用于降低细胞衰老的来自人肝干细胞的胞外囊泡(HLSC-EV)的制作方法

用于降低细胞衰老的来自人肝干细胞的胞外囊泡(hlsc-ev)
技术领域
1.本发明涉及用于降低细胞衰老和用于治疗衰老相关疾病和病症的来源于干细胞的胞外囊泡的制剂。


背景技术：

2.细胞之间囊泡介导的通信在许多生物过程中显得至关重要。从细胞释放的小囊泡最近已成为细胞间通信的重要介质。这些囊泡(已被称为胞外囊泡(extracellular vesicle，ev))包括从内体细胞膜区室释放的外排体和通过质膜出芽从细胞表面释放的微囊泡(microvesicle)。ev的蛋白质、脂质和核酸的含量随着来源细胞而变化，并且在并入到接受体细胞(recipient cell)中之后，它们可传递可以改变接受体细胞的表型和功能的信息。
3.细胞衰老是细胞停止分裂的现象。在过去的数十年里，这种现象已成为导致老化和年龄相关疾病和病症的重要促进因素。现有证据表明，由于祖细胞中细胞周期阻滞，衰老导致组织修复能力损失。此外，衰老细胞产生所谓的衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype，sasp)中的促炎和基质降解分子。因此，细胞衰老已成为治疗开发的有吸引力的靶标。
4.能够在细胞培养物中特异性杀伤衰老细胞的药物(称为抗衰老药物(senolytic))能够在体内降低细胞衰老并抵抗老化以及年龄相关疾病和病症。现有技术中已知多种抗衰老药物，包括hsp90抑制剂、bcl-2家族抑制剂、荜茇酰胺(piperlongumine)、foxo4抑制肽和达沙替尼(dasatinib)/槲皮素(quercetin)的组合。此外，国际专利申请wo 2017/189842公开了用于治疗患有由干细胞功能障碍或衰老提高引起的疾病或病症的患者的方法，其包括向患者施用包含从比待治疗患者更年轻或更健康的对象的干细胞中获得的胞外囊泡(ev)的组合物。wo 2017/189842特别提及了间充质干细胞作为胞外囊泡的来源。
5.发明概述
6.本发明人现在出人意料地发现，与来源于间充质干细胞(mesenchymal stem cells，msc)的胞外囊泡相比，来源于人肝干细胞的胞外囊泡在降低细胞衰老方面是更加有效的。
7.因此，本发明的第一方面是来源于人肝干细胞的胞外囊泡的制剂，其能够强有力地降低细胞衰老。
8.本发明的第二方面是来源于人肝干细胞的胞外囊泡的制剂，其用于细胞衰老或细胞衰老相关疾病或病症的治疗性治疗。
9.本发明的第三方面是在含细胞的生物样品中降低细胞衰老的体外或离体方法，其包括使含细胞的生物样品与来源于人肝干细胞的胞外囊泡的制剂接触。
10.本发明的第四方面是在有此需要的对象中降低细胞衰老的方法，其包括向对象施用有效量的来源于人肝干细胞的胞外囊泡的制剂。
11.本发明的第五方面是在有此需要的对象中治疗细胞衰老相关疾病或病症的方法，
其包括向对象施用有效量的来源于人肝干细胞的胞外囊泡的制剂。
12.本发明的第六方面是制备来源于人肝干细胞的胞外囊泡的药物制剂的方法，所述制剂能够强有力地降低细胞衰老。根据本发明第六方面的方法包括以下步骤：
13.(a)从体液的多种制备物中或从细胞培养物的条件培养基中分离ev；
14.(b)以预定的ev浓度从所分离的ev制备一个或更多个样品；
15.(c)在测量细胞衰老降低的效力测试中测试每个ev样品的活性，其中衰老在基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定中使用未用ev处理的受试衰老细胞作为对照来测量；以及
16.(d)选择其中测量的细胞衰老降低超过预定阈值的制剂；
17.任选地，本发明的方法还包括将步骤(d)中选择的两个或更多个制剂合并。
18.附图简述
19.图1示出了通过将mef(图1a)和imr90细胞(图1b)用不同浓度的胞外囊泡(ev)处理而获得的衰老降低，所述胞外囊泡(ev)来源于从70岁供体获得并且从第6代(hlsc2(p6))获取的人肝干细胞。对照是未经处理的细胞。通过基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定来测量衰老。
20.图2示出了通过将mef(图1a)和imr90细胞(图1b)用不同浓度的胞外囊泡(ev)处理而获得的衰老降低，所述胞外囊泡(ev)来源于从15岁供体获得并且从第4代(hlsc6b(p4))获取的人肝干细胞。对照是未经处理的细胞。通过基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定来测量衰老。
21.图3示出了通过将mef用更低浓度的图2的胞外囊泡(ev)处理而获得的衰老降低。对照是未经处理的细胞。通过基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定来测量衰老。
22.图4是通过基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定针对mef测试的从第5代中获取的人脐带msc来源ev与hlsc6b来源ev的衰老降低活性之间的比较。
