丙烯酰丹（Acrylodan）及类似物的合成方法

丙烯酰丹(acrylodan)及类似物的合成方法
技术领域：
1.本发明涉及生物化学中荧光探针合成技术领域，具体而言，涉及一种环境敏感型萘类荧光探针—丙烯酰丹及类似物(通式i)的合成新方法。其结构通式如下：
[0002][0003]
其中，其中，r1和r2表示氢、1
‑
10碳原子的烷基链、末端包含胺基、羧酸、羟基官能团的烷基链(包含1
‑
10碳原子)的多种任意组合。
[0004]
丙烯酰丹(acrylodan，式ia)，化学名为6
‑
丙烯酰基
‑2‑
二甲氨基萘，分子式c
15
h
15
no，分子量225.29，cas登记号86636
‑
92
‑
2，其结构式如下：
[0005]


背景技术：
：
[0006]
环境敏感型荧光探针是一类能随着探针所处周围物理化学性质改变而发生荧光信号变化的光学探针分子，而生物系统中这些物理化学性质(如极性、粘度、酸碱性、温度、压力等)对生命系统的正常活动具有重要的意义，其异常变化与许多疾病密切相关。因此，结合荧光成像技术，发展性能优异的环境敏感型荧光探针，在生物医学邻域具有重要的应用价值。
[0007]
丙烯酰丹是最早报道的极性敏感型荧光探针之一，在蛋白标记及研究蛋白结构变化中有很好的应用价值。基于丙烯酰丹的母核结构衍生出许多荧光探针类似物，并广泛用于生物学相关研究中。丙烯酰丹本身具有微弱的荧光，而当其与亲核试剂(如具有亲核性的硫醇)作用后荧光显著增强，并且这一丙烯酰丹
‑
加成物的荧光发射波长对探针所处极性环境十分敏感，例如丙烯酰丹
‑
加成物在不同极性的环己烷或水中的最大发射波长分别为540 和435nm，可发生105nm的红移。利用这些性质，丙烯酰丹能与蛋白质中半胱氨酸的游离巯基发生选择性的定位标记反应，并随着标记位点极性环境的变化，而发生荧光光谱的相应改变，由此揭示蛋白质内部结构的变化。其还可与内源色氨酸构成荧光共振能量转移中的供体
‑
受体对，从而可定量刻画生物分子的区域结构特性。丙烯酰丹的这些荧光光谱特性，使其在蛋白质的结构研究(如蛋白的解折叠、构象变化等研究)中具有较大的应用价值。目前，丙烯酰丹已经发展成为应用最为广泛的检测蛋白质内部结构及极性变化的商业化荧光探
针之一。
[0008]
关于丙烯酰丹及类似物的合成方法，国内未见相关文献报道。在国外只有franklyn g. prendergast等人和steven s.silvonek等人在文献中有过相关阐述(a.f.g.prendergast,m. meyer,g.l.carlson,s.iida and j.d.potter,j.biol.chem.,1983,258,7541
‑
7544；b.s.s. silvonek,c.b.giller and c.j.abelt,org.prep.proced.int.,2005,37,589
‑
594.)，其共同的特点都是以珀若丹(prodan)为主要的合成中间体进行丙烯酰丹的合成，其合成路线如下所示。首先合成珀若丹(化合物1
‑
7)，即化合物1
‑
3与过量的碘甲烷反应得到季胺盐1
‑
4，将其用乙醇胺脱甲基得化合物1
‑
5，再与正丁基锂发生取代得到化合物1
‑
6，最后通过与 n
‑
丙酰吡咯(化合物1
‑
2)反应得化合物1
‑
7。随后珀若丹(化合物1
‑
7)与二异丙基胺基锂盐反应生成锂代中间体1
‑
8，化合物1
‑
8与溴代苯硒作用生成硒加成化合物1
‑
9，再经氧化生成丙烯酰丹。丙烯酰丹的路线一：
[0009][0010]
另一条合成方法是以氯丙酰胺为原料经一系列反应制备3
‑
二甲基氨基化合物1
‑
13，再与珀若丹(化合物1
‑
7)经亲核取代得到化合物1
‑
14，用碘甲烷将化合物1
‑
14季铵化得到化合物1
‑
15，最后经碱消除得到丙烯酰丹。丙烯酰丹的合成路线二：
[0011][0012]
