本发明属植物生物技术领域。涉及一种植物开放组培方法及专用培养基，具体涉及在植物开放组培中瓶口敞开培养以改善瓶苗气体微环境的方法。
背景技术：
植物组织培养技术种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。近年引起广泛关注的植物开放式组织培养（开放组培），是在培养基添加抗菌剂，不需高压灭菌，在开放环境(不需超净台)接种,加盖常规培养。开放组培在提高操作效率、降低组培成本意义重大，相关论文（刘福平.植物抗菌组培中抗菌剂应用的研究方法.基因组学与应用生物学，2014，33（4）：910-915，前言）和专利申请日益增多，如申请号200810047258.1、200910060484.8、200910088122.x、201010257107.6、201110195928.6、201110410305.6、201110134608.x、201110311185.4、201310238845.x、201310204499.3、201410097129.9、201510151118.9、201510933918.6、201610696644.8、201710207906.4、201911177574.5、202010698173.0等。
传统组培“组培苗是在密闭的试管或玻璃瓶中培养，由于容器内湿度过高、co2亏缺，致使培养出的小植株体不能正常地进行光合作用，而不得不依靠培养基中的糖进行异养生长，造成培养时间过长，小植株体生长缓慢，植株长势瘦弱，移栽成活率低；培养基中的糖还会促进微生物的繁殖，加大植株的污染率；容器内的环境异常，如有害气体增加，温度较高，湿度较大，会造成植株叶片少、徒长、玻璃化，难于移栽，或植株发育迟缓，驯化阶段植株死亡率高等”[马明建，宋越冬.基于环境控制的组培苗无糖培养系统.农业工程学报，2009,25（6）:192-197]。开放组培苗也是在密闭容器中培养，所得瓶苗同样存在上述缺陷。
“常规培养条件下的试管苗气孔密度比较大,功能不完善,在移栽驯化过程中很难适应外界环境,使光合能力降低,而且容易出现过度失水等问题,直接影响试管苗的移栽成活率。……移栽初期试管苗的气孔开度最大,蒸腾速率达到峰值,试管苗处于失水最快的状态。”（孙冬青等.组培微环境对葡萄风信子组培苗生长及移栽后生理特性的影响.西北农业学报，2008,17(4):244-248,262）。
开放组培中，培养基微生物污染来自培养基自身所夹杂的微生物和瓶内空间微生物沉降到培养基，开放组培的抗菌剂溶解在琼脂培养基内，只对培养基部分抗菌，并不针对瓶内空间的微生物，以致培养基所附加抗菌剂必须保持在较高的浓度，难免对所培养植物材料产生毒副作用，这对矛盾是开放式组培的技术难点(关键)，限制了开放式组培的广泛应用。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种植物开放培养方法及专用培养基，接种外植体后，瓶口敞开培养以改善瓶苗气体微环境的方法。
本发明的技术方案如下：
一种植物开放培养方法，在配制开放组培培养基时，培养基各组分、琼脂、抗菌剂和水加热完全融化后，调酸碱度，分装到培养瓶，在培养瓶内投入氧气缓释颗粒，不加瓶盖，用干净薄膜或面板覆盖瓶口，平放冷却凝固。按常规开放组培方法接种芽苗外植体，在培养基表面灌注一层非挥发性油性液体，厚0.2-0.5cm，培养瓶不加瓶盖,敞口平放培养。
所述的氧气缓释颗粒材料由填充剂、胶黏剂和释氧剂混合，均预先冷杀菌处理，填充剂：胶黏剂：释氧剂重量比为1:0.2：0.2-0.8，加冰水造粒，粒径0.3-0.8cm，无菌条件冷冻保存。氧气缓释颗粒在每100ml培养基投放10-25粒。
所述填充剂为高岭土和珍珠岩等体积混合，所述的胶黏剂为羧甲基纤维素或聚醋酸乙烯，所述的释氧剂为过碳酸钠（na2co3·3h2o2）、过硼酸钠（nabo3·4h2o）的至少一种。
所述挥发性油性液体为液体石蜡或甲基硅油。
本发明还提供一种植物开放组培的专用培养基，所述的培养基含常规组分、琼脂和抗菌剂，琼脂培养基内含氧气缓释颗粒，表面灌注一层非挥发性油性液体。
所述的氧气缓释颗粒材料由填充剂、胶黏剂和释氧剂混合，填充剂：胶黏剂：释氧剂重量比为1:0.2：0.2-0.8，加冰水造粒，粒径0.3-0.8cm。氧气缓释颗粒在每100ml培养基投放10-25粒。
