一种具有抗前列腺癌活性的四氢喹啉生物碱及其制备方法和应用与流程

技术领域：

本发明属于天然产物领域，具体涉及微生物天然产物的分离纯化及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：
：

前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤,居全世界男性癌症死亡原因的第二位，为我国泌尿外科中发病率最高的肿瘤。病率最高的肿瘤。内分泌治疗为前列腺癌主要治疗方法，但经过中位时间14-30个月后，几乎所有患者都将转变为去势抗性前列腺癌(crpc)。尽管二代雄激素受体(androgenreceptor,ar)靶向药物如恩杂鲁胺等在治疗crpc中取得突破，但患者接受治疗后几乎不可避免的对其产生耐药性，造成临床治疗crpc的失败。天然产物是创新药物研究的重要源泉，1981～2019这三十九年间，全世界共推出的1394种小分子新药中有三分之二可追溯到天然产物，或受天然产物启迪，而在185个抗癌小分子药物中有84％与天然产物相关。微生物代谢产物是天然产物的重要组成部分，也是抗癌药物的重要来源之一，如阿霉素、放线菌素d及博莱霉素等，均是来源于微生物的次生代谢产物及其衍生物。海洋特殊的环境造就了海洋微生物的特殊性和多样性，赋予了海洋微生物天然产物结构的多样性和复杂性，为海洋药物的研究提供了重要的生物资源和化合物的来源。

因此，在海洋微生物中筛选发现新的具有抗肿瘤活性的天然产物对于抗前列腺癌药物研发具有重要意义。

技术实现要素：
：

本发明的第一个目的是提供一种具有抗前列腺癌活性的四氢喹啉生物碱类化合物。

本发明的四氢喹啉生物碱类化合物，其结构如式(ⅰ)：

本发明人通过对一株海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561摇床放大发酵和发酵提取物提取纯化，从中得到化合物1。经结构分析，其被确定为含氯四氢喹啉生物碱类化合物，具体结构如式(ⅰ)所示。通过对化合物1的抗肿瘤活性评价，发现化合物1对两种人前列腺癌细胞c4-2b和22rv1都具有显著的抑制作用(ic50均<0.28μm)，尤其是化合物1对人前列腺癌细胞c4-2b的ic50达到了0.067μm，可以做为抗前列腺癌药物开发的先导化合物。

因此，本发明的第二个目的是提供如式(i)所示的四氢喹啉生物碱或其药用盐在制备抗前列腺癌药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种抗前列腺癌药物，包括有效量的作为活性成分的如式(i)所示的四氢喹啉生物碱或其药用盐，和药学上可以接受的载体。

本发明的第四个目的是提供一种上述四氢喹啉生物碱的制备方法，是从海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561的发酵培养物中分离得到的。

优选，包括以下步骤：

a、制备海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561的发酵培养物；

b、分离发酵液和菌丝体，将发酵液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩得发酵液浸膏；菌丝体经丙酮水溶液浸提，提取液经浓缩后，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩得菌丝体浸膏；合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏，用反相硅胶分离，采用甲醇：水从10:90,20:80,30:70,50:50,70:30,80:20,90:10,100:0,v/v梯度洗脱顺序得8个组分fr1-fr8，收集甲醇：水80：20v/v洗脱的组分fr6，经sephadexlh-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后的产物，经高效液相纯化得到四氢喹啉生物碱。

优选，所述的制备海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561的发酵培养物是将海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561接种到发酵培养基中培养，所述的发酵培养基每1000ml含有：葡萄糖20g，酵母膏10g，牛肉膏3g，玉米浆3g，可溶性淀粉10g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙2g，余量为水。

所述的经高效液相纯化是以210和330nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水＝75:25,v/v进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，hplc(ymc-packods-a,10×250mm,5μm)，于保留时间tr33.9min得到四氢喹啉生物碱。

本发明的第五个目的是提供海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561在制备上述四氢喹啉生物碱中的应用。

本发明从海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561中制备得到一个具有抗前列腺肿瘤活性的化合物1，可用于开发抗前列腺肿瘤药物，因此本发明不仅为开发新的抗前列腺肿瘤药物提供了备选化合物，同时对开发中国海洋微生物药物资源具有重要的意义。

本发明的链霉菌streptomycessp.hnm0561于2020年06月30日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，武汉大学，保藏编号：cctccno：m2020255。