这些合成方法以价格昂贵且不易合成的珀若丹为主要中间体进行丙烯酰丹的合成，存在所需反应的合成步骤多，操作复杂，产率较低，原料昂贵，工艺条件苛刻等缺点，极大限制了丙烯酰丹及类似物的应用。因此，急需优化丙烯酰丹的合成工艺路线，并以此为基础发展丙烯酰丹类似物的便捷合成方法。


技术实现要素：

[0013]
针对现有合成技术存在的不足，本发明的主要目的是提供一种原料易得，操作简
便，合成步骤短，适合较高产率合成丙烯酰丹及类似物的新合成路线。
[0014]
本发明所生产的丙烯酰丹及类似物，是含有不同胺基取代的萘类化合物，其结构通式为式i，制备通式i化合物的方法与制备丙烯酰丹的方法相似，不同之处为二甲胺变换为各种不同取代的胺类化合物。
[0015]
本发明提供的制备路线如下所示：
[0016][0017]
其中，其中，r1和r2表示氢、1
‑
10碳原子的烷基链、末端包含胺基、羧酸、羟基官能团的烷基链(包含1
‑
10碳原子)的多种任意组合。
[0018]
本发明提供了一种丙烯酰丹及类似物的制备方法，包括如下步骤：
[0019]
1)惰性气体及
‑
50℃条件下，胺基化合物与丁基锂作用以制备胺基锂盐，随后将其置于有机溶剂中，加入化合物2
‑
1和助溶剂，室温下反应12
‑
48小时。反应结束后，加冰水淬灭反应，并加入无机酸将反应液调成ph 1
‑
6范围，有机溶剂萃取，收集水相，再向水相中加入无机碱，将其调成碱性ph 8
‑
12，使产物2
‑
2沉淀析出。
[0020]
2)将无机碱及无水有机溶剂置于反应容器中，惰性气体保护下，加入三氟乙酸乙酯搅拌反应10
‑
60分钟，随后加入化合物2
‑
2及相转移催化剂，反应在合适温度下反应12
‑
48 小时。反应结束后，旋除反应液，加入酸性溶液，将ph调至3
‑
6，随后有机溶剂萃取，干燥，浓缩，重结晶，得到红橙色化合物2
‑
3。
[0021]
3)将化合物2
‑
3、醛类有机化合物和无机碱至于有机溶剂中，在合适温度下反应6
‑
48 小时。反应完成后，旋除反应液，直接柱层析，得丙烯酰丹或其类似物2
‑
4的纯品。
[0022]
在本发明提供的丙烯酰丹及类似物的制备方法中，步骤1)所述的惰性气体是指没有活性的气体，例如氩气或氮气。胺基化合物nhr1r2包括：r1和r2为氢、1
‑
10碳原子的烷基链、末端包含胺基、羧酸、羟基官能团的烷基链(包含1
‑
10碳原子)的多种任意组合。所述的有机溶剂选自：四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n,n
‑
二甲基甲酰胺，优选四氢呋喃或乙酸乙酯。所述的助溶剂选自：苯甲酸钠、尿素、菸酰胺、乙酰胺、n,n
‑ꢀ
二甲基丙烯基脲，优选n,n
‑
二甲基丙烯基尿。所述的无机酸选自：盐酸、硫酸、硝酸、磷酸、优选盐酸或硫酸。所述的无机碱选自：碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾，优选碳酸钠或氢氧化钠来调节碱性。
[0023]
在本发明提供的丙烯酰丹及类似物的制备方法中，步骤2)所述的无机碱选自：碳酸氢钠、碳酸钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氢化钠、氢化钾、氢化钙，优选氢化钠。所述的有机溶剂选自：四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n,n
‑
二甲基甲酰胺，优选四氢呋喃或乙酸乙酯。所述的相转移催化剂选自：链状聚乙二醇、18
‑
冠
‑
6、15
‑
冠
‑
5、环糊精苄基三乙基氯化铵、四丁基溴化铵、四丁基氯化铵、十二烷基三甲基氯化铵、十四烷基三甲基氯化铵，优选18
‑
冠
‑
6或15
‑
冠
‑
5。合适的反应温度通常为室温至回流温度，优选反应温度为50℃至100℃，更优选60℃至80℃。所述的酸性溶液选自：稀盐酸、稀硫酸、饱和氯化铵、稀硝酸，优选饱和氯化铵。
[0024]
