一种香菇申香18号菌株的InDel标记指纹图谱及其构建方法

一种香菇申香18号菌株的indel标记指纹图谱及其构建方法
技术领域
1.本发明属于香菇菌种的检测领域，具体涉及一种香菇申香18号菌种的indel标记指 纹图谱及其构建方法。


背景技术：

2.香菇(lentinula edodes(berk.)pegler)因具有较高的营养价值和药用价值，而备受消 费者欢迎。中国是世界上最早进行香菇人工栽培的国家，栽培历史已有800多年，目前 香菇是国内栽培最广、产量最高的菇种。据中国食用菌协会统计，2018年中国食用菌总 产量为3842.04万吨，其中香菇总产量为1043.12万吨，占国内食用菌总产量的27.12％， 占世界香菇总产量的90％以上。近年来香菇产业成为国内精准扶贫的重要抓手，据统计 全国超过20％以上的国家级贫困县选择香菇作为重要产业，我国香菇栽培规模进一步扩 大，但随着我国香菇产业的快速发展，香菇生产用种“同种异名，异种同名”的问题日益 突出，这不仅损害了香菇育种者的知识产权更为生产者造成了极大地风险，为香菇产业 进一步发展造成了隐患。为保障育种者的权益和降低生产者的风险，促进我国香菇产业 健康、稳定和可持续发展，建立一种简便、快速、可靠的香菇菌种特异性鉴定技术迫在 眉睫。
3.随着生物信息学的快速发展，dna测序技术的不断成熟，测序的通量在不断增加而 成本在降低。dna分子标记技术能够从基因水平上检测香菇菌种的遗传特异性，香菇 全基因组测序的完成为indel标记的开发提供了便利。indel分子标记是一种基于高通 量测序技术的应用，降低了indel标记开发的成本，适用于香菇全基因组测序分子标记 的开发。且indel标记具有数量丰富、准确性高、稳定性好、快捷简便等优点，不仅用 于分子标记辅助育种，而且也可用于香菇菌株鉴定。


