本发明属植物生物技术领域，涉及一种植物离体开放培养方法及离体开放专用培养基。具体涉及一种植物离体培养期间开放瓶口以改善瓶苗气体微环境的方法。
背景技术：
植物组织（离体）培养技术种苗生产、脱除病毒、种质改良等具有广阔的市场前景。“在传统的植物组织培养中，组培苗是在密闭的试管或玻璃瓶中培养，由于容器内湿度过高、co2亏缺，致使培养出的小植株体不能正常地进行光合作用，而不得不依靠培养基中的糖进行异养生长，造成培养时间过长，小植株体生长缓慢，植株长势瘦弱，移栽成活率低；培养基中的糖还会促进微生物的繁殖，加大植株的污染率”[马明建，等.基于环境控制的组培苗无糖培养系统.农业工程学报，2009,25（6）:192-197]。具体阐述如下：
1.植物组织培养中每天进行光照和黑暗交替培养，尽管目前培养基中的碳源蔗糖含量一般为高达3%，“在暗期由于呼吸作用瓶内高浓度co2，在开始光照的1～2h内co2浓度即由几千μl•l-1迅速下降到70～90μl•l-1,随后的光照期中都维持这种低浓度状态”[郭海,等.co2气体在植物组培中的应用及前景.核农学报，2004,18(5):368～371]，它接近植物光合作用的平均co2补偿点50μl•l-1，比大气co2浓度350μl•l-1低得多，光合作用效率十分低下。
2.“培养器内相对湿度近于100%,以致造成小植株的表皮角质层不够发达,驯化期间的水势低,从而导致驯化阶段苗成活率降低。”[史跃林.组培苗的生育环境与调节.植物生理学通讯,1990(3):65-67]。培养瓶内空气水汽来自叶片蒸腾作用，也来自琼脂水分向瓶内空间的蒸发作用。
3.“培养基中生长素、细胞分裂素、吲哚乙酸、ba及kin含量的增加可促进乙烯产生,对器官分化、繁育起抑制作用。而co2可抑制乙烯的产生,延缓植株的衰老,促进植株的生长、发育。”[郭海,等.同上]。在密闭瓶内有害气体不易散发，对瓶苗生长产生毒害。
4.“常规培养条件下的试管苗气孔密度比较大,功能不完善,在移栽驯化过程中很难适应外界环境,使光合能力降低,而且容易出现过度失水等问题,直接影响试管苗的移栽成活率。……移栽初期试管苗的气孔开度最大,蒸腾速率达到峰值,试管苗处于失水最快的状态。”（孙冬青等.组培微环境对葡萄风信子组培苗生长及移栽后生理特性的影响.西北农业学报，2008,17(4):244-248,262）。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种植物离体开放培养方法，常规接种后，培养瓶不加瓶盖，瓶内外空气流动，有效缓解瓶内湿度过高、co2亏缺、有害气体积累的问题。
本发明的技术方案如下：
一种植物离体开放培养方法，配制植物离体固体培养基和接种芽苗之后，将氧气缓释颗粒投放培养瓶（或其它离体培养容器）内，压入培养基，随后在培养基表面灌注一层经高压灭菌的非挥发性油性液体，厚0.2-0.5cm，培养瓶不加瓶盖,平放敞口培养；
所述的氧气缓释颗粒材料包括吸水缓释材料和释氧剂过氧化钙粉，预先冷杀菌，所述的吸水缓释材料指吸水后能释放水分的材料，吸水缓释材料粉充分吸水后与过氧化钙粉无菌条件按体积比1:1-1：5混合造粒，粒径0.3-0.8cm；所述的氧气缓释颗粒在培养基中的量范围为每100ml培养基投放10-30粒。
充分吸水的吸水缓释材料与过氧化钙粉体积比如果低于1:1，吸水缓释材料含量高，过氧化钙含量低，每粒氧气缓释颗粒所释放氧气量少，无法为培养基充分供氧；如果大于1:5，过氧化钙含量过高，不利于成型，且吸水缓释材料所包含的水分不足与过氧化钙反应。优选为1:2-1:3。氧气缓释颗粒如果粒径小于0.3cm，较难用镊子等工具操作（镊取，按压埋入），如果大于0.8cm，不利于内部的释氧剂释放氧气。所述的氧气缓释颗粒在培养基中的添加量为每100ml培养基投放10-30粒。如果添加过少（少于10粒），则释氧效果不佳，如果过多（多于30粒），则占用培养基的体积过大，不利于培养基提供更多的营养给植株，且可能不利于根部生长。