23.图5示出了通过将mef用不同浓度的在第4代和第10代获取的hlsc2来源ev和hlsc6b来源ev处理而获得的衰老降低。通过基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定来测量衰老。
24.发明详述
25.本发明基于以下发现：来源于人肝干细胞的胞外囊泡能够降低细胞衰老，而与供体年龄和获得它们的细胞代数无关。与wo 2017/189842的教导相比，这是出人意料的发现，所述wo 2017/189842公开了来自年轻而非衰老干细胞的条件培养基可以在成纤维细胞和衰老干细胞中逆转衰老。此外，wo 2017/189842提及了间充质干细胞作为ev来源，而本发明人发现与来源于间充质干细胞(msc)的胞外囊泡相比，来源于人肝干细胞的ev在降低细胞衰老方面是更加有效的。
26.使用胞外囊泡作为抗衰老药物的一个优点来源于胞外囊泡是天然产物的事实。另外，如实施例所示，人肝干细胞易于分离并且胞外囊泡也易于从分离的人肝干细胞中纯化。已显示胞外囊泡优先靶向受损的衰老细胞，这使它们成为用于降低细胞衰老和治疗由细胞损伤和衰老引起的疾病和病症的特别有效的工具。
27.在hayflick，l.&moorhead，p.s.the serial cultivation of human diploid cell strains.exp cell res.25585-621，(1961)中首次描述了细胞衰老。尽管存在营养物
质、生长因子并且没有接触抑制，但衰老细胞不会增殖，但仍具有代谢活性。这种现象被称为“复制性衰老”并且主要归因于端粒变短。进一步的研究表明，衰老也可以由其他刺激诱导，例如致癌应激(oncogenic stress)、dna损伤、细胞毒性药物和辐照。在某些情况下，细胞衰老可以是有益的，因为其用作肿瘤抑制因子。然而，由于细胞损伤的积累，衰老随着年龄增长而提高。衰老细胞分泌细胞因子、金属蛋白酶和生长因子，这构成了所谓的衰老相关分泌表型(sasp)。细胞衰老和sasp的这种年龄依赖性提高促进组织稳态降低和衰老。另外，衰老负担的年龄依赖性提高可能是许多年龄相关疾病和病症的原因。
28.细胞衰老与许多疾病和病症之间的关系是现有技术中已知的。已知的衰老相关疾病和病症包括例如动脉粥样硬化、2型糖尿病、衰弱、毛发变白(hair graying)、皮肤老化、肌少症、年龄相关肥胖、纤维化并且特别是肺纤维化、青光眼、白内障、糖尿病胰腺、骨关节炎、退行性椎间盘、癌症、肺动脉高压、年龄相关心血管疾病、年龄相关神经变性、年龄相关认知损害、阿尔茨海默病(alzheimer
′
s disease)、帕金森病(parkinson
′
s disease)、黄斑变性、慢性阻塞性肺病症、肺气肿、胰岛素不敏感(尤其参见he s，sharpless ne.senescence in health and disease.cell.2017；169(6)：1000-1011；campisi j.aging，cellular senescence，and cancer.annu rev physiol.2012；75：685-705；childs bg，durik m，baker dj，van deursen jm.cellular senescence in aging and age-related disease：from mechanisms to therapy.nat med.2015；21(12)：1424-1435；jeck wr，siebold ap，sharpless ne.review：a meta-analysis of gwas and age-associated diseases.aging cell.2012；11(5)：727-731；-espin，d.和serrano，m.cellular senescence：from physiology to pathology.nat.rev.mol.cell biol.2014；15：482-496；van deursen jm.the role of senescent cells in ageing.nature.2014；509(7501)：439-446)。
29.因此，来源于人肝干细胞的胞外囊泡特别地适合于用于降低细胞衰老和治疗上述衰老相关疾病和病症。
30.在本发明的背景中用作ev来源的特别优选的肝干细胞类型是表达肝细胞标志物的非卵圆人肝多能祖细胞系，其在国际专利申请wo2006/126236中描述。国际专利申请wo2006/126236还公开了分离上述非卵圆人肝多能祖细胞系的方法。wo2006/126236的人非卵圆人肝多能祖细胞系(在本说明书中称为hlsc)和用于制备hlsc的方法通过引用并入本文。
31.在一个优选实施方案中，非卵圆人肝多能祖细胞系能够分化为成熟肝细胞、胰岛素产生细胞、成骨性细胞和上皮细胞。在另一个优选实施方案中，非卵圆人肝多能祖细胞系表达肝细胞标志物白蛋白和干细胞标志物cd44、cd73和cd90，并且不表达细胞标志物cd117、cd34和cd45。
