd19
+ igm
–
iga
–
igd
–
的记忆b细胞，细胞纯度需在90％以上，若低于90％，重复分选过程。配制 激活b细胞的混合培养基，如下表2所示：
180.表2
181.组分体积完全imdm培养基336mlil-2(10,000u ml-1
)3.5mlil-21(100μg ml-1
)175μl步骤(1)中得到的3t3-cd40l10ml
182.将记忆b细胞加入到混合培养基中，混匀后有限稀释在384孔板，每孔1个细胞，体积 为50μl，置于37℃，5％co2培养箱中静置培养。13天后，取上清液进行elisa，获得人源 单克隆抗体。
183.(3)人源单克隆抗体结合sar-cov-2病毒的表面抗原s蛋白实验
184.表面抗原s蛋白购自义翘神州公司，具有免疫原性，抗s蛋白抗体可以sar-cov-2流 感病毒。对上述获得的上清液人源单克隆抗体进行elisa实验，具体地：
185.(1)将100ng/100μl的sar-cov-2病毒的ha蛋白包被在96孔酶标板中，每孔100μl；
186.(2)放置4℃冰箱过夜；
187.(3)用pbst溶液洗涤三遍，每孔加5％的脱脂奶粉溶液200μl，37℃孵育1小时；
188.(4)用pbst溶液洗涤三遍，加100μl没有感染病毒的正常人血清(阴性对照)或上清 液，各三个重复；
189.(5)37℃孵育1小时后用pbst溶液洗涤三遍；
190.(6)以1:5000稀释带hrp的抗人igg抗体(abcam)，加入酶标版中，每孔100μl；
191.(7)37℃孵育1小时后用pbst溶液洗涤三遍；
192.(8)每孔加100μl tmb底物溶液(thermo scientific)，37℃5分钟；
193.(9)每孔加终止溶液2m硫酸100μl，立刻在酶标仪中450nm波长检测吸光值。其结 果如图1所示，elisa实验表明本发明获得的人源单克隆抗体可以靶向结合sar-cov-2病 毒的s蛋白。
194.实施例2人源化单克隆抗体基因的克隆
195.将实施例1获得的能够分泌结合sar-cov-2病毒的抗体的b细胞进行裂解，取裂解液 进行rna的反转录，获得人源抗体基因的pcr模板cdna。设计和合成克隆抗体基因的引 物，以cdna为模板克隆抗体的重链和轻链的基因，并且送金唯智公司测序。具体地：
196.(1)将裂解后的b细胞液转移至96孔板(eppendorf，030133366)。
197.(2)反转录体系：150ng随机引物(invitrogen,48190-011),0.5μl 10mm dntp(invitrogen, 18427-088),1μl 0.1m dtt(invitrogen,18080-044),0.5％v/v igepal ca-630(sigma, i3021-50ml),4u rnasin(promega),6u prime rnase inhibitor(eppendorf)and 50u iii reverse transcriptase(invitrogen,18080-044)，补depc水至14μl/孔。
198.(3)反转录反应程序：42℃，10min；25℃，10min；50℃，60min；94℃，5min。
199.(4)cdna保存在-20℃。
200.(5)引物的设计和合成:
201.(6)用kod-plus-neo(toyobo，kod401)试剂盒pcr分别扩增抗体基因的重链 和轻链，40μl体系：3.5μl cdna，20nm混合引物，4μl缓冲液(buffer)，4μl 2mm dntps， 2.4μl mgso4，1μl kod。
202.(7)反应程序：94℃，2min；45个循环：98℃，10s；58℃，30s；68℃，28s。
203.(8)对扩增产物进行琼脂糖凝胶。
204.(9)抗体基因重链可变区pcr产物测序结果如下，其中：
205.抗体2e5的重链可变区核苷酸序列为如seq id no:9所示序列：
206.caggtgcagctggtggagtctgggggaggcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagtacctatggcatgcactgggtccgccaggctccaggcaaggggctggagtgggtggcagttatatggtatgatggaagtagtaaatcctat gcagactccgtgaagggccgattcaccgtctccagcgacgattccaagaatatattgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacg gctgtctattactgtgcgagagatccaaagacaacggtgactacaaaaatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctca seq id no：9；
207.抗体2e5重链可变区氨基酸序列为如seq id no:7所示序列:
208.qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfstygmhwvrqapgkglewvaviwydgssksyadsvkgrftvssddsknilylqmnslraedtavyycardpkttvttkmdvwgqgtt vtvss seq id no：7；
209.抗体2e5轻链可变区核苷酸序列为如seq id no:10所示序列，
210.tcgtctgagctgactcaggaccctgctgtgtctgtggccttgggacagacagtcaggatcacatgccaaggagacagcctcagactctattatgcaaactggtaccaacagaagccaggacaggcccctctacttgtcatctatgataaagacaaccggccctcagggatcccagaccgattct ctggctccagctcaggaagcacagcttccttgaccatcactggggctcaggcggaagatgaggctgactattactgtaactcccgggacagcagtggtaaccatctgggggttctcttcggcggcgggaccaagctgaccgtcacagta seq id no：10；