在本发明中，所述吸水缓释材料包括高吸水树脂（highabsorptionresin）。所述的高吸水树脂包括丙烯酸钠-乙烯醇共聚物或丙烯酰胺-丙烯酸共聚物。
在本发明的优选实施例中，所述的氧气缓释颗粒在培养基中的添加量为每100ml培养基中添加15-25粒。
在本发明的优选实施例中，非挥发性油性液体种类包括液体石蜡或甲基硅油中的至少一种。
本发明还提供一种植物离体开放专用培养基，所述的培养基为固体培养基，所述的固体培养基表面灌注一层经高压灭菌的非挥发性油性液体，厚0.2-0.5cm，且培养基内设有氧气缓释颗粒，所述的氧气缓释颗粒材料包括吸水缓释材料和释氧剂过氧化钙粉，预先冷杀菌，吸水缓释材料粉状，充分吸水的吸水缓释材料与过氧化钙粉无菌条件按体积比1:1-1:5混合造粒，粒径0.3-0.8cm，所述的氧气缓释颗粒在培养基中的量范围为100ml培养瓶中添加10-30粒。
本发明瓶苗培养期间敞口培养，不加瓶盖导致技术问题是，由于培养瓶内湿度降低，培养基琼脂的水分与瓶内空间水汽压差增大，加快琼脂水分蒸发，可能导致根系供水不足而影响瓶苗生长。此外，不加瓶盖空气微生物会沉降到培养基表面导致污染，致使培养失败。
本发明在培养基表面覆盖一层非挥发性油性液体以阻止琼脂水分蒸发，非挥发性油性液体能阻隔瓶内空间杂菌沉降到培养基表面，使培养基免受杂菌污染。非挥发性油性液体如果厚度小于0.2cm，则阻止琼脂水分蒸发、阻隔空间杂菌沉降的效果不佳，且厚度越低，人工操作越难精确控制；如果厚度大于0.5cm，则接种的芽苗浸泡在油性液体中，抑制细胞呼吸作用，影响芽苗生长，此外，过多使用油性液体也造成浪费。
本发明培养基表面的油层，也阻隔琼脂培养基与外界进行气体交换，影响根部供氧，削弱呼吸代谢。因此本发明在培养基添加释氧剂，培养基埋入的氧气缓释颗粒（释氧颗粒）含过氧化钙，过氧化钙难溶于水，但遇水会缓慢释放氧气2cao2+2h2o→2ca(oh)2+o2↑，并渗透扩散到琼脂培养基内，当颗粒内部积累o2到一定压力，因膨胀使颗粒产生裂缝，也使颗粒内o2排放出来，改善培养基供氧水平。此外，本领域人员熟知，随着培养时间延续根部呼吸所释放的二氧化碳使琼脂培养基过度酸化，co2+h2o=h2co3=h++hco3-1，破坏培养基酸碱平衡。过氧化钙释放氧气的另一产物是ca(oh)2，微溶于水，oh-1能中和h+，缓解培养基过度酸化，不致明显影响根系生长和吸收功能。
从以上化学方程式可看出，过氧化钙和水反应释放氧气，为防止释氧颗粒从培养基吸收水分而影响根系水分吸收，所以释氧颗粒还含缓释材料（优选为高吸水树脂），能缓慢释放水分与过氧化钙反应。
本发明有效缓解了容器内湿度过高、co2亏缺，瓶内有害气体积累的问题，缓解培养基过度酸化，有利瓶苗正常生长。本发明改善植株光合作用，促进生长，减轻茎叶蒸腾强度，提高瓶苗移栽成活率。此外，本发明方法可减少培养基碳源供给，蔗糖使用量减少，降低培养基污染率。
具体实施方式
实施例一
（一）方法
氧气缓释颗粒原料为丙烯酸钠-乙烯醇共聚物粉和过氧化钙粉，均预先紫外线杀菌，丙烯酸钠-乙烯醇共聚物充分吸水之后，与过氧化钙粉按体积比1:3在无菌条件混合造粒，粒径约0.4cm，无菌条件冷冻保存。
对照组（常规组培），200ml培养瓶（圆柱状，直径约6cm），培养基ms+naa0.2mg/l+蔗糖3%+琼脂粉7g/l，处理组（本发明）培养瓶同对照，培养基ms+naa0.2mg/l+蔗糖1.5%+琼脂粉7g/l。每个培养瓶中的培养基约30ml，培养基高压灭菌后平放冷却凝固。
