一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物及其制备方法与流程

文档序号:24557190发布日期:2021-04-06 12:07阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物,其特征在于,包括以下呼吸道病原体核酸中的任意一种或多种:冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、鼻病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌或/和嗜肺军团菌。

2.如权利要求1所述的质控物,其特征在于,所述冠状病毒的核酸为6个4000~5500bp核酸片段。

3.如权利要求1所述的质控物,其特征在于,所述冠状病毒包括:人冠状病毒hcov-nl63、人冠状病毒hcov-229e、人冠状病毒hcov-hku1、人冠状病毒hcov-oc43、srsa-cov、mers-cov或/和新型冠状病毒;所述流感病毒包括:甲型流感病毒h1n1、甲型流感病毒h5n1、甲型流感病毒h7n9、甲型流感病毒h9n2、乙型流感病毒(ivb)或/和副流感病毒(piv)。

4.如权利要求1~3任一项所述的质控物,其特征在于,还包括稀释液,所述稀释液包括以下组分:二甲基亚砜、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸、十二烷基硫酸钠、牛血清白蛋白、异硫氰酸胍、tris-hcl、乙二胺四乙酸和丙三醇;所述稀释液ph值为7.2~7.6。

5.如权利要求1~4任一项所述的质控物,其特征在于,所述人冠状病毒hcov-nl63的标准值为1.2×104copies/μl,人冠状病毒hcov-229e的标准值为1.9×104copies/μl,人冠状病毒hcov-hku1的标准值为1.3×104copies/μl,人冠状病毒hcov-oc43的标准值为2.0×104copies/μl,srsa-cov的标准值为2.0×104copies/μl,mers-cov的标准值为1.8×104copies/μl,新型冠状病毒的标准值为1.6×104copies/μl,甲型流感病毒h1n1的标准值为1.1×104copies/μl,甲型流感病毒h5n1的标准值为1.9×104copies/μl,甲型流感病毒h7n9的标准值为1.5×104copies/μl,甲型流感病毒h9n2的标准值为1.3×104copies/μl,乙型流感病毒的标准值为2.3×104copies/μl,呼吸道合胞病毒的标准值为2.2×104copies/μl,副流感病毒的标准值为1.5×104copies/μl,腺病毒的标准值为1.3×104copies/μl,肺炎支原体的标准值为1.9×104copies/μl,肺炎链球菌的标准值为1.3×104copies/μl,鼻病毒的标准值为2.3×104copies/μl,嗜肺军团菌的标准值为2.1×104copies/μl。

6.一种如权利要求1~4任一项所述的质控物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:

s1制备呼吸道病原体培养物,提取病原体核酸;所述呼吸道病原体包括冠状病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、鼻病毒或/和嗜肺军团菌;

s2采用荧光定量pcr方法检测步骤s1获得的核酸含量,获得每种病原体核酸的原始浓度值;

s3用所述稀释液将步骤s2呼吸道病原体稀释成所需的浓度值,获得所述含有浓度标准值的呼吸道病原体的质控物。

7.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述步骤s1具体采用以下方法实现:

(a)提取所述冠状病毒的核酸:首先,将所述冠状病毒的全长基因组序列划分为6个片段,分别与慢病毒表达载体通过无缝克隆的方法连接,获得6个表达质粒;然后,将经过鉴定序列合格的表达质粒与包装载体共转染包装细胞,获得冠状病毒液,此时,提取的冠状病毒的核酸,分别为6个含有部分基因组序列的核酸片段;

(b)提取所述流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒与鼻病毒的核酸:将流感病毒液、呼吸道合胞病毒液、腺病毒液和鼻病毒液分别与感染的宿主细胞混合培养后,收获病毒,提取其核酸;

(c)提取肺炎支原体、嗜肺军团菌与肺炎链球菌的核酸:分别将肺炎支原体、嗜肺军团菌与肺炎链球菌接种至培养基后,获得其培养液后,提取其核酸。

8.如权利要求7所述的制备方法,其特征在于,所述提取核酸采用磁珠法核酸提取试剂盒提取。

9.如权利要求6所述的制备方法,其特征在于,所述方法还包括以下步骤:

(1)将s3的核酸分装,对其性能进行评估分析;

(2)采用微滴式数字pcr法对步骤s3的质控物进行绝对定量检测,确定待测量值。

10.如权利要求1所述的质控物在检测呼吸道病原体中的应用。


技术总结
本发明提供了一种用于检测呼吸道病原体核酸的质控物包括以下呼吸道病原体中的任意一种或多种:冠状病毒、流感病毒、腺病毒、肺炎支原体、肺炎链球菌、鼻病毒或/和嗜肺军团菌。本发明将冠状病毒的全长基因组序列划分为6个目的片段,每个片段的长度为4000~5500bp。本发明的质控物覆盖了冠状病毒所有检测靶序列(或靶点),覆盖面广泛,检测靶点全面,不会出现漏检的现象。本发明的质控物包含了主要的感染呼吸道病原体,涵盖的范围较广,且以真实病毒样本以及慢病毒样本为原材料,具有更准确的检测靶点。本发明制备冠状病毒质控物通过慢病毒载体将靶基因序列整合到宿主基因组中,并在制备过程中敲除了自主复制的基因,并具有“自我失活”能力,使该重组慢病毒不能在靶细胞内复制并感染其他细胞。

技术研发人员:李尔华;高旭年;钟凤然;吴淑贤
受保护的技术使用者:广州邦德盛生物科技有限公司
技术研发日:2020.12.25
技术公布日:2021.04.06
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