在本发明提供的丙烯酰丹及类似物的制备方法中，步骤3)所述的醛类有机化合物包括：甲醛水溶液、甲醛四氢呋喃溶液、甲醛甲醇溶液、多聚甲醛，优选甲醛水溶液或多聚甲
醛。所述的有机溶剂选自：四氢呋喃、甲苯、苯、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、n,n
‑
二甲基甲酰胺，优选甲苯或苯。合适的反应温度通常为室温至回流温度，优选反应温度为80℃至120℃。
[0025]
与现有技术相比，本发明取得了较好的效果，体现在：
[0026]
1.原料便宜易得：本发明的所需的原料均价廉易得，克服了现有技术中合成中间体昂贵不易获得的缺陷，极大的降低了合成丙烯酰丹及其类似物的成本。
[0027]
2.合成步骤短：本发明的合成步骤较短，从原料到终产物仅用三步，且每步反应的收率均较高，总收率接近70％。
[0028]
3.操作简便易处理：前两步合成步骤中，反应结束后只需简单处理，无需纯化，可直接进行下一步反应。
[0029]
4.反应条件温和：除制备所需胺基锂盐需要低温反应，其它步骤反应的条件温和，不需要复杂处理。
[0030]
上述优势使此法在合成丙烯酰丹及类似物方面具备独特的应用前景。
附图说明
[0031]
下面结合附图，以合成丙烯酰丹为例对本发明的具体实施方案作进一步详细的说明。但不应将此理解为对本发明方法的限制。
[0032]
图1.化合物丙烯酰丹类似物的结构通式。
[0033]
图2.化合物丙烯酰丹的结构。
[0034]
图3.化合物3
‑
2的代表性1hnmr。
[0035]
图4.化合物3
‑
2的代表性
13
cnmr。
[0036]
图5.化合物3
‑
3的代表性1hnmr。
[0037]
图6.化合物3
‑
3的代表性
13
cnmr。
[0038]
图7.化合物丙烯酰丹的代表性1hnmr。
[0039]
图8.化合物丙烯酰丹的代表性
13
cnmr。
具体实施方式：
[0040]
下面为了更好地说明本发明所述丙烯酰丹及类似物的合成工艺，以合成丙烯酰丹为例，给出了本发明的具体实施例，对本发明做进一步说明。
[0041][0042]
实施例1：
[0043]
(1)以6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘为原料与二甲基氨基锂发生取代反应合成化合物3
‑
2。
[0044]
操作方法：将6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘(1.0g，5mmol)溶解到5ml无水n,n
‑
二甲基甲酰胺中，在加入5ml n,n
‑
二甲基丙烯基脲，氩气保护下加入lin(ch3)2溶液(30mmol), 反应在室温下反应24小时，反应结束后，将反应溶液加入到冰水中，加浓盐酸将反应液调成ph 1
‑
2范围，乙酸乙酯萃取，收集水相，再向水相中加入固体氢氧化钠，将其调成碱性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得化合物3
‑
2，产率81％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.31(s,1h),7.93(m,1h),7.81(d,j＝9.10hz,1h),7.64(d,j＝ 8.70hz,1h),7.18
(dd,j＝9.10hz,2.50hz,1h),6.88(d,j＝2.30hz,1h),3.11(s,6h),2.66(s, 3h)(参见图2)；
13
c nmr(400mhz,cdcl3)δ:197.71,150.26,137.68,130.82,130.70,130.39, 126.17,125.05,124.59,116.27,105.33,40.42,26.40(参见图3)；esi
‑
ms(m/z):214.5[m+h]
+
。
[0045]
(2)以化合物3
‑
