一种基于DNA稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法

本发明属于污水生物处理技术及微生物生态学
技术领域：
，具体涉及一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化颗粒污泥系统中活性短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法。
背景技术：
：厌氧氨氧化被认为是一种新型自养、具有成本效益的废水生物处理技术，而亚硝酸盐作为厌氧氨氧化的底物之一，被用作电子受体将氨氮氧化为氮气。迄今为止，获得亚硝酸盐的常用途径有短程硝化和短程反硝化。短程硝化，在好氧环境下氨氧化细菌将氨氮氧化为亚硝态氮，然而在实际污水处理系统中硝酸盐氧化细菌的活性高于氨氧化细菌，亚硝酸盐容易被进一步氧化为硝酸盐，因此很难维持短程硝化系统中亚硝酸盐的稳定积累；短程反硝化，在缺氧环境下反硝化菌在硝酸盐还原酶的作用下将硝酸盐还原为亚硝酸盐。近年来，反硝化过程中亚硝酸盐的积累经常被报道，cao等人发现进水碳氮比为3的条件下，短程反硝化系统可以达到80％以上的亚硝积累率，并且在长期运行中保持稳定。许多研究学者关注絮体污泥或者生物膜系统的短程反硝化，但对颗粒污泥系统的短程反硝化研究较少。颗粒污泥是一种自固定化的微生物团，包含不同功能的微生物，由于其独特的层状结构，可能为短程反硝化菌的生长提供有利环境。因此，有必要研究在颗粒污泥系统中实现短程反硝化的稳定长期运行。三氯生是一种广谱的抗菌剂，被广泛应用于个人护理产品中，因此在地表水、土壤和沉积物等环境中可以频繁地检测到三氯生。在中国，牙膏中三氯生的浓度为0.05％-0.3％，相当于500-3000mg/l，污水处理厂中三氯生的浓度可以达到0.07-14000μg/l，在活性污泥中其浓度在19000-41000μg/kg之间，地表水中其浓度为0.28-28.47ng/l。由于三氯生不仅有潜在的环境影响，对人类内分泌和生殖发育也有不利影响，因此三氯生的去除引起了越来越多的关注。据报道，三氯生可以在纯培养系统、污水处理厂系统、活性污泥系统和沉积物中被生物降解，然而在颗粒污泥短程反硝化系统中去除三氯生的报道很少。因此，有必要研究三氯生在颗粒污泥短程反硝化系统中的去除。参与短程反硝化和三氯生去除的微生物被广泛报道，有文献表明staphylococcus和rhodobacter菌可以还原硝酸盐为亚硝酸盐为唯一产物；而四种thauera菌株(thaueraaminoaromaticaa,thaueraphenylaceticaa,thauerasp.dnt-1和thaueraterpenicaa)在存在硝酸盐时不发生亚硝酸盐还原酶基因的转录，从而导致亚硝酸盐的积累，当不存在硝酸盐时再进一步将亚硝酸盐还原为氮气；此外，sphingopyxis和methylobacillus菌被证明可以降解三氯生。dna稳定同位素探针技术是将稳定同位素(如13c或者15n)掺入细菌的dna中，使其能够在间歇底物消耗试验中同化标记化合物，然后使用等密度超高速离心法分离标记的dna，携带13c或15n标记的细菌随后使用高通量测序来进一步识别。xing等人使用dna稳定同位素探针技术揭示微电解、异养和自养反硝化过程中的活性自养反硝化菌为thermomonas菌，活性异养反硝化菌为thauera和comamonas菌。jia等人使用dna稳定同位素探针技术鉴定硝化系统中的活性三氯生降解菌为amaricoccus菌。然而，颗粒污泥短程反硝化系统中活性的短程反硝化菌和三氯生降解菌尚未被揭示，并且活性的短程反硝化菌和三氯生降解菌之间的关系尚不清楚，是否存在一种细菌可以同时去除三氯生和实现短程反硝化。因此，亟需开发一种同时鉴定短程反硝化颗粒污泥系统中活性短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法。