cBIN1抗体及其应用的制作方法

本发明涉及免疫
技术领域：
，尤其涉及cbin1抗体及其应用。
背景技术：
：心衰是多种原因导致的心脏结构和/或功能的异常改变，使心室收缩和/或舒张功能发生障碍，从而引起的一组复杂的临床综合征。心衰是各种心脏疾病的严重表现或晚期阶段，死亡率和再住院率居高不下。近几年各地的资料显示，我国心衰的患病率已显著增加至2％～3％，现症患者约1000万。心衰心肌的核心病理改变是钙离子传输能力变弱，使心肌的收缩能力受限制。而导致心衰特征性的钙离子传输障碍的原因是兴奋-收缩(excitation-contraction)(e-c)失耦联与非同步的钙释放。生理条件下，膜电位去极化后诱发同步的钙释放，使钙离子穿过细胞膜，在肌浆网内触发更多的钙释放，即钙诱导的钙释放calcium-induced-calcium-release(cicr)过程。健康的和理想状态下的cicr过程依赖于位于心肌细胞之间结合部肌浆网膜上的兰尼碱受体(ryanodinereceptors，ryrs)和横管(transverse-tubule，t-tubule)膜上的l型钙离子通道(l-typecalciumchannels，ltccs)之间的紧密协作。横管内的ltccs与结合部肌浆网膜上的ryrs形成了影响细胞浆外钙离子转运的二聚体复合物。心肌受各种原因导致的压力负荷增加而导致的病理性肥厚过程中，大量的横管结构发生错乱和重构，同时也伴随着这些二聚体结构的破坏，并最终导致非同步的cicr过程，并逐渐由肥厚失代偿发展为心衰。心衰时，除了横管的形态学上的一系列重构改变，受损的ltcc转移到横管，与ryrs形成二元复合体的过程也被扰乱，ga2+转移能力下降，进而导致e-c失耦联与心脏功能下降。bin蛋白(bar蛋白编码基因)可分为amphiphysini、ampii(又称bin1)、bin2、bin3四种蛋白。作为含有bar域的蛋白质超家族，bin1包含一个特征由外显子1～9编码的n端条域(n-bar)。有趣的是，bin1的带有20个外显子的基因根据不同的拼接方案生成不同的bin1蛋白而具有不同的细胞功能。心肌横管内心脏桥接整合因子1(cardiacbridgingintegrator1，cbin1)就是带有13，17两个外显子的bin1蛋白亚型。研究表明，cbin1参与形成的横管微结构域具有促进和维持ltcc-ryr二元复合体形成的功能。现有的研究结果表明，拥有cbin1的微结构域可以通过以下4项机制促进有效的ltcc-ryr二元复合体的形成：1)促进ltccs通过微结构域向前转运；2)促进已经转移到横管的ltccs聚集成簇；3)在横管腔内形成保护性的细胞外钙离子的慢速弥散区，以控制ltccs的转移动力；4)将胞浆内的ryrs重新召集会交界区肌浆网膜上，便于与ltccs形成新的二元复合体。同时，cbin1微结构域通过续膜翻转和急性应激刺激下快速重组的能力，对维持心肌横管的稳态发挥了作用。与此同时，研究发现，在心衰相关刺激刺激下，cbin1微结构域会因为cbin1的转录减少而丢失，并伴随着二元复合体形成的减少和心肌收缩力的损伤。也就是说，当cbin1表达减少减少时，横管的微结构域结构会发生紊乱，进而降低心脏收缩能力和对β受体的反应。因此，cbin1有望成为一种新型的心衰标记物。如果能够有效的检测心肌或血液内cbin1的表达水平，可以客观的评价心脏结构完整性和功能状态，为心衰的评估，治疗提供客观可靠的依据，指导心衰的治疗。开发检测cbin1的敏感抗体将有效促进对该标记物的检测和评估，为临床诊断和治疗心衰提供新的可靠的参考。技术实现要素：有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供cbin1抗体及其应用。本发明提供的cbin1抗体，其重链包含三个cdr区，其中至少一个cdr区的氨基酸序列具有如seqidno:1、2或3所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；其轻链包含三个cdr区，其中至少一个cdr区的氨基酸序列具有如seqidno:4、5或6所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。在本发明中，所述cbin1抗体重链的三个cdr区分别具有如seqidno:1、2和3所示的氨基酸序列；轻链的三个cdr区分别具有如seqidno:4、5和6所示的氨基酸序列。在本发明一些实施例中，所述cbin1抗体重链的三个cdr区的氨基酸序列依次如seqidno:1、2和3所示；轻链的三个cdr区的氨基酸序列依次如seqidno:4、5和6所示。其中，seqidno:1所示的序列为gfnikds；seqidno:2所示的序列为dpedgd；seqidno:3所示的序列为stlvatpwffdv；seqidno:4所示的序列为sasqdinnyln；seqidno:5所示的序列为ytsylhs；seqidno:6所示的序列为hqctnnlpwt。本发明提供的cbin1抗体，其重链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno:9、10、11或12所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列；其轻链包含4个fr区，其中至少一个fr区的氨基酸序列具有如seqidno:13、14、15或16所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％序列同源性的序列。