附图说明：

图1：malaymycin(1)主要的¹h-¹hcosy，hmbc和noesy信息；

图2：malaymycin(1)的ecd图谱

图3.不同浓度下malaymycin(1)对两种前列腺癌细胞株(c24b和22rv1)的增殖抑制活性

图4.malaymycin(1)对c42b细胞周期阻滞作用

图5.malaymycin(1)显著抑制前列腺肿瘤细胞中ar基因的表达

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：化合物1的制备和结构鉴定

一、如式(ⅰ)所示的化合物1的制备

1.微生物培养条件：

每1000ml培养基是这样配制的：取葡萄糖20g，酵母膏10g，牛肉膏3g，玉米浆3g，可溶性淀粉10g，磷酸氢二钾0.5g，硫酸镁0.5g，碳酸钙2g，然后溶于适量的水中，用水定容至1000ml，121℃高温灭菌20min，备用。

将海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养3天，得种子培养液，再将种子培养液按照1％的体积比接种到上述培养基中，28℃条件下摇床培养11天，得到海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561的发酵产物。

2.提取分离：

将上述海洋链霉菌streptomycessp.hnm0561的发酵产物，以3600rpm离心，得上清发酵液和沉淀菌丝体。上清发酵液用乙酸乙酯等体积萃取3次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃减压浓缩得发酵液浸膏；沉淀菌丝体用85％的丙酮水溶液超声浸提，提取液经减压蒸馏后，再用乙酸乙酯反复萃取三次，乙酸乙酯萃取液在低于40℃下减压浓缩得菌丝体浸膏；合并发酵液浸膏和菌丝体浸膏共计得约27.6g浸膏。该浸膏用反相硅胶分离，经拌样、干法装柱后，采用甲醇：水(10:90,20:80,30:70,50:50,70:30,80:20,90:10,100:0,v/v)梯度洗脱顺序得8个组分(fr1-fr8)。组分fr6(甲醇：水80：20v/v洗脱的组份)经sephadexlh-20柱层析，以甲醇为洗脱剂，洗脱纯化后的产物，以210和330nm波长做检测、采用4ml/min的流速，以乙腈：水(75:25,v/v)进行等梯度洗脱进行半制备高效液相分离，hplc(ymc-packods-a,10×250mm,5μm)，得到新化合物1(3.3mg，保留时间tr33.9min)。

二、化合物1的结构鉴定

对化合物1进行质谱(ms)、核磁共振(nmr)、旋光(or)和圆二色谱(cd)等数据测试，从而确定化合物的化学结构。

化合物1:白色无定型粉末；高分辨质谱hresimsm/z445.1906[m–h]^–(calcdforc24h30cln2o4),建议分子式为c24h31cln2o4，不饱和度为10；¹h和¹³cnmr数据见表1；一维核磁数据显示分子中含有24个碳原子，其中包括3个甲基，1个甲氧基，6个亚甲基，4个次甲基，10个季碳。芳香质子h-5(δh6.56,d,j＝9.0hz)、h-6(δh7.55,d,j＝9.0hz)和h-2(δh7.56,s)推测分子中存在一个1,3,4-三取代苯环片段；¹h-¹hcosy谱图中显示有一个相邻的亚甲基8-ch2和次甲基9-ch片段，结合在hmbc谱图中观察到h-5与c-1、c-3，h2-8与c-2、c-3、c-4、c-9和c-10，以及4-nh与c-3、c-4、c-5、c-9的碳氢相关，可以推测出分子中存在一个四氢喹啉片段；从两个亚甲基h2-11[δh1.81(m,ha-11),1.62(m,hb-11)]和h2-12[δh2.08(m,ha-12),2.00(m,hb-12)]和三个烯丙基甲基h3-15(δh1.61,s)，h3-16(δh1.63,s)，h3-18(δh1.61,s)到两个烯烃季碳c-13(δc126.6)和c-14(δc125.0)的hmbc相关揭示了2,3-二甲基戊-2-烯片段；观察到h2-11与c-9和c-10以及h2-17与c-10的hmbc相关信号，表明2,3-二甲基戊-2-烯和连有甲氧基的亚甲基17-ch2都是连在四氢喹啉的c-10位；在二维核磁谱图中观察到亚甲基氢h2-3'与c-1'，c-5'，h2-4'与c-1'，c-2'，c-5'以及活泼氢2'-oh与c-1'，c-2'，c-3'的hmbc交叉峰，表明在c-3'处存在一个含有羟基取代的环戊-2-烯酮片段；结合高分辨质谱以及c-9的化学位移，推测cl原子连接在c-9位。通过noesy谱图可以确定化合物1的相对构型，h-9与h2-11之间的noe相关，表明它们在分子平面的同侧。进一步我们通过ecd计算，确定了化合物1的绝对构型是9s和10s。经scifinder检索，化合物1为结构崭新的化合物，命名为malaymycin。化合物1主要的¹h-¹hcosy、hmbc和noesy信息见图1，化合物1的ecd图谱见图2。