本发明利用dna稳定同位素探针技术，同时标记13c-丙酸钠和13c-三氯生，提供了一种同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，进一步探究并揭示了一种能同时实现短程反硝化以及三氯生去除的微生物，为实际污水处理厂短程反硝化去除三氯生过程提供理论支撑。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种可以同时鉴定三氯生处理废水短程反硝化系统中的活性短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，为实际污水处理厂短程反硝化去除三氯生过程提供理论支撑。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，具体包括以下步骤：(1)基于颗粒污泥的短程反硝化系统的启动以及三氯生在该系统中的生物去除，以丙酸钠为碳源，硝酸钠为氮源启动短程反硝化系统，成功启动后向系统内投加三氯生，探究三氯生在该系统中的生物降解；(2)在步骤(1)反应运行末期，分别取出气中的污泥，进行13c-丙酸钠、13c-三氯生同位素微宇宙实验，分别采集短程反硝化系统中的污泥样本分别对应加入13c-丙酸钠、13c-三氯生、12c-丙酸钠、12c-三氯生进行同位素微宇宙实验，分别孵育，然后提取污泥dna；(3)采用基于氯化铯密度梯度溶液的超高速离心方法分离重层dna，分别向步骤(2)提取的dna样品中加入氯化铯和gb缓冲溶液，进行超高速密度离心，离心后的样品进一步进行分层纯化得到不同密度层级的dna溶液；(4)进行dna标记程度评价及菌群结构分析，分别对步骤(3)中分层纯化后的dna样品分别进行narg和nirs基因qpcr定量，判断短程反硝化菌的标记程度，再对13c-丙酸钠和13c-三氯生标记且筛选出来的重层dna进行16srrnav3-v4区高通量测序，从而同时鉴定短程反硝化系统中的活性反硝化菌和三氯生降解菌。本发明基于dna稳定同位素探针技术，通过13c-丙酸钠和13c-三氯生同位素微宇宙实验标记短程反硝化系统中功能微生物，使用超高速离心方法分离标记的13c-丙酸钠/三氯生重层dna，对分层后的13c/12c-丙酸钠dna进行反硝化narg和nirs基因qpcr定量，再进一步对13c-丙酸钠和13c-三氯生标记且筛选出来的重层dna进行16srrnav3-v4区高通量测序，从而同时鉴定短程反硝化系统中的活性短程反硝化降解菌和三氯生降解菌。优选地，步骤(1)所述的进水碳氮比为3，进水丙酸钠、硝态氮和三氯生浓度分别为315mg/l、105mg/l和3mg/l。优选地，步骤(2)所述的污泥样本为加入3mg/l三氯生的短程反硝化系统中具有稳定的三氯生降解能力的颗粒污泥样本。优选地，步骤(2)所述的13c-丙酸钠、12c-丙酸钠的浓度均为105mg/l，13c-三氯生、12c-三氯生的浓度均为1mg/l，污泥浓度为2000mg/l。优选地，步骤(2)中添加12c-丙酸钠和12c-三氯生的处理分别作为对照组，添加13c-丙酸钠和13c-三氯生的处理分别作为实验组。优选地，步骤(2)所述的分别孵育，具体为13c-丙酸钠的同位素微宇宙实验时间为8个周期，每个周期反应4h，13c-三氯生同位素微宇宙实验时间为1个周期，1个周期时间为3天。优选地，步骤(3)具体为将dna样品与gb缓冲液混合于2ml离心管中获得dna-gb样品溶液，再于15ml离心管中分别添加氯化铯溶液、gb溶液和dna-gb样品溶液，调整混合样品的折射率为1.4029±0.0002，再置于超高速离心机中于20℃、45krpm转速下，离心44h，离心结束后，进一步采用超高速密度梯度离心液自动分层装置将离心液分为12层并测定每层离心液的折射率，用peg6000沉淀dna，进一步用70％乙醇洗涤每层dna。