2为原料与三氟乙酸乙酯发生加成
‑
消除反应合成化合物3
‑
3。
[0046]
操作方法：将氢化钙(966mg,23mmol)置于100ml的圆底烧瓶中，氩气保护，将三氟乙酸乙酯(1.4ml,18mmol)溶解到13ml无水四氢呋喃中，加入到烧瓶中反应5分钟，随后将化合物3
‑
2(1g,4.7mmol)和15
‑
冠
‑
5(125mg,0.35mmol)溶解到15ml无水四氢呋喃中，逐渐加入到上述反应液中，室温下反应30分钟，随后加热回流过夜，反应结束后，将旋除反应液，加入饱和氯化铵，再加入1m的盐酸将ph调至3
‑
4，随后乙酸乙酯萃取，合并有机相，再饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩，得到红橙色粗产物，再经乙醇重结晶，得化合物3
‑
3，产率98％。1h nmr(400mhz,cdcl3)δ:8.37(s,1h),7.83(m,1h), 7.81(m,1h),7.66(d,j＝8.79hz,1h),7.19(dd,j＝9.10hz,2.50hz,1h),6.86(d,j＝2.25hz, 1h),6.65(s,1h),3.14(s,6h),2.66(s,1h)(参见图5)；
13
c nmr(400mhz,cdcl3)δ:186.45, 176.04,175.69,150.73,138.39,131.07,130.02,126.56,125.38,125.07,123.54,116.41,105.11, 91.67,91.65,40.32(参见图6)；esi
‑
ms(m/z):308.9[m
‑
h]
+
。
[0047]
(3)以化合物3
‑
3为原料与甲醛发生加成
‑
消除反应合成丙烯酰丹。
[0048]
操作方法：将化合物3
‑
3的粗产物溶解到200ml的甲苯中，再加入2.1g的氢氧化钠，和5g的多聚甲醛，然后反应混合液加热回流12小时，反应结束后旋除反应液，直接柱层析，得化合物丙烯酰丹，产率92％。1h nmr(400mhz, cdcl3)δ:8.35(s,1h),7.97(dd,j＝8.69hz,1.72hz,1h),7.82(d,j＝9.10hz,1h), 7.67(d,j＝8.68hz,1h),7.38(dd,j＝17.05hz,10.52hz,1h),7.19(dd,j＝9.10hz, 2.50hz,1h),6.89(d,j＝2.33hz,1h),6.50(dd,j＝17.05hz,1.81hz,1h),5.91(q,j ＝12.33hz,1h),3.12(s,6h)(参见图7)；
13
c nmr(400mhz,cdcl3)δ:189.99, 150.34,137.75,132.37,130.80,130.71,128.90,126.45,125.11,124.99,116.24,105.32, 40.45(参见图8)；esi
‑
ms(m/z):226.5[m+h]
+
。
[0049]
实施例2：
[0050]
(1)以6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘为原料与二甲基氨基锂发生取代反应合成化合物3
‑
2。
[0051]
操作方法：将6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘(1.0g，5mmol)溶解到5ml无水四氢呋喃中，在加入5ml乙酰胺，氩气保护下加入lin(ch3)2溶液(30mmol),反应在室温下反应24小时，反应结束后，将反应溶液加入到冰水中，加浓盐酸将反应液调成ph 1
‑
2范围，乙酸乙酯萃取，收集水相，再向水相中加入固体氢氧化钠，将其调成碱性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得化合物3
‑
2，产率81％。
[0052]
(2)以化合物3
‑
2为原料与三氟乙酸乙酯发生加成