表1.malaymycin(1)的核磁共振谱数据(700mhz,cdcl3,ppm)

化合物1的结构式如式(i)所示，命名为malaymycin：

实施例2：malaymycin(1)对两株人源前列腺癌细胞的抑制活性

人源前列腺癌细胞c4-2b订购于优莱科公司(urocorinc.oklahomacity,ok,usa)；人源前列腺癌细胞22rv1订购于美国模式培养物集存库(americantypeculturecollection,manassas,va,usa).

人源前列腺癌细胞抑制活性实验采用cck-8检测法。用rpmi1640培养基进行培养，收集对数生长期细胞，计数，重新悬浮细胞，调整细胞浓度至合适浓度，接种96孔板(每孔500–1000个细胞)，每孔加100μl细胞悬液。细胞在37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育24小时。用培养基将待测化合物稀释至合适的作用浓度，按50μl/孔加入细胞。对于c4-2b和22rv1细胞，化合物1(malaymycin)和阳性对照药(恩杂鲁胺，enzalutamide)的作用终浓度从40μm开始，2倍梯度稀释，9个浓度点。细胞置于37℃，100％相对湿度，5％co2培养箱中孵育72小时。吸弃培养基，加入含10％cck-8的新鲜完全培养基置于37℃培养箱中孵育2-4小时。轻轻震荡后在spectramaxm5microplatereader上测定450nm波长处的吸光度，以650nm处吸光度作为参比，计算抑制率。每个样品3个重复。

按下式计算化合物对前列腺癌细胞生长的抑制率：

癌细胞生长抑制率％＝[(ac-as)/(ac-ab)]×100％

as:样品的吸光度oa(细胞+cck-8+待测化合物)

ac:阴性对照的吸光度oa(细胞+cck-8+dmso)

ab:阳性对照的吸光度oa(培养基+cck-8+dmso)

运用软件graphpadprism5并采用计算公式log(inhibitor)vs.normalizedresponse进行ic50曲线拟合并计算出ic50值。

malaymycin(1)对两株前列腺癌细胞(c24b和22rv1)和一株小细胞肺癌细胞(h446)的增殖抑制作用见表2：

表2.malaymycin(1)的对三种肿瘤细胞株的增殖抑制作用(ic50,μm)

通过对四氢喹啉类生物碱新化合物1的体外抗前列腺癌活性评价(图3)，发现四氢喹啉类生物碱新化合物1对两种人前列腺癌细胞c4-2b和22rv1具有显著的抑制活性(ic500.067和0.028μm)，体外活性显著高于阳性药enzalutamide(ic5018.26和37.6μm)。

由于作为新天然产物的四氢喹啉类生物碱新化合物1对c4-2b和22rv1细胞的显著抑制活性，本发明进一步研究低毒剂量(0.3μm)下的四氢喹啉类生物碱新化合物1对前列腺肿瘤c4-2b细胞周期的阻滞作用。图4显示0.3μm下新化合物1对c4-2b细胞作用72小时后，细胞g0/g1期的比例从41.62％上升到56.11％。因此，推测新化合物1对人前列腺癌c4-2b细胞周期的作用是阻滞在g0/g1期。

蛋白质印迹westernblotting和荧光定量qrt-pcr实验结果表明，malaymycin(1)在蛋白质和rna水平上均以剂量依赖的方式显著地抑制crpc细胞中二代雄激素受体(androgenreceptor,ar)的表达，同时还抑制了ar的靶基因klk3和klk2的基因表达进而抑制了ar信号通路(图5)。表明四氢喹啉类生物碱新化合物1可以通过抑制ar基因表达及其信号通路发挥抗前列腺肿瘤作用。

因此，基于四氢喹啉类生物碱新化合物1对两种人前列腺癌细胞c24b和22rv1显著的抑制活性，可以做为抗前列腺癌药物开发的先导化合物。综上，本发明为研制新的抗癌药物提供了新的候选化合物，对中国自主知识产权的海洋抗肿瘤新药开发具有重要的意义。