优选地，步骤(4)具体为对12c/13c-丙酸钠标记的12层dna样品进行narg和nirs基因qpcr定量，通过比较12c/13c各层样品narg和nirs基因的相对丰度，反映13c-丙酸钠标记的重层dna在浮力密度梯度中的分布状况，从而评价标记上的重层微生物为短程反硝化菌还是条件短程反硝化菌，再针对被13c-丙酸钠标记且筛选出的重浮力密度dna进行16srrnav3-v4区高通量测序。对12c/13c-三氯生标记的dna样品，选择分层纯化后的3-5重层dna样品直接进行16srrnav3-v4区高通量测序，对比12c和13c重层dna样品的微生物群落结构，从而同时鉴定短程反硝化系统中的活性反硝化菌和三氯生降解菌。将步骤(1)的碳源替换为乙酸钠或甲醇，对应的步骤(2)13c-丙酸钠替换为13c-乙酸钠、13c-甲醇。发现sphingomonas属可以同时实现短程反硝化以及三氯生的去除。本发明的优势与有益效果是：(1)本发明所采用的dna稳定性同位素探针技术在原位水平上，通过添加特定13c同位素标记物，在保持原生生态完整性的基础上，筛选分离出执行特定功能的关键细菌，可以同时鉴定短程反硝化系统中的活性短程反硝化菌和三氯生降解菌。(2)本发明将13c稳定同位素标记法和超高速离心法结合，可以针对性地筛选出活性的目标微生物dna，提高短程反硝化菌和三氯生降解菌在重层dna中的分布比例，进一步提高活性短程反硝化菌和三氯生降解菌的鉴定率。(3)本发明解决了短程反硝化菌和三氯生降解菌难以通过传统纯培养技术进行鉴定这一难题，发现sphingomonas属可以同时实现短程反硝化以及三氯生的去除，为实际污水处理厂利用短程反硝化工艺去除三氯生的发展提供了微生物鉴定方法。附图说明图1为本发明短程反硝化系统的进出水亚硝态氮、硝态氮、三氯生以及三氯生质量守恒结果。图2为本发明短程反硝化系统13c/12c-丙酸钠同位素微宇宙实验过程中进出水cod、亚硝态氮和硝态氮浓度以及全周期变化曲线。图3为本发明短程反硝化系统13c/12c-丙酸钠同位素微宇宙实验分层纯化后每层dna样品narg和nirs基因定量结果。图4为本发明短程反硝化系统13c/12c-丙酸钠和13c/12c-三氯生同位素微宇宙实验重层dna片段细菌属水平差异结果。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。实施例1一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，具体包括以下步骤：(1)基于颗粒污泥的短程反硝化系统的启动以及三氯生在该系统中的生物去除。设置进水丙酸钠和硝态氮浓度分别为315mg/l和105mg/l，接种好氧颗粒污泥，污泥浓度为6000mg/l，启动一个有效容积为3l的短程反硝化序批式生物反应器，运行65天后实现了稳定的亚硝积累率，再向系统中加入3mg/l三氯生，一共运行130天，并在第73天(投加初期)和第127天(投加末期)取泥进行三氯生质量守恒实验，探究三氯生在短程反硝化系统中的去除，整个运行阶段的进出水亚硝态氮、硝态氮、三氯生以及三氯生质量守恒结果如图1所示。(2)进行13c-丙酸钠和13c-三氯生同位素微宇宙实验。反应运行末期，从反应器取泥，用蒸馏水淘洗三次，分别置于200ml锥形瓶和50ml锥形瓶分别进行13c-丙酸钠和13c-三氯生同位素微宇宙实验。对于13c-丙酸钠同位素微宇宙实验，置于25℃的摇床中150rpm每个周期反应4小时，共进行8个周期。对于13c-三氯生同位素微宇宙实验，置于25℃的摇床中150rpm反应3天。实验分成四组进行，分别为1#丙酸钠对照组、2#13c-丙酸钠实验组、3#三氯生对照组和4#13c-三氯生实验组，每组样品一式三份作为平行，实验设计如表1所示。污泥浓度、进水丙酸钠和三氯生分别设置为2000mg/l、105mg/l和1mg/l。表1实验设计序号分组名称标记方案11#丙酸钠对照组12c-丙酸钠+14n硝态氮22#13c-丙酸钠实验组13c-丙酸钠+14n硝态氮33#三氯生对照组12c-三氯生+14n硝态氮44#13c-三氯生实验组13c-三氯生+14n硝态氮(3)孵育8个周期的短程反硝化样品，其培养周期cod、硝态氮和亚硝态氮浓度变化如图2所示。