所述填充剂为高岭土和珍珠岩等体积混合，所述的胶黏剂为羧甲基纤维素或聚醋酸乙烯，所述的释氧剂为过碳酸钠（na2co3·3h2o2）、过硼酸钠（nabo3·4h2o）的至少一种。
本发明的原理和技术效果：
本发明培养基接种外植体后敞口培养导致技术问题是，较常规的加盖培养，由于培养瓶内湿度较低，培养基琼脂的水分与瓶内空间水汽压差较大，加快琼脂水分蒸发，可能导致根系供水不足而影响瓶苗生长。
本发明培养基表面的油层，防止琼脂水分蒸发保持培养基水分，油层阻隔瓶内空间杂菌沉降到培养基表面，免受污染。但油层也阻隔琼脂培养基与外界气体交换，降低培养基氧水平，所以在培养基投入氧气缓释颗粒，氧气在琼脂培养基内部溶解扩散，改善根部呼吸。
氧气缓释颗粒的释氧剂为过碳酸钠（na2co3·3h2o2）、过硼酸钠（nabo3·4h2o）释氧方程式分别为2na2co3·3h2o2=4naoh+2h2co3+2h2o+3o2和4(nabo3·4h2o)=na2b4o7+2naoh+4h2o2+11h2o，2h2o2=2h2o+o2。产生的o2渗透出颗粒排放到琼脂培养基中，当颗粒内部积累o2到一定压力，因膨胀使颗粒产生裂缝，也使颗粒内o2排放出来。
本发明瓶内空气湿度较低导致的另一问题是瓶苗蒸腾作用较大，以致瓶苗需从培养基吸收较多水分，这两种释氧剂释放氧气的反应还产生水分，可为琼脂培养基缓慢补充水分。
组织培养中随着培养时间延续，植物根部呼吸所释放的二氧化碳在培养基积累日益增多，co2+h2o=h2co3=h++hco3-1，使培养基过度酸化，破坏培养基酸碱平衡，影响根系生长。这两种释氧剂释放氧气的另一产物是naoh，oh-1能中和h+，缓解培养基过度酸化，不致明显影响根系生长和吸收功能。
本发明有益效果，（1）敞口培养，提高瓶内co2供应量以利瓶苗光合作用，得到健壮瓶苗，降低培养瓶内湿度，使瓶苗叶片的表皮角质层发达,增强气孔开闭功能，有利降低蒸腾作用，所以本发明能提高瓶苗移栽成活率。（2）提高瓶内co2水平有利光合作用，减少培养基碳源蔗糖供给，降低培养基污染率，此外，在培养基表面覆盖油层，阻隔瓶内空间的微生物沉降到培养基表明所造成的污染，培养基污染率降低可减少培养基抗菌剂使用量，减轻或消除抗菌剂对瓶苗的毒副作用，有利开放式组培技术的广泛适用。（3）敞口培养瓶苗较常规加盖培养蒸腾作用大，蒸腾作用大根部吸水多，释氧剂可为琼脂培养基补充水分。（4）释氧剂缓解培养后期培养基过度酸化，不致明显影响根系生长和吸收功能。（5）本发明组培操作过程瓶子均无需加盖，减少瓶盖材料投资，提高操作效率。
具体实施方法
实施例一
（一）方法
1.（1）对照组（常规开放组培）培养基制备，200ml培养瓶（圆柱状，底部直径6cm），培养基ms+naa0.2mg/l+蔗糖3%，琼脂0.6%，抗菌剂山梨酸钾0.3%和新洁尔灭0.1%（该抗菌剂浓度为开放组培培养基不发生微生物污染的最低浓度），与水混合煮沸至完全溶解，定容，调ph5.6，趁热分装到培养瓶，每瓶分装约25ml培养基，加盖，平放冷却凝固。
（2）氧气缓释颗粒制备，填充剂为高岭土和珍珠岩等体积混合，胶黏剂为羧甲基纤维素，释氧剂为过碳酸钠（na2co3·3h2o2），各原料均预先紫外线处理，填充剂：胶黏剂：释氧剂重量比1:0.2：0.4混合，加冰水造粒，粒径0.4cm，无菌条件冷冻保存。
处理组（本发明）专用培养基，培养瓶同对照，培养基ms+naa0.2mg/l+蔗糖1.5%，琼脂0.6%，抗菌剂山梨酸钾0.3%，煮沸至完全融化，定容，调ph5.6，趁热分装到培养瓶，每瓶分装约25ml培养基，在培养瓶内投入氧气缓释颗粒5粒，不加瓶盖，用干净面板覆盖，平放冷却凝固。
2.接种室喷70%酒精降尘，紫外灯照射20min，用70%的酒精将接种台面和手擦干净，培养基接种菊花（dendranthemamorifolium）芽苗（未明显长根，平均鲜重0.084g/株，平均叶数2.1片/株）外植体，每瓶接种12-14株，对照组加盖常规培养，处理组在培养基表面灌注一层液体石蜡，厚约0.3cm，培养瓶不加瓶盖，敞口平放培养。培养室内湿度65-80%。
3.培养30天，将对照组培养瓶的盖子打开，对照组、处理组培养瓶在温室练苗5天，瓶苗移栽入土，温室内常规管理。
（二）结果