技术实现要素：

4.本发明所要解决的技术问题是提供一种香菇申香18号菌种的indel标记指纹图谱及 其构建方法与应用，该指纹图谱与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检 测时间短，准确性高，重复性好的优点。
5.本发明的一种香菇申香18号菌种的indel标记指纹图谱，该指纹图谱由7对indel 标记组成，是基于香菇基因组插入/缺失片段开发的indel标记引物，扩增带型好，重复 性高，标记详细信息如表1。
6.表1 indel标记引物信息列表
[0007][0008]
本发明还提供了一种香菇申香18号菌种的indel标记指纹图谱的应用，是利用香菇 基因组插入/缺失片段开发的7对indel标记引物，对香菇菌种进行indel标记扩增，将 得到的带型与申香18号菌种的带型对照，与该带型一致即为香菇申香18号菌种；
[0009]
其中香菇申香18号菌种的带型编号组合为：(1+2)2(1+2)(1+2)(1+2)2(1+2)。
[0010]
通过对收集的44个香菇品种的indel标记引物带型扩增，本发明确定了7对indel 标记引物在44个香菇品种中扩增出的等位片段的数量并编号(表2)，通过不同indel 等位位点的编号组合可有效识别申香18号菌种(图2
‑
8)。通过dna分子量对照d2000bpdna ladder可确定各indel标记引物扩增的等位位点的相对分子量，存在申香18号菌 种特异indel等位片段组合的菌种，即是香菇申香18号菌种，该菌种的编号组合为： (1+2)2(1+2)(1+2)(1+2)2(1+2)。
[0011]
表2 indel引物扩增的等位片段信息汇总表
[0012]
[0013][0014]
本发明还提供了上述香菇申香18号菌种的indel标记指纹图谱的构建方法，该方法 包括如下步骤：
[0015]
(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基pda中，23～22℃下避光摇 瓶培养，10d后收集菌丝；
[0016]
(2)基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光 度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为20～30ng/ul；
[0017]
ctab法提取菌丝的基因组dna工艺包括：
[0018]
①
取冷冻干燥后的香菇菌丝于2ml离心管中，并放入2
‑
3颗钢珠；
[0019]
②
将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60hz，时间30s研磨至均匀粉末；
[0020]
③
加入62℃预热1h的2
×
ctab抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混 匀一次；
[0021]
④
12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800ul；
[0022]
⑤
在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混 匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
[0023]
⑥
在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min， 12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；
[0024]
⑦
在上述离心管中加入相对于步骤
⑥
中的上清液2/3体积的
‑
20℃预冷的异丙醇，混 匀，
‑
20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；
[0025]
⑧
将得到的沉淀加入1ml浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；
[0026]
⑨
弃乙醇，超净工作台中吹干；加入100μl 10
×
te缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解， 加入1μl 10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；
[0027]
⑩
将得到的dna提取物于
‑
20℃冰箱贮藏备用；
[0028]
indel分子标记的检测：对上述提取的dna进行全基因组indel标记的pcr扩增；
[0029]
pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premix taq
tm
(1.22u/22μl taq dna酶， 0.4mm/l dntp，0.3mm/l pcr buffer)10μl，10μmol/l indel标记正向引物和反向引物 总体积各1μl，浓度20～30ng/μl提取的模板dna 2μl，ddh2o 6μl；
[0030]
pcr反应条件：94℃2min；94℃42second，22
‑
60℃42second，72℃30second， 32个循环；72℃7min；10℃保存；
[0031]
电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物，点样7μl于加入核酸染料的琼脂糖凝胶 上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1
×
tae，电压90v，电 流300ma，
功率100w，电泳2h，拍照，分析结果；
[0032]
采用7对indel标记引物对香菇菌株进行pcr扩增，通过dna分子量对照d2000bpdna ladder可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，找到符合编 号组合为：(1+2)2(1+2)(1+2)(1+2)2(1+2)的菌种，即可确定该菌种为香菇 申香18号菌种。
[0033]
本发明的有益效果
[0034]
本发明的香菇申香18号菌种的indel标记指纹图谱可用于申香18号菌种的鉴别， 与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高，重复性好 的优点。检测所需时间只需要3
‑
4天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间， 出菇试验则需要至少3个月的时间；该方法在所收集的我国44个香菇菌种中具有申香 18号菌种的专一性，具有良好的应用前景。
附图说明
[0035]
图1为香菇申香18号菌种indel标记指纹图谱，其中m是d2000bp dna ladder，数 字1
‑
7代表的是所用的7对indel标记引物，箭头所指的是香菇申香18号菌种的特异 性indel等位片段组合；
[0036]
图2为引物lefp_id001在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0037]
图3为引物lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0038]
图4为引物lefp_id003在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0039]
图5为引物lefp_id004在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0040]
图6为引物lefp_id002在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0041]
图7为引物lefp_id006在所选44个香菇材料中的扩增图谱；
[0042]
图8为引物lefp_id007在所选44个香菇材料中的扩增图谱。
具体实施方式
[0043]
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技 术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书 所限定 的范围。
[0044]
marker、premix taq
tm
均购自:takala bio宝日医生物技术有限公司
[0045]
其余材料和试剂均为普通市售产品。
[0046]
44个菌株来源：
[0047]