在本发明中，所述cbin1抗体重链的4个fr区分别具有如seqidno:9、10、11或12所示的氨基酸序列；轻链的4个fr区分别具有如seqidno:13、14、15、16所示的氨基酸序列。在本发明一些实施例中，所述cbin1抗体重链的4个fr区的氨基酸序列依次如seqidno:9、10、11或12所示；轻链的4个fr区的氨基酸序列如seqidno:13、14、15、16所示。其中，seqidno:9所示的序列为evqlqqsgaelvrpgasvklsctas；seqidno:10所示的序列为ymhwvkqrpeqglewigri；seqidno:11所示的序列为teyapkfqgkatmtadtssntaylqvssltsedtavyycst；seqidno:12所示的序列为wgpgttvtvss；seqidno:13所示的序列为diqmtqttsslsaslgdrvtisc；seqidno:14所示的序列为wyqqkpdgtvklliy。seqidno:15所示的序列为gvpsrfsgsgsgtdysltisnlepediatyyc；seqidno:16所示的序列为fgggtkleik。本发明中，所述具有至少80％序列同源性的序列为在原序列的基础上，经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列中，所述多个为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个或41个。一些实施例中，本发明所述的cbin1抗体的重链可变区具有如seqidno:7所示的氨基酸序列；其轻链可变区具有如seqidno:8所示的氨基酸序列。本发明还提供了编码所述的抗体的核苷酸。本发明提供了编码所述抗体重链的核苷酸序列。本发明提供了编码所述抗体轻链的核苷酸序列。本发明中，所述编码抗体重链可变区的核苷酸具有与seqidno:17所示的核苷酸序列，或为其经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seqidno:17所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，编码所述抗体重链可变区的核苷酸序列如seqidno:17所示或为seqidno:17的反向互补序列。本发明中，所述编码抗体轻链可变区的核苷酸具有与seqidno:18所示的核苷酸序列，或为其经取代、缺失或添加一个或多个核苷酸获得的、且与seqidno:18所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列。在本发明的一些具体实施方案中，编码所述抗体轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:18所示或为seqidno:18的反向互补序列。本发明还提供了一种表达载体，其包括编码本发明所述cbin1抗体的核苷酸。本发明还提供了转化或转染所述的表达载体的宿主细胞。本发明所述的cbin1抗体的制备方法，包括：培养本发明所述宿主细胞、诱导cbin1抗体的表达。本发明还提供了经化学标记或生物标记的所述的cbin1抗体。本发明中，所述化学标记为同位素、免疫毒素和/或化学药物；所述生物标记为生物素、亲和素或酶标记。所述酶标记优选为辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。所述免疫毒素优选为黄曲霉毒素、白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、相思子毒蛋白、槲寄生凝集素、蒴莲根毒素、pap、造草素、白树毒素或丝瓜毒素。本发明还提供了所述cbin1抗体与固体介质或半固体介质偶联制得的偶联物。本发明中所述固体介质或非固体介质选自胶体金、聚苯乙烯平板或珠粒。本发明所述cbin1抗体或所述的偶联物在制备检测cbin1表达的产品中的应用。本发明还提供了一种试剂盒，其包括所述cbin1抗体或所述的偶联物。本发明所述的试剂盒中还包括elisa检测试剂或者westernblot检测试剂。本发明还提供了一种cbin1的检测方法，其采用本发明提供的试剂盒通过elisa法或westernblot法对样品中的cbin1进行检测。所述样品为心肌样品或者血液样品。本发明还提供了心衰的诊断方法，即采用发明提供的试剂盒通过elisa法或westernblot法对心肌或血液样品中的cbin1进行检测。所述样品为心肌样品或者血液样品。本发明提供的cbin1抗体的重链的三个cdr区分别具有如seqidno:1、2和3所示的氨基酸序列；轻链的三个cdr区分别具有如seqidno:4、5和6所示的氨基酸序列。该抗体与抗原具有良好的结合能力，以其制备试剂能够实现对目标抗原的准确检测。附图说明图1示抗体与cbin1isoformii2和cbin1isoformii3的elisa结合曲线；图2示wb检测中抗体与蛋白结合效果。具体实施方式本发明提供了cbin1抗体及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照j.sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及f.m.ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，johnwiley&sons,inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用l-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。所述“抗体”是指由能特异结合抗原的一种或多种多肽构成的蛋白质。抗体的一种形式构成了抗体的基本结构单元。这种形式是四聚物，它由两对完全相同的抗体链构成，每一对都有一个轻链和一个重链。在每对抗体链中，轻链和重链的可变区联合在一起共同负责结合抗原，而恒定区则负责抗体的效应器功能。所述抗体重链或轻链的“可变区”是该链的n端成熟区域。目前已知的抗体类型包括κ和λ轻链，以及α，γ(igg1，igg2，igg3，igg4)，δ，ε和μ重链或它们的其它类型等价物。全长的免疫球蛋白“轻链”(大约25kda或大约214个氨基酸)包含一个由nh2-末端上大约110个氨基酸形成的可变区，以及一个cooh-末端上的κ或λ恒定区。全长的免疫球蛋白“重链”(大约50kda或大约446个氨基酸)，同样包含一个可变区(大约116个氨基酸)，以及重链恒定区之一，例如γ(大约330个氨基酸)。“抗体”包括任何同型体的抗体或免疫球蛋白，或保持与抗原特异结合的抗体片段，包括但不限于fab，fv，scfv和fd片段、嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体以及包含抗体的抗原结合部分和非抗体蛋白质的融合蛋白质。抗体可以被标记和检测，例如，可以通过放射性同位素、能产生可检测物的酶、荧光蛋白质、生物素等等进行标记并被检测。抗体还可以结合于固相载体，包括但不限于聚苯乙烯平板或珠粒等等。本文使用的“cdr区”或“cdr”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高变区，如kabatetal.所定义(kabatetal.,sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,5thed.,u.s.departmentofhealthandhumanservices,nih,1991,以及以后版本)。存在三个重链cdr和三个轻链cdr。根据情况，本文所用术语cdr或cdrs是为了指示这些区域之一、或者这些区域的几个或者甚至全部，所述区域包含通过抗体对抗原或其识别表位的亲和力而负责结合的大部分氨基酸残基。本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例1：用于免疫的抗原的合成本发明的抗原为人源cardiacbridgingintegrator1外显子13(cbin1exon13)对应蛋白序列lrkgppvppppkhtpskevkqeqilslfedtfvpeisvttpsq，用于免疫的多肽吉尔生化公司通过郭化学方法合成，为提高抗原免疫原性，该多肽c端通过二硬脂酸酯(peg4)偶联钥孔血蓝蛋白(klh,keyholelimpethemocyanin)。实施例2：抗人源cbin1exon13抗体的产生为了获得鼠源抗人cbin1exon13抗体，使用表1.1中免疫策略(表1)来免疫不同品系小鼠(balb/c,上海灵畅生物；sjl，北京维通利华)。所使用的抗原如实施例1中所描述；佐剂包括：完全弗氏佐剂cfa(invivogen公司，货号vac-cfa-60)、ifa(invivogen公司，货号vac-ifa-60)。在终疫3天后将免疫小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0使用聚乙二醇法进行融合，得到既能表达抗体又能在体外无限增殖的b细胞融合，并且在hat选择培养基中培养。将融合后的杂交瘤细胞铺在96孔细胞培养板中，并且通过初级筛选挑选出阳性克隆进行2轮亚克隆。表1.免疫策略实施例3：抗人源cbin1exon13抗体可变区序列测定离心收集杂交瘤细胞，每5×106～10×106细胞加入1mltrizol和0.2ml氯仿，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟，离心取水相加入0.5ml异丙醇，室温放置10分钟后收集沉淀，乙醇洗涤后干燥得到rna。在冰浴离心管里面加入模板rna和引物，使引物和模板正确配对后进行反转录过程，在进行pcr扩增。4个微量离心管中各加入dntp/ddntp混合物2.5μl,混合物37℃温浴5min,备用。在一个空的微量离心管中加入1pmol的pcr扩增双链dna,10pmol测序引物,2μl5×测序缓冲液,加双蒸水至总体积10μl,96℃加热8min,冰浴泠却1min,4℃10000g离心10s。加入2μl预冷的标记混合物(dctp、dgtp、dttp各0.75μmol/l),α-32p-datp5μci,1μl0.1mol/lddt,测序酶2u,加水至15μl,混匀后置冰上2min,标记新合成的dna链。3.5μl标记反应混合物加入到准备好的4个微量离心管中,37℃温浴5min.每管各加入4μl终止液。样品在80℃的水浴中热变性5min,每一泳道加2μl加到测序胶上,电泳分离这些片段，收集序列信息。获得鼠源抗体(记为8b10-g9-e6)的vh和vl序列如下表所示。进一步，还使用kabat等人描述的方法(kabat等，sequencesofproteinsofimmunologicalinterest,第五版，publichealthservice，美国国立卫生研究院，贝塞斯达、马里兰州(1991)，第647-669页)，确定了鼠源单抗的cdr序列。