32.除了干细胞来源类型之外，患者的年龄和一般健康状况也影响ev制剂降低细胞衰老的能力。虽然表明从70岁患者获取的ev仍然有效，但来源于来自更年轻患者的干细胞的ev与更高的效力相关。优选地，ev从来自多至25岁的患者的干细胞来源获得。
33.此外，ev所源自的干细胞的更高数目的培养传代降低了ev制剂降低细胞衰老的能力。虽然从第10代hlsc培养物中获取的ev制剂仍显示出显著的衰老降低活性，但优选从少于10代的hlsc培养物中获取的ev制剂。
34.许多标志物可用于测量细胞衰老，但用于检测衰老细胞的当前标准是在ph 6下特定β-半乳糖苷酶酶活性的量度(dimri gp，lee xh，basile g，acosta m，scott c，roskelley c et al.a biomarker that identifies senescent human-cells in culture and in aging skin in-vivo.proc natl acad sci usa 1995；92：9363-9367)。有利地，sa-β-gal是所有类型衰老细胞的公认标志物，由此sa-β-gal测定可用于评估任何类型细胞的衰老。
35.根据一般的基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定，将待测定的细胞样品在培养基中孵育，然后使其与dna嵌入染料(例如hoechst染料)接触。然后通过常规方法来量化sa-β-gal阳性细胞，例如通过scmos相机检测技术。
36.如前所述，基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定可以用不同的细胞类型进行。用于进行sa-β-gal细胞衰老测定的公认细胞类型是具有依托泊苷(etoposide)诱导的衰老的人imr90成纤维细胞和具有氧化应激诱导的衰老的原代ercc1-/-鼠胚胎成纤维细胞(murine embryonic fibroblast，mef)，二者均描述于fuhrmann-stroissnigg，h.et al.identification of hsp90 inhibitors as a novel class of senolytics.nat commun.8(1)，422，(2017)中。
37.在使用上述类型的基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定进行的实验性研究中，本发明人发现，与脐带msc来源ev相比，来源于人肝干细胞的ev在降低细胞衰老方面是特别有效的。为此目的特别优选的ev是来源于表达肝细胞标志物的非卵圆人肝多能祖细胞系的ev，所述细胞系公开于wo2006/126236中。
38.此外，通过使用上述类型的基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定，本发明人获得了具有特别强有力的衰老降低活性的来源于人肝干细胞的ev制剂。事实上，本发明人发现，这样的ev制剂当以2.5
×
107ev/ml的浓度使用时能够将衰老细胞群的衰老降低约10％。在约2
×
108ev/ml的剂量下，本发明的制剂显示出将衰老降低约40％。
39.基于来源于人肝干细胞的ev制剂的强衰老降低活性，根据本发明的浓度为2
×
108ev/ml的ev制剂显示将受试衰老细胞群的衰老降低至少10％，其中衰老在基于sa-β-半乳糖苷酶的细胞衰老测定中使用未用ev处理的受试衰老细胞作为对照来测量。在一个优选实施方案中，浓度为2
×
108ev/ml的ev制剂显示将衰老降低至少25％，更优选40％。在另一个实施方案中，较低浓度的2.5
×
107ev/ml的制剂显示将衰老降低至少7％，更优选10％。
40.令人感兴趣的，即使当胞外囊泡来源于老年供体(即70岁)或当胞外囊泡从保持在培养物中较长时间段(例如多至第10代)的细胞中纯化，本发明ev制剂的衰老降低活性仍存在，尽管强度降低。
实施例
41.人肝干细胞(human liver stem cell，hlsc)的分离
42.hlsc从人冷冻保存的正常成人肝细胞(lonza，base，switzerland)中如前所述(herrera sanchez mb，bruno s，grange c，tapparo m，cantaluppi v，tetta c，et al.human liver stem cells and derived extracellular vesicles improve recovery in a murine model of acute kidney injury.stem cell res ther(2014)5(6)：124)进行分离。
43.简言之，将hlsc6b和hlsc2在补充有以下的α-最低必需培养基(lonza，basel，switzerland)中培养：l-谷氨酰胺(5mm)、青霉素(50iu/ml)、链霉素(50μg/ml)(均来自sigma，st.louis，mo，usa)、10％胎牛血清(fetal calf serum，fcs)(invitrogen，carlsbad，ca，usa)和人重组表皮生长因子(human recombinant epidermal growth factor，rhegf)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bfgf)(二者均为4ng/ml)。如前所述将细胞扩增、表征和冷冻保存。在胞外囊泡(ev)分离之前两天，将hlsc在其中fcs被ev耗竭的fcs替代以避免血清ev污染的培养基中培养。