211.抗体2e5轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:8所示序列
212.sseltqdpavsvalgqtvritcqgdslrlyyanwyqqkpgqapllviydkdnrpsgipd rfsgsssgstasltitgaqaedeadyycnsrdssgnhlgvlfgggtkltvt seq id no：8。
213.抗体2i3的重链可变区核苷酸序列为如seq id no:19所示序列：
214.gaggtgcagctgttggagtctgggggaggcctggtgcagccgggggggtccctgagactctcctgtgtcgcctctggattcacctttagcaaccatgccatgacgtgggtccgccaggctccaggaaagggactggattgggtctcaactataagcggcagtgatggaagcgcaaattacg cagactccgtgaagggccgggttatcatctccagagacaattccaagaacacactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaagacacgg ccgtatattactgtgcgagggggaattgggagagttcttatgccttctgtgataactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no：19；
215.抗体2i3重链可变区氨基酸序列为如seq id no:17所示序列
216.evqllesggglvqpggslrlscvasgftfsnhamtwvrqapgkgldwvstisgsdgs anyadsvkgrviisrdnskntlylqmnslraedtavyycargnwessyafcdnwgqgtlv tvss seq id no:17；
217.抗体2i3轻链可变区核苷酸序列为如seq id no:20所示序列，
218.gacatcgtgatgacccagtctccattctccctgcctgtgtctctgggcgagagggccaccatcaactgcaagtccagccagagtgttttatacaggtccaacagtaagaactacttagcttggtatcagcagaaaccaggacaggctcctaagttgctcatttactgggcctctacccgtaaatcc ggggtccctgaccgattcagtgccagcgggtctgggacagatttcactctcaccataagcagcctgcaacctgaggatgtggcagattattactg ccttcaacattatagttttcctttcacttttggccctgggaccaaagtgggcctcaga seq id no：20；
219.抗体2i3轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:18所示序列
220.divmtqspfslpvslgeratinckssqsvlyrsnsknylawyqqkpgqapklliywast rksgvpdrfsasgsgtdftltisslqpedvadyyclqhysfpftfgpgtkvglr seq idno:18。
221.抗体3i15的重链可变区核苷酸序列为如seq id no:29所示序列：
222.gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtcccttagactctcctgtgcagcctctggattcacccttagttcctatggcatgagttgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtctcaggccttggttatagtggtgatagtatatactacgcag actccgtgaagggccggttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctccaaatgaacagcctgagagccgcggacacggcc gtatattattgtgcgagactttgggtcgcaagtggtggagatgactactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no： 29；
223.抗体3i15重链可变区氨基酸序列为如seq id no:27所示序列
224.evqlvesggglvqpggslrlscaasgftlssygmswvrqapgkglewvsglgysgds iyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraadtavyycarlwvasggddywgqgtlvtv ss seq id no:27；
225.抗体3i15轻链可变区核苷酸序列为如seq id no:30所示序列，
226.gaaattgtgttgacacagtctccagccaccctgtcgttgtctccaggggagagagccaccctctcctg
cagggccagtcagagtgttagccactacttagcgtggtttcaacagaaatctggccaggctcccaggctcctcatctatgatacatccaagagggccactggcaccccagc cacattcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctagagcctgaagattttgcggtttattactgccagcagcgtagcatctggcctctcactttcggcggagggaccaaactggagatcaaa seq id no：30；