1、cv108菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；2、香九菌株，来源广东省 微生物研究所；3、l7402菌株，来源松阳县食药用菌研究所；4、8404菌株，来源湖北 省宜昌森源食用菌有限公司；2、华香2号菌株，来源华中农业大学；6、cv442菌株， 来源上海市农业科学院食用菌研究所；7、广香菌株，来源广东省微生物研究所；8、l132 菌株，来源福建省三明真菌研究所；9、l9319菌株，来源浙江省丽水市大山菇业研究 开发有限公司；10、闽丰1号菌株，来源福建省三明真菌研究所；11、森源1号菌株， 来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；12、申香18号菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；13、香如菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；14、申香12 号菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；12、
cv102菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；16、l241菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；17、香杂26 菌株，来源广东省微生物研究所；18、l9608菌株，河南西峡县食用菌科研中心；19、 z3244菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；20、申香16号菌株，来源上海市 农业科学院食用菌研究所；21、华香8号菌株，来源华中农业大学；22、n7菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；23、rbl1菌株，来源上海市农业科学院食用菌研 究所；24、z3210菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；22、沪香f2菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；26、l241
‑
4菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技 术研究中心；27、l26菌株，来源福建省三明真菌研究所；28、菌兴8号菌株，来源浙 江省丽水市食用菌研究开发中心；29、cv201菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究 所；30、苏香菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；31、l922菌株，来源华中 农业大学；32、z3239菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；33、z3243菌株， 来源上海市农业科学院食用菌研究所；34、hk3161菌株，来源上海市农业科学院食用 菌研究所；32、l212菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；36、l868菌株，来 源上海市农业科学院食用菌研究所；37、tw1121菌株，来源上海市农业科学院食用菌 研究所38、l9102菌株，来源浙江省庆元县食用菌科学技术研究中心；39、申香12号 菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；40、j868菌株，来源上海市农业科学院食 用菌研究所；41、森源10号菌株，来源湖北省宜昌森源食用菌有限责任公司；42、wd4204 菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所；43、wd2140菌株，来源上海市农业科学 院食用菌研究所；44、931菌株，来源上海市农业科学院食用菌研究所。
[0048]
其中7对indel标记引物序列(2
′‑3′
)如下：
[0049]
lefp_id001正向引物：acggatggagagacacagga
[0050]
反向引物：tgccccacttactctcaacc
[0051]
lefp_id002正向引物：cctttctcaaaagcggactg
[0052]
反向引物：gggagtgggttgtttggata
[0053]
lefp_id003正向引物：cggatgttatgcactggaag
[0054]
反向引物：cgtacggttggacatttgaa
[0055]
lefp_id004正向引物：agcctttcacagtcagctcg
[0056]
反向引物：gtcaacggagggaaacagag
[0057]
lefp_id002正向引物：gtagcactcctcatacaacc
[0058]
反向引物：accaaatgtcacagcacagg
[0059]
lefp_id006正向引物：acattggcgaaggctgtacg
[0060]
反向引物：cccttttgccctataaggcg
[0061]
lefp_id007正向引物：aacagtaacctgtgcactgc
[0062]
反向引物：catgatcagatcacacagcg。
[0063]
引物由上海生工生物工程有限公司合成。
[0064]
实施例1
[0065]
(1)菌丝培养：将香菇菌丝转接到马铃薯葡萄糖培养基pda中，23～22℃下避光 摇瓶培养，10d后收集菌丝；
[0066]
(2)基因组dna的提取：用ctab法提取上述菌丝的基因组dna，紫外分光光 度法检测总基因组dna浓度和纯度，调整样品dna的浓度为20～30ng/ul；
[0067]
ctab法提取菌丝的基因组dna工艺包括：
[0068]
①
取冷冻干燥后的香菇菌丝于2ml离心管中，并放入2
‑
3颗钢珠；
[0069]
②
将离心管放入多样品组织研磨机中，设置频率60hz，时间30s研磨至均匀粉末；
[0070]
③
加入62℃预热1h的2
×
ctab抽提液，于62℃保温60min，间隔20min轻摇混 匀一次；
[0071]
④
12000rpm、4℃离心20min，分装上清液，分装两管各800ul；
[0072]
⑤
在上述上清液中加入体积比为22：24：1的酚、氯仿和异戊醇的混合液，轻轻混 匀10min，12000rpm、4℃离心10min，取上清液移入新的离心管中；
[0073]
⑥
在上述离心管中加入体积比为24：1的氯仿和异戊醇混合液，轻轻混匀10min， 12000rpm、4℃离心10min，取上清液(记录体积)移入另一离心管中；
[0074]
⑦
在上述离心管中加入相对于步骤
⑥
中上清液2/3体积的
‑
20℃预冷的异丙醇，混匀，
ꢀ‑
20℃下静置沉淀1h，之后8000rpm、4℃离心10min，弃上清；
[0075]
⑧
将得到的沉淀加入1ml浓度为70％乙醇洗涤1次，8000rpm，室温离心2min；
[0076]
⑨
弃乙醇，超净工作台中吹干。加入100μl10
×
te缓冲液，轻轻敲打使沉淀溶解， 加入1μl 10mg/ml的rnasea于37℃水浴1h，去除rna；
[0077]
⑩
将得到的dna提取物于
‑
20℃冰箱贮藏备用；
[0078]
(3)indel分子标记的检测：对上述提取的dna进行全基因组indel标记的pcr 扩增；
[0079]
pcr扩增体系为：总体积20μl，包括：premix taq
tm
(1.22u/22μl taq dna酶，0.4 mm/l dntp，0.3mm/l pcr buffer)10μl，10μmol/l indel标记正向引物和反向引物总 体积各1μl，浓度20～30ng/μl提取的模板dna 2μl，ddh2o 6μl；
[0080]
pcr反应条件：94℃2min；94℃42second，22
‑
60℃42second，72℃30second， 32个循环；72℃7min；10℃保存；
[0081]
(4)电泳检测：将上述pcr扩增得到的产物，点样7μl于加入核酸染料的琼脂糖 凝胶上电泳，琼脂糖凝胶的体积百分比浓度为2.2％，电泳缓冲液为1
×
tae，电压90v， 电流300ma，功率100w，电泳2h，拍照，分析结果；
[0082]
采用7对indel标记引物分别对香菇菌株进行pcr扩增，通过dna分子量对照 d2000bp dna ladder可确定各indel标记引物扩增的等位片段的数量和相对分子量，如 图1所示，找到符合编号组合为：(1+2)2(1+2)(1+2)(1+2)2(1+2)的菌种， 即可确定该菌种为香菇申香18号菌种，图2
‑
8中的编号12即为申香18号菌种，其条 带与图1的一致。