培养结束后，分别采用土壤dna提取试剂盒(fastdnaspinkitforsoil，mp，usa)和按照相应说明书方法提取基因组总dna样品。(4)超高速密度梯度离心溶液配制。tris-hcl：配制1.0mol/ltris-hcl溶液，调节ph为8.0。tris-edta：包括0.01mol/ltris-hcl和0.001mol/ledta。gb缓冲液：包括0.1mol/ltris-hcl、0.1mol/lkcl和0.001mol/ledta。70％乙醇：加入370ml95％乙醇于130ml去离子水中。氯化铯溶液：溶解50g氯化铯于30mlgb缓冲液，其密度约为1.85g/ml，光反射指数约为1.4153±0.0002。peg6000溶液：用去离子水溶解150gpeg6000和46.8gnacl，并定容至500ml。(5)超高速密度梯度离心dna。采用gb缓冲液将2.0μgdna定容到100μl，在15ml离心管中依次加入4.9ml氯化铯、0.9mlgb缓冲液和100μldna-gb样品溶液。采用折光仪测定离心前混合液的折光率，利用氯化铯溶液与gb缓冲液分别调整样品目标折射率为1.4029±0.0002。采用注射器将离心溶液样品转移至5.1ml超速离心管中，并采用专用封口枪密封离心管。按照以下参数设置超高速离心机工作参数：离心时间(44小时)、离心温度(20℃)、离心速度(45krpm)、离心机时间设置(hold)、离心机启动加速参数(最大)、离心机停止参数设置(无刹车)。离心结束后，采用专用转子开启装置取出离心管，尽量保持操作过程转子无振动。(6)梯度溶液分级。采用超高速密度梯度离心液自动分层装置将离心液分为12层，每层液体体积为425μl。(7)dna纯化。在不同浮力密度梯度溶液中加入550μlpeg6000溶液，头尾倒置若干次混匀溶液，室温静置2.0小时，或者37℃加热1.0小时沉淀dna；在15-20℃下13000×g离心30分钟，除去上清液；加入500μl70％乙醇清洗dna沉淀，离心10分钟，除去上清液；重复上述步骤，以进一步去除氯化铯，同时尽量去除peg6000；将dna沉淀物室温干燥15分钟；确保dna沉淀中无液体存在后，将其溶于30μlte缓冲液，-20℃冰箱保存。(8)标记dna富集度分布评估。对于13c-丙酸钠同位素微宇宙实验，分层纯化后的不同浮力密度层级dna样品，进行narg和nirs基因qpcr定量，通过比较12c/13c各层样品narg和nirs基因的相对丰度，反映13c-丙酸钠标记的重层dna在浮力密度梯度中的分布状况，从而评价标记上的重层微生物为短程反硝化菌还是条件短程反硝化菌。结果如图3所示，可以看出短程反硝化菌被成功标记。(9)微生物群落结构鉴定。针对被13c-丙酸钠标记且筛选出的重浮力密度dna进行16srrnav3-v4区高通量测序。对12c/13c-三氯生标记的dna样品，选择分层纯化后的3-5重层dna样品直接进行16srrnav3-v4区高通量测序，对比12c和13c重层dna样品的微生物群落结构，从而同时鉴定短程反硝化系统中的活性反硝化菌和三氯生降解菌。结果如图4所示，可以看出flavobacterium和sphingomonas属是系统中的活性短程反硝化菌，thauera和sphingomonas属是系统中的活性三氯生降解菌，特别地sphingomonas属可以同时实现短程反硝化以及三氯生的去除。实施例2一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(1)和(2)中的丙酸钠改为对应的乙酸钠。实施例3一一种基于dna稳定同位素核酸探针技术同时鉴定短程反硝化菌和三氯生降解菌的方法，具体步骤与实施例1基本相同，不同之处在于：步骤(1)和(2)中的丙酸钠改为对应的甲醇。当前第1页12