227.抗体3i15轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:28所示序列。
228.eivltqspatlslspgeratlscrasqsvshylawfqqksgqaprlliydtskratgtpa tfsgsgsgtdftltisslepedfavyycqqrsiwpltfgggtkleik seq id no:28。
229.抗体4e17的重链可变区核苷酸序列为如seq id no:39所示序列：
230.gaggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtacagcctggggggtccctgagactctcctgtgcagcctctggattcgccttcagtacctatgccatgaactgggtccgccaggctccagggaaggggctggagtgggtttcatacattagtagtggtagtagtaccatatactacgcaa actctgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaactcactgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggacacggctg tgtattactgtgcgagaggtcggagttacgcattagctgacttgccgtactggggccagggaaccctggtcaccgtctcctca seq id no：39；
231.抗体4e17重链可变区氨基酸序列为如seq id no:37所示序列
232.evqlvesggglvqpggslrlscaasgfafstyamnwvrqapgkglewvsyissgssti yyansvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycargrsyaladlpywgqgtlvtv ss seq id no:37；
233.抗体4e17轻链可变区核苷酸序列为如seq id no:40所示序列，
234.gacatccagatgacccagtctccatccaccctgtctgcatctgtaggagacagagtcaccatcacttgccgggccagtcagagtattagtagctggttggcctggtatcagcagaaaccagggaaagcccctaagctcctgatctatgaggcgtctagtttagaaagtggggtcccatcaaggt tcagcggcagtggatctgggacagaattcactctcaccatcagcagcctgcagcctgatgactttgcaacttattactgccaacagtataatagttattcttcgctcactttcggcggagggaccaaggtggagatcaaacga seq id no：40；
235.抗体4e17轻链可变区的氨基酸序列如seq id no:38所示序列
236.diqmtqspstlsasvgdrvtitcrasqsisswlawyqqkpgkapklliyeasslesgvp srfsgsgsgteftltisslqpddfatyycqqynsyssltfgggtkveik seq id no:38。
237.对应地，各抗体的cdr区序列如下所示：
238.抗体2e5
239.2e5-hcdr1：gftfstyg seq id no：1；
240.2e5-hcdr2：iwydgssk seq id no：2；
241.2e5-hcdr3：ardpkttvttkmdv seq id no：3；
242.2e5-lcdr1：slrlyy seq id no：4；
243.2e5-lcdr:2：dkd seq id no：5；以及
244.2e5-lcdr3：nsrdssgnhlgvl seq id no：6；
245.或者
246.抗体2i3
247.2i3-hcdr1：gftfsnha seq id no：11；
248.2i3-hcdr2：isgsdgsa seq id no：12；
249.2i3-hcdr3：argnwessyafcdn seq id no：13；
250.2i3-lcdr1：qsvlyrsnskny seq id no：14；
251.2i3-lcdr:2：was seq id no：15；以及
252.2i3-lcdr3：lqhysfpft seq id no：16；
253.或者
254.抗体3i15
255.3i15-hcdr1：gftlssygseq id no：21；
256.3i15-hcdr2：lgysgdsi seq id no：22；
257.3i15-hcdr3：arlwvasggddy seq id no：23；
258.3i15-lcdr1：qsvshy seq id no：24；
259.3i15-lcdr:2：dts seq id no：25；以及
260.3i15-lcdr3：qqrsiwplt seq id no：26；
261.或者
262.抗体4e17
263.4e17-hcdr1：gfafstya seq id no：31；
264.4e17-hcdr2：issgssti seq id no：32；
265.4e17-hcdr3：argrsyaladlpy seq id no：33；
266.4e17-lcdr1：qsissw seq id no：34；
267.4e17-lcdr:2：eas seq id no：35；以及
268.4e17-lcdr3：qqynsysslt seq id no：36。
269.上述结果显示上清液中含有能够结合sar-cov-2病毒的抗体。
270.最后说明的是：以上实施例仅用于说明本发明的实施过程和特点，而非限制本发明的技术方 案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解：依然 可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换， 均应涵盖在本发明的保护范围当中。