表2.鼠源抗体的序列信息表3抗体序列4：抗人源cbin1exon13抗体结合活性评价4.1抗体(8b10-g9-e6)在酶联免疫吸附(elisa)中结合活性按以10μg/ml起始浓度，三倍稀释，11个检测点稀释抗体。分别用吉凯基因化学有限公司重组表达的蛋白cbin1isoformii2(cbin1exon1-13&18-20)和cbin1isoformii3(cbin1exon1-12&18-20)作为包被抗原，0.1μg/well包板。将稀释好的抗体加入elisa板，每孔100ul。室温孵育1h，洗板。二抗按1:10000稀释，每孔加100ul，室温孵育1h，洗板。tmba液与b液按1:1混合，每孔100ul室温孵育5min显色。显色结束后每孔加入50ul2％h2so4终止反应，od450读数。graphpadprism6分析数据，计算抗体结合cbin1isoformii2和cbin1isoformii3的ec50值。抗体结合曲线如图1所示，抗体和两种蛋白的结合ec50如表3所示。表3.抗体与抗原的eslia结合ec50(μg/ml)抗体cbin1isoformii2cbin1isoformii38b10-g9-e60.054不结合阳性对照抗体0.614抗体8b10-g9-e6高亲和力结合含有exon13的cbin1isoformii2蛋白，且不结合缺失exon13的cbin1isoformii3蛋白，说明抗体8b10-g9-e6对于cbin的结合在其exon13对应的区域。抗体8b10-g9-e6在酶联免疫吸附中的结合活性比阳性对照抗体(novus,nbp2-21689)高11-12倍。4.2抗体在免疫印迹实验中(wb)结合活性wb中使用吉凯基因化学有限公司重组表达的蛋白cbin1isoformii2(cbin1exon1-13&18-20)，在120ma电流下，蛋白在12％sds-page胶上电泳1小时。电泳结束后，使用转移电泳装置，在4℃、300ma恒流条件下电转150min，将蛋白转移到pvdf膜上。分别使用抗体1f3-d11-b和阳性对照抗体(novus,nbp2-21689)在10μg/ml浓度下进行一抗孵育，与封闭好的pvdf膜室温孵育2小时，清洗后与二抗孵育，室温下孵育pvdf膜1.5小时，彻底清洗后显影。结果如图2。如图2所示，抗体8b10-g9-e6在wb中高亲和力结合含有exon13的cbin1isoformii2蛋白，且抗体8b10-g9-e6的结合量显著高于阳性对照抗体(novus,nbp2-21689)。以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>中南大学湘雅二医院<120>cbin1抗体及其应用<130>mp2037305<160>18<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glypheasnilelysaspser15<210>2<211>6<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2aspprogluaspglyasp15<210>3<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3serthrleuvalalathrprotrpphepheaspval1510<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4seralaserglnaspileasnasntyrleuasn1510<210>5<211>7<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5tyrthrsertyrleuhisser15<210>6<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6hisglncysthrasnasnleuprotrpthr1510<210>7<211>121<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gluvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyala151015servallysleusercysthralaserglypheasnilelysaspser202530tyrmethistrpvallysglnargprogluglnglyleuglutrpile354045glyargileaspprogluaspglyaspthrglutyralaprolysphe505560glnglylysalathrmetthralaaspthrserserasnthralatyr65707580leuglnvalserserleuthrsergluaspthralavaltyrtyrcys859095serthrserthrleuvalalathrprotrpphepheaspvaltrpgly100105110proglythrthrvalthrvalserser115120<210>8<211>108<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilesercysseralaserglnaspileasnasntyr202530leuasntrptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuile354045tyrtyrthrsertyrleuhisserglyvalproserargphesergly505560serglyserglythrasptyrserleuthrileserasnleuglupro65707580gluaspilealathrtyrtyrcyshisglncysthrasnasnleupro859095trpthrpheglyglyglythrlysleugluilelys100105<210>9<211>25<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>9gluvalglnleuglnglnserglyalagluleuvalargproglyala151015servallysleusercysthralaser2025<210>10<211>19<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>10tyrmethistrpvallysglnargprogluglnglyleuglutrpile151015glyargile<210>11<211>41<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11thrglutyralaprolyspheglnglylysalathrmetthralaasp151015thrserserasnthralatyrleuglnvalserserleuthrserglu202530aspthralavaltyrtyrcysserthr3540<210>12<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>12trpglyproglythrthrvalthrvalserser1510<210>13<211>23<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>13aspileglnmetthrglnthrthrserserleuseralaserleugly151015aspargvalthrilesercys20<210>14<211>15<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>14trptyrglnglnlysproaspglythrvallysleuleuiletyr151015<210>15<211>32<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>15glyvalproserargpheserglyserglyserglythrasptyrser151015leuthrileserasnleugluprogluaspilealathrtyrtyrcys202530<210>16<211>10<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>16pheglyglyglythrlysleugluilelys1510<210>17<211>363<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>17gaggttcagctgcagcagtctggggcagaacttgtgaggccaggggcctcagtcaagttg60tcctgcacagcttctggcttcaacattaaagactcctatatgcactgggtgaagcagagg120cctgaacagggcctggagtggattggaaggattgatcctgaggatggtgatactgaatat180gccccgaagttccagggcaaggccactatgactgcagacacatcctccaacacagcctac240ctgcaggtcagcagcctgacatctgaggacactgccgtctattactgttctacatctacg300ctagtagccacgccctggttcttcgatgtctggggcccagggaccacggtcaccgtctcc360tca363<210>18<211>324<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>18gatatccagatgacacagactacatcctccctgtctgcctctctgggagacagagtcacc60atcagttgcagtgcaagtcaggacattaacaattatttaaactggtatcagcagaaacca120gatggaactgttaaactcctgatttattacacatcatatttacactcaggagtcccatca180aggttcagtggcagtgggtctgggacagattattctctcaccatcagcaacctggaacct240gaagatattgccacttactattgtcaccagtgtactaataaccttccgtggacgttcggt300ggaggcaccaagctggaaatcaaa324当前第1页12