朱蕉（cordylinefruticosa）芽苗未明显长根，平均鲜重0.053g/株，平均高1.13cm，平均叶数2.1片/株，常规接种，每瓶接种12-14株，对照组加盖常规培养。处理组将7粒氧气缓释颗粒投放瓶内，间隔分布，逐个摁压埋入培养基，随后在培养基表面灌注一层经高压灭菌的液体石蜡，厚约0.3cm，培养瓶不加瓶盖，平放敞口培养。培养室湿度65-80%。
培养50天，将对照组培养瓶的盖子打开，对照组、处理组培养瓶在温室练苗5天，瓶苗移栽入土，温室内常规管理。
（二）结果
培养50天，对照、处理组培养基表面、内部均未见有微生物菌落，瓶苗生长指标见下表。
表.朱蕉瓶苗生长、移栽情况
瓶苗净光合速率处理组较高，与对照差异极显著。处理组茎叶平均鲜重较重，与对照差异极显著，平均叶数处理组较对照多，差异显著。瓶苗成活率处理组较对照显著提高。
处理组根系平均鲜重较重，与对照差异显著，平均根数处理组较对照显著增多。蒸腾速率处理组较低，与对照差异极显著。出瓶移栽后1个月后，处理组苗成活率较对照组极显著提高。
（三）结论
本发明培养基表面覆盖油层阻隔瓶内空间微生物污染培养基，处理组培养基蔗糖量减半可减少微生物繁殖营养，本发明虽然瓶苗敞口培养，培养基也无污染。
本发明瓶苗敞口培养，净光合速率提高，提高茎叶、根生长量。
本发明培养基表面覆盖油层和培养基埋入氧气缓释颗粒，并没对根部生长有不利影响。
本发明瓶苗根系发达有利植株吸水，蒸腾速率降低减少植株失水，结果使移栽成活率较对照提高。
实施例二
（一）方法
氧气缓释颗粒原料为丙烯酰胺-丙烯酸共聚物粉和过氧化钙粉，均预先冷杀菌，丙烯酰胺-丙烯酸共聚物充分吸水，与过氧化钙粉按体积比1:2在无菌条件混合造粒，粒径约0.7cm，无菌条件冷冻保存。
对照组（常规组培），650ml培养瓶（底部直径约10m，瓶口内径4.5cm），培养基ms+naa0.5ml/l+6-ba0.1ml/l+蔗糖3%+琼脂粉7g/l。处理组（本发明）培养瓶同对照，培养基ms+naa0.5ml/l+6-ba0.1ml/l+蔗糖1.5%+琼脂粉7g/l。每个培养瓶分装培养基约100ml，培养基高压灭菌后平放冷却凝固。
铁皮石斛（dendrobiumofficinale）芽苗未明显长根，平均鲜重0.088，平均高1.84cm，平均叶数2.4片/株，每瓶接种16-18株，常规接种，对照组加盖常规培养。处理组将15粒氧气缓释颗粒投放瓶内，间隔分布，逐个摁压埋入培养基，随后在培养基表面灌注一层经高压灭菌的甲基硅油，厚约0.4cm，培养瓶不加瓶盖，敞口培养。培养室湿度65-80%。
培养100天，将对照组培养瓶的盖子打开，对照组、处理组培养瓶在温室练苗7天，瓶苗移栽入无土基质，温室内常规管理。
（二）结果
培养100天，对照、处理组培养基污染率各5.56±0.39%和6.09±0.60%，差异不显著，瓶苗生长指标见下表。
表.铁皮石斛瓶苗生长、移栽情况
瓶苗净光合速率处理组较对照极显著升高。处理组茎叶平均鲜重较重，与对照差异极显著，平均叶数处理组较对照多，差异显著。瓶苗成活率两组都是100%。
处理组根系平均鲜重较重，与对照差异极显著，平均根数两组差异不显著。蒸腾速率处理组较对照极显著低。出瓶移栽后1个月后，处理组苗成活率较对照组极显著提高。
（三）结论
本发明培养基表面覆盖油层阻隔瓶内空间微生物污染培养基，培养基蔗糖量减半可减少微生物繁殖营养，结果是本发明虽然敞口培养，培养基污染率与常规培养相同。
本发明瓶苗敞口培养，茎叶净光合速率提高，茎、叶、根生长量也提高。
本发明培养基表面覆盖油层和培养基埋入氧气缓释颗粒，并没对根部生长有不利影响。
本发明瓶苗根系发达有利植株吸水，蒸腾速率降低减少植株失水，结果使移栽成活率较对照提高。