‑
消除反应合成化合物3
‑
3。
[0053]
操作方法：将氢化钠(560mg,23mmol)置于100ml的圆底烧瓶中，氩气保护，将三氟乙酸乙酯(1.4ml,18mmol)溶解到13ml无水四氢呋喃中，加入到烧瓶中反应5分钟，随后将化合物3
‑
2(1g,4.7mmol)和18
‑
冠
‑
6(125mg,0.35mmol)溶解到15ml无水四氢呋喃中，逐渐加入到上述反应液中，室温下反应30分钟，随后加热回流过夜，反应结束后，将旋除反应液，加入饱和氯化铵，再加入1m的盐酸将ph调至3
‑
4，随后乙酸乙酯萃取，合并有机相，再饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩，得到红橙色粗产物，再经乙醇重结晶，得化合物3
‑
3，产率98％。
[0054]
(3)以化合物3
‑
3为原料与多聚甲醛发生加成
‑
消除反应合成丙烯酰丹。
[0055]
操作方法：将化合物2
‑
2的粗产物溶解到200ml的苯中，再加入2.1g的碳酸钾和5ml 的甲醛溶液，然后反应混合液加热回流12小时，反应结束后旋除反应液，直接柱层析，得化合物丙烯酰丹，产率92％。
[0056]
实施例3：
[0057]
(1)以6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘为原料与二甲基氨基锂发生取代反应合成化合物3
‑
2。
[0058]
操作方法：将6
‑
甲氧基
‑2‑
乙酰萘(1.0g，5mmol)溶解到5ml无水四氢呋喃中，在加入5ml n,n
‑
二甲基丙烯基脲，氩气保护下加入lin(ch3)2溶液(30mmol),反应在室温下反应24小时，反应结束后，将反应溶液加入到冰水中，加浓盐酸将反应液调成ph 1
‑
2 范围，乙酸乙酯萃取，收集水相，再向水相中加入固体氢氧化钠，将其调成碱性，乙酸乙酯萃取，收集有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩，柱层析得化合物3
‑
2，产率81％。
[0059]
(2)以化合物3
‑
2为原料与三氟乙酸乙酯发生加成
‑
消除反应合成化合物3
‑
3。
[0060]
操作方法：将氢化钠(560mg,23mmol)置于100ml的圆底烧瓶中，氩气保护，将三氟乙酸乙酯(1.4ml,18mmol)溶解到13ml无水四氢呋喃中，加入到烧瓶中反应5分钟，随后将化合物2
‑
1(1g,4.7mmol)和18
‑
冠
‑
6(125mg,0.35mmol)溶解到15ml无水四氢呋喃中，逐渐加入到上述反应液中，室温下反应30分钟，随后加热回流过夜，反应结束后，将旋除反应液，加入饱和氯化铵，再加入1m的盐酸将ph调至3
‑
4，随后乙酸乙酯萃取，合并有机相，再饱和碳酸氢钠洗涤，干燥，浓缩，得到红橙色粗产物，再经乙醇重结晶，得化合物3
‑
3，产率98％。
[0061]
(3)以化合物3
‑
3为原料与多聚甲醛发生加成
‑
消除反应合成丙烯酰丹。
[0062]
操作方法：将化合物3
‑
3的粗产物溶解到200ml的四氢呋喃中，再加入2.1g的氢氧化钠和5g的多聚甲醛，然后反应混合液加热回流12小时，反应结束后旋除反应液，直接柱层析，得化合物丙烯酰丹，产率92％。
[0063]
综上，本发明公开了一种丙烯酰丹及类似物的合成工艺路线。该方法以6
‑
甲氧基
‑2‑ꢀ
乙酰萘为原料，与氨基锂盐发生取代反应，所得产物与三氟乙酸发生加成
‑
消除反应后，再与醛类发生加成
‑
消除反应，最终得到高纯丙烯酰丹化合物及其类似物。
[0064]
最后需要说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制技术方案，本领域的普通技术人员应当理解，那些对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。