44.胞外囊泡(ev)的分离
45.从在无血清roswell park memorial institute培养基(rpmi)(euroclone s.p.a，italy)中培养18小时的hlsc6b和hlsc2(2
×
106个细胞/t75瓶)的上清液中获得胞外囊泡(ev)。上清液收集时细胞的生存力为98％，如通过台盼蓝(trypan blue)排除所确定的。简言之，将上清液在4℃下以3,000g离心15分钟以去除细胞碎片和凋亡小体，随后在4℃下以100,000g超速离心2小时(beckman coulter optima l-90k，fullerton，ca，usa)。将获得的ev沉淀重悬在补充有1％二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，dmso)的rpmi中，并在-80℃下储存直至使用(herrera sanchez mb，previdi s，bruno s，fonsato v，deregibus mc，kholia s，et al.extracellular vesicles from human liver stem cells restore argininosuccinate synthase deficiency.stem cell res ther(2017)8(1)：176)。
46.mef测定
47.如fuhrmann-stroissnigg，h.et al.identification of hsp90 inhibitors as a novel class of senolytics.nat commun.8(1)，422，(2017)中所公开来分离erccl-/-mef。mef测定基本上如同一文章中所公开的那样进行。简言之，在处理之前至少6小时，在96孔板中每孔接种20％o2下的mef(5
×
103)。在添加ev之后，将mef在20％o2氧条件下孵育24至48小时。对于sa-β-gal活性的荧光分析，将细胞用pbs洗涤1次，将c12fdg(10μm)添加至培养基，并且将细胞孵育1.5至2小时。在分析之前10分钟，向细胞添加dna嵌入hoechst染料(2μg/ml)。对于细胞数(hoechst染色)和c12fdg阳性衰老细胞数的定量分析，使用了具有大视野scmos相机检测技术的基于激光的线扫描共焦成像仪in cell analyzer 6000。使用acquisition软件v4.5建立了采集方案，包括参数例如成像的板和孔、波长和曝光时间。使用多目标分析模块对获取的图像进行分析，所述多目标分析模块允许创建多种决策树并将适当的分类过滤器应用于不同的图像栈。所有样品均以一式两份3至5个视野/孔进行分析，并相应地计算平均值和标准偏差。
48.imr90肺成纤维细胞
49.人imr90肺成纤维细胞从美国典型培养物保藏中心(american type culture collection，atcc)获得，并将其在含有10％fbs和pen/strep抗生素的emem培养基中培养。为了诱导衰老，将细胞用20μm依托泊苷处理24小时。在依托泊苷去除之后两天，约70％的imr90细胞测试到sa-β-gal阳性。将细胞用100nm 17-dmag处理48小时，并使用基于c12fdg的衰老测定来确定sa-β-gal阳性细胞的百分比。该测定公开于fuhrmann-stroissnigg，h.et al.identification of hsp90 inhibitors as a novel class of senolytics.nat commun.8(1)，422，(2017)中。
50.结果
51.上述实验性研究用来源于从15岁供体获得的人肝干细胞(hlsc6b)的胞外囊泡和来源于从70岁供体获得的人肝干细胞(hlsc2)的胞外囊泡进行。
52.实验数据表明，hlsc6b来源ev和hlsc2来源ev二者均能够以可重现的方式降低衰老imr90和mef细胞的百分比(见图1a、b、图2a、b)。图3示出了hlsc6b来源ev的衰老降低活性在2.5
×
107ev/ml的低浓度下已经很明显。
53.在mif和imr90测定二者中，hlsc6b来源ev在降低成纤维细胞细胞衰老方面比hlsc2来源ev更有效，但两种类型的hlsc来源ev在任何情况下都比脐带msc来源ev更有效(见图a、b和图1a、b)。
54.此外，实验表明，尽管hlsc来源ev抑制衰老的能力随着传代而减弱，但在hlsc6b来源ev的情况下和在hlsc2来源ev的情况下，这种能力在第15代时仍然观察得到并且在第10代时是统计学上显著的(见图5)。
55.在图中，“细胞数”表示对照细胞(即未用ev处理)的所测量的衰老水平，其归一化为1。