1.处理组培养基山梨酸钾浓度与对照相同，少了新洁尔灭。培养30天，对照、处理组培养基表面、内部均未见有微生物菌落。
2.瓶苗生长指标见表。
表.菊花瓶苗生长、移栽情况
瓶苗净光合速率处理组较对照显著升高。处理组茎叶平均鲜重较重，与对照差异极显著，平均叶数处理组较对照多，差异显著。瓶苗成活率两组都是100%。
处理组根系平均鲜重较重，与对照差异显著，处理组平均根数较对照显著提高。蒸腾速率处理组较对照极显著低。出瓶移栽后1个月后，处理组苗成活率较对照组显著提高
3.出瓶移栽后1个月，处理组成活率较高，差异达极显著水平。
（三）结论
培养基表面覆盖油层阻隔瓶内空间微生物污染培养基，处理组培养基蔗糖量减半减少微生物繁殖营养，都可降低培养基污染率，所以本发明虽然降低培养基的抗菌剂使用量，培养后两组培养基均无污染。
茎叶平均鲜重处理组较重，平均叶数处理组较多，与处理组瓶苗敞口培养,加强光合作用促进生长有关。根系平均鲜重处理组较重，根数处理组较多，本发明可降低培养基的抗菌剂使用量，减轻了对根系的毒副作用。
菊花出瓶移栽后1个月，处理组成活率较高，与本发明瓶苗在较低湿度环境生长，蒸腾能力降低可减少植株移栽后蒸腾失水有关，也与本发明得到健壮小苗根系发达有关。
实施例二
（一）方法
1、（1）开放式组培培养基（对照组）制备，650ml兰花瓶（底部直径8cm，瓶口直径约4cm），培养基1/2ms+6-ba3ml/l+蔗糖3%+活性炭0.1%+琼脂0.6%。抗菌剂次氯酸钠0.3%+新洁尔灭0.2%（该抗菌剂浓度为开放组培培养基不发生微生物污染的最低浓度），与水混合加热至完全溶解，定容，调ph5.6，趁热分装到培养瓶，每瓶分装约100ml培养基，加盖，平放冷却凝固。
（2）氧气缓释颗粒制备，填充剂为高岭土和珍珠岩等体积混合，胶黏剂为聚醋酸乙烯，释氧剂为过硼酸钠（nabo3·4h2o），各原料均预先冷杀菌处理，填充剂：胶黏剂：释氧剂重量比为1:0.2：0.6混合，加冰水造粒，粒径0.6cm，无菌条件冷冻保存。
处理组（本发明开放式组培）专用培养基，培养瓶同对照，培养基1/2ms+6-ba3ml/l+1.5%蔗糖+0.1%活性炭+琼脂0.6%，抗菌剂次氯酸钠0.15%+新洁尔灭0.1%，煮沸至完全融化，定容，调ph5.6，趁热分装到培养瓶，每瓶分装约100ml培养基，在培养瓶内投入氧气缓释颗粒15粒，不加瓶盖，用干净薄膜覆盖，平放冷却凝固。
2.接种室喷70%酒精降尘，紫外灯照射20min，用70%的酒精将接种台面和手擦干净，打开瓶盖接种。培养基接种蝴蝶兰(phalaenopsisssp.)芽苗（平均鲜重0.215g/株，叶数2-3片，根1-2条，均短于0.5cm），每瓶接种16-18株，对照组加盖常规培养，处理组在培养基表面灌注一层甲基硅油，厚约0.4cm，培养瓶不加瓶盖，敞口平放培养。培养室内湿度65-80%。
3.培养90天，将对照组培养瓶的盖子打开，对照组、处理组培养瓶在温室练苗7天，瓶苗移栽无土基质，温室内常规管理。
（二）结果
1.处理组培养基抗菌剂浓度较对照减少一半。瓶内培养90天，对照、处理组培养基污染率各3.05±0.30%和3.58±0.23%，差异不显著。
2.瓶苗生长指标见表。
表.蝴蝶兰瓶苗生长、移栽情况
瓶苗净光合速率处理组较对照显著升高。处理组茎叶平均鲜重较重，与对照差异极显著，平均叶数处理组较对照多，差异显著。瓶苗成活率处理组较对照显著提高。
处理组根系平均鲜重较重，与对照差异显著，平均根数两组差异不显著。蒸腾速率处理组较对照极显著低。出瓶移栽后1个月后，处理组苗成活率较对照组极显著提高
（三）结论
培养基表面覆盖油层阻隔瓶内空间微生物污染培养基，处理组培养基蔗糖量减半减少微生物繁殖营养，都可降低培养基污染率，所以本发明虽然降低培养基的抗菌剂使用量，培养90天后两组培养基污染率差异不显著。
本发明敞口培养，茎叶平均鲜重处理组较重，平均叶数处理组较多，与加强光合作用，促进生长有关。本发明根系鲜重较重，根数与常规开放组培没差异，说明本发明降低培养基抗菌剂使用量，减轻了对根系的毒副作用。本发明培养瓶敞口有利空气流通及瓶苗茎叶根的发达，提高了瓶苗成活率。
蝴蝶兰出瓶移栽后1个月，本发明成活率较高，与本发明方法得到健壮小苗，根系发达有关，也与本发明瓶苗在较低湿度环境生长，蒸腾能力降低可减少植株移栽后蒸腾失水有关。